陶 麗， 錢詩睿， 蘇 華△

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院 1腎內(nèi)科 2心血管外科，武漢 430022

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種慢性自身免疫性疾病，可累及多器官、多組織，大約50%的患者會累及腎臟，發(fā)展成為狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)[1]。LN發(fā)病機制復雜，臨床表現(xiàn)多樣，主要為血尿、蛋白尿、腎功能損傷、急進性腎功能衰竭等[2]。LN患者預后不同，盡管抗炎和免疫抑制療法有一定的效果，但仍有約10%的LN患者會發(fā)展為終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)，是SLE總體發(fā)病率和死亡率的主要危險因素[3]。目前，由于缺乏對分子機制的了解，針對SLE的特異性靶向治療的發(fā)展緩慢。闡明LN的發(fā)病機制對于促進靶向治療研究，進一步改善SLE患者預后，降低病死率具有重要意義。

在基因組水平監(jiān)測LN的生物學變化是一種很有意義的研究方法。近年來，生物信息學分析已經(jīng)應用于多種疾病中，可以在極短時間內(nèi)處理大量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并提供相關疾病的有價值信息。分析腎臟組織的基因表達，評估哪些基因?qū)N更有意義，有助于尋找有效的生物標志物。此外，功能富集分析研究可加深我們對LN的理解。因此，本研究通過生物信息學分析來確定與LN發(fā)生發(fā)展相關的差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)，為進一步探究LN的致病分子機制提供基礎。

1 資料與方法

1.1 研究資料的獲取

在美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的高通量基因表達(Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中檢索得到LN人群研究數(shù)據(jù)集GSE127797和GSE32591。GSE127797是基于GPL24299構建的芯片，包含LN腎組織(54例)基因表達譜。GSE32591是基于GPL14663構建的芯片，包括正常腎組織(29例)和LN腎組織(64例)基因表達譜。

1.2 DEGs的數(shù)據(jù)處理

1.2.1 數(shù)據(jù)預處理 通過GEOquery包(2.56.0版本)下載數(shù)據(jù)集GSE127797和GSE32591的原始數(shù)據(jù)，并加載至RStudio(4.0.2版本)軟件中。讀取各自GPL的探針轉(zhuǎn)換表格，將數(shù)據(jù)集的ENTREZ ID轉(zhuǎn)換為SYMBOL ID。過濾SYMBOL ID對應多個ENTREZ ID的基因并取表達量的平均值；將數(shù)據(jù)集的腎小球數(shù)據(jù)和腎小管數(shù)據(jù)分開，分別用limma包(3.44.3版本)進行中位數(shù)法標準化，以消除非實驗誤差，使各樣本間具有可比性。

1.2.2 質(zhì)量評估 分別合并2個數(shù)據(jù)集的腎小球數(shù)據(jù)和腎小管數(shù)據(jù)，用R語言的limma包(3.44.3版本)進行批次校正，降低2個數(shù)據(jù)集因不同實驗室、實驗批次等原因造成的非實驗性誤差，使2個數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)具有可比性，并再次用中位數(shù)法進行標準化；分別對腎小球和腎小管數(shù)據(jù)使用ggfortify包(0.4.10版本)進行主成分分析(principal components analysis，PCA)和使用cluster包(2.1.0版本)進行hclust聚類分析。

1.2.3 DEGs選取 用R語言中的limma包(3.44.3版本)進行差異分析，以|log2FoldChange|>1、P值<0.05為截斷值挑選DEGs，使用ggplot2包(3.3.2版本)做火山圖進行可視化；以|log2FoldChange|>1.5、P值<0.05為截斷值挑選DEGs，使用pheatmap包(1.0.12版本)做熱圖進行可視化。根據(jù)log2FoldChange值排序，分別取上調(diào)的前250個基因和下調(diào)的前150個基因作為腎小球數(shù)據(jù)和腎小管數(shù)據(jù)的DEGs，取腎小球數(shù)據(jù)和腎小管數(shù)據(jù)交集后的共同DEGs。使用VennDiagram包(1.6.20版本)繪制韋恩圖。

1.3 功能富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對篩選出的共同DEGs進行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。用R軟件的clusterProfiler包(3.16.1版本)和org.Hs.eg.db包(3.11.4版本)處理數(shù)據(jù)。對共同DEGs進行GO功能富集分析，主要富集在生物學過程(biological process，BP)、細胞組成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)這3個模塊中。利用R軟件中的GOplot包(1.0.2版本)使GO富集結果可視化。對共同DEGs進行KEGG通路富集分析，使用R語言ggplot2包(3.3.2版本)繪制氣泡圖。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.4 建立蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡和挑選關鍵DEGs

將DEGs的基因名上傳到STRING網(wǎng)站(https：//string-db.org/)，設置minimum required interaction score=0.4，然后將計算結果導入Cytoscape(3.8.0版本)中，構建LN的DEGs蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡。使用Cytoscape軟件中的MCODE插件，設置degree cutoff=2，node score cutoff=0.2，k-core=2，max.depth=100，篩選出PPI網(wǎng)絡中生物聯(lián)系最為緊密的子網(wǎng)絡。使用Cytoscape軟件中的Cytohubba插件，采用Degree算法篩選出PPI網(wǎng)絡中連結度最高的前20個關鍵DEGs，顏色越紅表示得分越高。最后，得分前10且存在于子網(wǎng)絡中的基因即為最終篩選出的與LN生物學行為密切相關的關鍵DEGs。

2 結果

2.1 DEGs的選取

基于R語言對數(shù)據(jù)集GSE127797和GSE32591進行數(shù)據(jù)的標準化及批次校正處理后(圖1)，各樣本中位數(shù)基本在一條水平線上，說明樣本間歸一化程度好。之后分別對腎小球和腎小管數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，繪制出PCA和hclust聚類分析圖(圖2)。PCA圖腎小球和腎小管的實驗組和對照組數(shù)據(jù)呈離散分布，綜合hclust聚類分析圖結果，表明實驗組與對照組數(shù)據(jù)具有很好的區(qū)分度。根據(jù)|log2FoldChange|和P值對腎小管和腎小球數(shù)據(jù)進行初步篩選DEGs后的火山圖和熱圖見圖3A～3D。腎小球組共篩選出400個(上調(diào)250個+下調(diào)150個)DEGs，腎小管組共篩選出400個(上調(diào)250個+下調(diào)150個)DEGs。用韋恩圖篩選出這2組數(shù)據(jù)的共同DEGs，共114個，包含64個上調(diào)基因和50個下調(diào)基因(圖3E)。分別挑取共同DEGs數(shù)據(jù)集中上調(diào)和下調(diào)的前10位基因展示，見表1。

A：GSE127797腎小球數(shù)據(jù)標準化；B：GSE32591腎小球數(shù)據(jù)標準化；C：GSE127797腎小管數(shù)據(jù)標準化；D：GSE32591腎小管數(shù)據(jù)標準化；E：GSE127797和GSE32591腎小球數(shù)據(jù)合并，進行批次校正及標準化；F：GSE127797和GSE32591腎小管數(shù)據(jù)合并，進行批次校正及標準化圖1 數(shù)據(jù)預處理Fig.1 Data preprocessing

A：腎小球數(shù)據(jù)PCA圖；B：腎小管數(shù)據(jù)PCA圖；C：腎小球數(shù)據(jù)hclust圖；D：腎小管數(shù)據(jù)hclust圖圖2 數(shù)據(jù)質(zhì)量評估Fig.2 Data quality assessment

A：腎小球數(shù)據(jù)火山圖；B：腎小管數(shù)據(jù)火山圖；C：腎小球數(shù)據(jù)熱圖；D：腎小管數(shù)據(jù)熱圖；E：共同DEGs的韋恩圖圖3 選取DEGsFig.3 DEGs selection

表1 前10個顯著上調(diào)或下調(diào)DEGsTable 1 The top 10 significantly upregulated or downregulated DEGs

2.2 GO富集分析和KEGG信號通路分析結果

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對共同DEGs進行GO和KEGG分析(圖4)。GO富集分析以人源基因為背景，對共同DEGs進行生物學功能注釋。結果顯示，BP模塊中，共同DEGs主要參與病毒防御反應、Ⅰ型干擾素(type Ⅰ interferon，IFN-Ⅰ)信號通路、病毒基因組復制的調(diào)控等生物通路；CC模塊中，共同DEGs參與的細胞組分包括膠原蛋白三聚物、血小板α顆粒、胞質(zhì)囊腔、細胞器外膜等；MF模塊中，共同DEGs主要與血小板衍生生長因子結合、細胞外基質(zhì)結構成分、生長因子結合相關。利用KEGG通路數(shù)據(jù)庫進行信號通路的富集，尋找共同DEGs所富集的信號通路。結果表明，共同DEGs與甲型流感病毒感染、麻疹病毒感染、丙型肝炎病毒感染、百日咳桿菌感染、補體和凝血級聯(lián)、蛋白質(zhì)消化吸收、金黃色葡萄球菌感染等通路有關。

A：GO功能富集分析；B：KEGG通路富集分析圖4 共同DEGs的GO和KEGG分析Fig.4 GO and KEGG analysis of common DEGs

2.3 PPI網(wǎng)絡的構建及關鍵DEGs的篩選

將上述篩選得到的114個共同DEGs導入STRING數(shù)據(jù)庫并利用Cytoscape軟件構建共同DEGs之間的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，得到PPI網(wǎng)絡圖(圖5A)。PPI網(wǎng)絡圖中每個節(jié)點代表由1個蛋白質(zhì)編碼基因位點產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)，節(jié)點內(nèi)為該蛋白質(zhì)的三維結構。兩節(jié)點間的連線代表蛋白質(zhì)的相互聯(lián)系，不同顏色代表不同的生物學意義。使用Cytoscape軟件中的MCODE插件篩選出PPI網(wǎng)絡圖中生物聯(lián)系最為緊密的子網(wǎng)絡(圖5B)。同時使用Cytoscape軟件中的Cytohubba插件對PPI網(wǎng)絡圖中每個節(jié)點的鄰接數(shù)進行計算，篩選出得分前20的關鍵DEGs(圖5C)。

A：PPI網(wǎng)絡圖；B：PPI網(wǎng)絡圖中生物聯(lián)系最為緊密的子網(wǎng)絡圖；C：得分前20的關鍵DEGs；D：前10位的關鍵DEGs蛋白互作網(wǎng)圖5 建立PPI網(wǎng)絡圖和挑選關鍵DEGsFig.5 Construction of PPI network map and selection of key DEGs

最后，得分前10且存在于子網(wǎng)絡中的關鍵DEGs(圖5D和表2)：ISG15、MX1、OAS1、MX2、IFIH1、GBP1、IFIT3、OAS2、IFIT1、IFI44，即為最終篩選出的與LN生物學行為密切相關的關鍵DEGs，顏色越紅表示得分越高。

表2 10個關鍵DEGs及其功能Table 2 The 10 key DEGs and their functions

3 討論

SLE的確切病因尚未完全闡明，目前認為基因、環(huán)境因素刺激(如感染、藥物、紫外線、飲食等)及表觀遺傳修飾異常等均與SLE發(fā)病有關[4]。SLE呈現(xiàn)廣泛的臨床和免疫學表現(xiàn)，其中LN是導致患者致殘和死亡的最常見原因。LN的發(fā)病機制涉及多種致病途徑，包括異常的細胞凋亡、自身抗體產(chǎn)生，免疫復合物沉積和補體激活[5]；并且不同的病理機制可相互作用，最終導致腎臟受損。

本文通過對GEO數(shù)據(jù)庫中正常腎組織和LN腎組織的基因芯片數(shù)據(jù)集進行差異分析與GO富集分析發(fā)現(xiàn)，LN腎小球與腎小管共同DEGs主要參與病毒防御反應及IFN-Ⅰ信號通路等；KEGG分析結果表明，共同DEGs與甲型流感病毒感染、麻疹病毒感染等通路有關。

病毒感染和自身免疫性疾病的因果聯(lián)系已經(jīng)在大量臨床研究中得到了驗證：在5種常見的人類病毒(甲型流感病毒、博爾納病病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒和風疹病毒)和人類蛋白質(zhì)組之間出現(xiàn)了大量的肽段重疊，這種序列相似性或許可以解釋病毒感染或免疫應答過程中的自身免疫交叉反應[6]。多項研究證實感染性因素可誘導及促進SLE的進展，SLE與病毒感染存在如下可能的關聯(lián)[7]：①SLE可以發(fā)生在慢性病毒感染期間；②SLE的發(fā)病可能與病毒感染同時發(fā)生；③特定的病毒感染可以觸發(fā)SLE。如，Epstein-Barr(EB)病毒、細小病毒B19和人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒參與SLE的發(fā)病過程；除此之外，甲型流感、麻疹、丙肝病毒等也可能與SLE的發(fā)病有關。韓國最近的一項研究表明，季節(jié)性流感爆發(fā)與SLE發(fā)病之間存在顯著相關性[8]。

干擾素(interferon，IFN)是重要的免疫系統(tǒng)介質(zhì)，可通過調(diào)控樹突狀細胞、淋巴細胞、自然殺傷細胞以及單核巨噬細胞啟動免疫反應與放大組織損傷。IFN-Ⅰ包括IFNα，IFNβ，IFNτ，IFNω和IFNκ，它們在天然免疫和病毒防御中發(fā)揮重要作用，亦是SLE發(fā)生和發(fā)展的核心因素。Ⅱ型IFN以IFNγ為代表，是適應性免疫反應效應機制的關鍵因子。SLE患者體內(nèi)表達上調(diào)的細胞游離核酸(DNA/RNA)，尤其是雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)，是SLE和LN發(fā)病機制中的關鍵物質(zhì)；另外，細胞游離DNA/RNA是IFN-Ⅰ最有效的誘導因子，故IFN-Ⅰ是LN發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)。除循環(huán)免疫細胞外，腎臟固有細胞亦是IFN-Ⅰ的主要來源，如DNA/RNA免疫復合物誘導足細胞產(chǎn)生IFN-β[9]。綜上所述，GO分析和KEGG分析提示的結果與既往研究報道相符合，并且進一步加深了我們對LN發(fā)病機制的理解。

通過構建PPI網(wǎng)絡圖并進行算法分析和篩選，最終獲得10個最重要的DEGs：ISG15、MX1、OAS1、MX2、IFIH1、GBP1、IFIT3、OAS2、IFIT1、IFI44，這10個DEGs均受IFN的調(diào)控。

ISG15屬于干擾素誘導基因(interferon-inducible gene，IFIG)，Carrillo-Vázquez等[10]研究發(fā)現(xiàn)，相比于健康對照組，SLE患者中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NETs)中ISG15的表達升高，且SLE患者NETs刺激外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)產(chǎn)生IFNγ的能力明顯增強。此外，SLE患者血液中ISG15 mRNA水平更高，且與治療前SLE的活動相關；ISG15的表達水平亦與SLE患者體內(nèi)淋巴細胞的減少有關，提示ISGl5可能參與淋巴細胞的凋亡[11]。Han等[12]研究發(fā)現(xiàn)SLE患者的EB病毒感染率較高，EB病毒的潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)的表達較高，并且ISG15與LMP1的表達呈正相關，提示EB病毒的LMP1可能通過激活IFN-Ⅰ途徑參與SLE的發(fā)生和發(fā)展。使用JAK抑制劑托法替尼(tofacitinib，TOFA)通過JAK-STAT途徑控制IFN的信號傳導可降低NZB/NZW F1小鼠血清中抗dsDNA抗體水平，減少蛋白尿并改善腎炎；且給予TOFA和地塞米松(dexamethasone，DEXA)處理后，SLE易感小鼠CD4+T細胞中ISG15的表達降低[13]。靶向IFN信號傳導或許可用于開發(fā)新的SLE特異性治療策略。還有研究發(fā)現(xiàn)，姥鮫烷誘導的狼瘡小鼠ISG15的表達上調(diào)；姥鮫烷誘導的miR155缺陷型狼瘡小鼠的血清自身抗體水平下降、腎臟損傷程度減輕且ISGl5表達減少[14]。上述研究均提示ISG15與LN的發(fā)病相關。

MX1是一種IFIG。Shimizu等[15]使用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)發(fā)現(xiàn)，與IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)患者、ANCA相關血管炎(ANCA-associated vasculitis，AAV)患者和健康對照者相比，SLE患者外周血中的MX1蛋白濃度顯著升高。使用免疫組織化學方法發(fā)現(xiàn)，相比于IgAN和AAV腎標本，LN的腎小球和腎小管組織中MX1陽性區(qū)域顯著增多。與未經(jīng)免疫抑制劑治療的患者相比，經(jīng)免疫抑制劑治療的LN患者腎組織MX1蛋白水平較低。人類MX2是IFN誘導的GTPase超家族的成員。MX2基因編碼的蛋白具有細胞核和細胞質(zhì)形式，其中MX2核蛋白以顆粒狀分布于核膜下的異染色質(zhì)區(qū)，可抑制許多RNA和DNA病毒的初期復制。MX2最接近的家族成員是人類MX1(63%氨基酸序列相同)[16]，因此MX2亦可能與LN的發(fā)病相關。

OAS1和OAS2受IFN調(diào)控，屬于2′-5′-寡腺苷酸合成酶家族成員且均位于12號染色體上。OAS1和OAS2是OAS不同亞型，是機體對病毒感染的固有免疫反應中的必需蛋白。OAS家族蛋白的抗病毒活性主要歸因于合成2′-5′-寡腺苷酸的能力，并激活潛在的RNase L導致蛋白質(zhì)合成受到抑制[17]。Ye等[18]研究發(fā)現(xiàn)狼瘡活動患者中OAS1和OAS2的mRNA表達高于感染患者和正常對照組。Landolt-Marticorena等[19]的研究顯示SLE患者外周血中OAS1和B細胞活化因子(B cell activation factor，BAFF)表達升高，且兩者之間存在相關性。與對照組比較，SLE患者外周血中的B細胞異常增生，提示OAS1的高表達可能與B細胞的異常增生有關。

IFIH1是一種IFIG，可以編碼黑色素瘤分化相關基因5(melanoma differentiation associated gene 5，MDA5)。MDA5參與病毒感染后干擾素應答調(diào)節(jié)的過程。Su等[20]發(fā)現(xiàn)SLE患者的疾病活動性與PBMC中MDA5的水平呈負相關。Munroe等[21]對SLE患者血液中IFIH1與炎癥介質(zhì)、自身抗體的相關性進行了評估，發(fā)現(xiàn)IFIH1基因與炎性介質(zhì)白介素-6(interleukin-6，IL-6)、干擾素誘導蛋白10(interferon-induced protein 10，IP-10)及自身抗體的表達密切相關，表明IFIH1可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應參與SLE發(fā)病。此外，IFIH1 G821S錯義突變的小鼠可出現(xiàn)狼瘡樣癥狀，研究者在這些小鼠血清中檢測到抗核抗體和抗dsDNA抗體的表達，同時在腎臟組織中觀察到免疫球蛋白和補體的沉積；腎臟中包括IFNβ、IL-6和趨化因子配體10(CXC chemokine ligand 10，CXCL10)在內(nèi)的炎性細胞因子和趨化因子顯著上調(diào)，IFNβ和IL-6則在全身器官中表達上調(diào)；錯義突變的IFIH1可能通過激活IFN-Ⅰ途徑觸發(fā)機體的自身免疫反應[22]。上述研究表明，IFIH1可能參與LN的腎臟損害。

GBP1是一種干擾素刺激基因(interferon-stimulated gene，ISG)。IFN刺激，尤其是IFNγ刺激，會促進該基因的過度表達[23]。在許多類型的細胞，如內(nèi)皮細胞和單核細胞中，GBP1的表達受到IFNγ的強烈刺激，并且GBP1在炎癥環(huán)境中抑制細胞增殖。在免疫應答中，GBP1的活性對于細胞內(nèi)病原體感染的自噬體的成熟和細胞對病原體相關分子模式的反應至關重要[24]?；贕BP1已知的生物學功能，GBP1是否參與LN的致病過程值得我們進一步探索。

IFIT1、IFIT3都是IFIG，屬于干擾素誘導的四肽重復蛋白家族。Landolt-Marticorena等[25]發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，SLE患者外周血的IFIT1表達顯著上升，并與疾病的高度活動性相關。Hu等[26]使用MRL/lpr狼瘡小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)IFIT1的表達與MRL/lpr小鼠腎組織中F-actin、Nephrin和Podocin3種足細胞蛋白的表達呈負相關；隨著IFIT1表達的增加，MRL/lpr狼瘡小鼠腎組織中足細胞大量丟失；上調(diào)IFIT1的表達促進足細胞損傷，加重LN腎損傷。Wang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組比較，IFIT3在SLE患者PBMC中表達明顯升高，且與cGAS/STING信號通路的活性呈正相關；提示IFIT3可作為一種新的治療靶點，用于阻斷SLE患者通過cGAS/STING信號通路產(chǎn)生IFN-Ⅰ和其他促炎細胞因子。

IFI44是一種IFIG。有研究表明在SLE患者的PBMC中IFI44的表達顯著增高，并且IFNα優(yōu)先于IFNγ誘導IFI44的表達，這提示IFI44參與IFN-Ⅰ信號通路介導的SLE的致病過程[28]。Shen等[29]最近的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照相比，LN患者血清中IFI44顯著上調(diào)。此外，活動性LN患者血清中的IFI44顯著高于非活動性LN患者。

綜上所述，本研究采用生物信息學分析方法挖掘了與LN相關的DEGs，并經(jīng)GO富集分析和KEGG通路分析顯示病毒防御反應、IFN-Ⅰ信號通路、病毒基因組復制的調(diào)控等生物學過程可能參與LN的發(fā)病。此外，通過構建PPI網(wǎng)絡并利用算法分析獲得10個關鍵DEGs，這10個DEGs都受到IFN的調(diào)控；其中ISG15、MX1、OAS1、IFIH1、IFIT3、OAS2、IFIT1、IFI44等基因在LN中有少量研究，但它們參與LN的具體致病機制尚未闡明；MX2、GBP1基因與LN的具體關系尚未見明確報道。本研究為進一步探究LN致病相關分子機制、發(fā)掘潛在治療靶點提供了新的理論依據(jù)與方向。本研究的不足之處在于，我們未能通過實驗進一步驗證這些關鍵DEGs在LN發(fā)生發(fā)展過程中的表達變化及具體作用。因此，未來我們將通過后續(xù)的實驗研究來驗證這些關鍵DEGs的功能。