張秀森， 劉書培， 王海瑞， 原 翔

河南科技大學臨床醫(yī)學院，河南科技大學第一附屬醫(yī)院，河南科技大學腫瘤研究所，河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室，洛陽 471003

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一[1]，我國是食管鱗癌的高發(fā)國家。據(jù)一項不完全統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2018年全球食管癌新發(fā)病例數(shù)達57.2萬，其中5年生存率僅有30%左右[2]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis，Pg)是目前公認的慢性牙周疾病的主要致病菌，它能侵入宿主細胞并逃避宿主的防御機制[3]，促進口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展。由于食管與口腔解剖位置臨近，本團隊前期研究首次證實，Pg在食管癌患者腫瘤組織中檢出率高達42%[4]，且Pg陽性的食管癌患者血清中抗Pg抗體IgG和IgA的表達也高于食管炎患者和健康對照組[5]。研究表明，在食管癌中Pg感染與腫瘤驅(qū)動基因過度激活及免疫檢查點信號異常表達密切相關[6]，Pg還可通過TGF-β依賴的Smad/YAP/TAZ信號通路促進食管鱗狀細胞癌的進展[7]。此外，Pg攜帶的主要致病毒力因子，如鞭毛蛋白(fimbriae，F(xiàn)imA)在粘附、促進病原體入侵和感染中發(fā)揮著關鍵作用[8]。綜上可見，Pg和食管癌的發(fā)生密切相關，對其發(fā)病機制的深入探討可為食管癌的病因?qū)W研究和防治策略的制定提供更多科學依據(jù)。

xCT是溶質(zhì)運載蛋白7家族成員11(solute cartier family 7 member 11，SLC7A11)，是溶質(zhì)載體家族負責細胞膜上谷氨酸/胱氨酸逆向轉(zhuǎn)運的功能性基團[9]，可特異性地將胞外的胱氨酸和谷氨酸轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)，參與抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione，GSH)的合成，進而維持細胞內(nèi)外氧化還原平衡[10-11]。腫瘤細胞新陳代謝的改變，對其發(fā)生發(fā)展和治療耐藥性至關重要。研究表明，xCT在谷氨酰胺代謝中發(fā)揮了關鍵作用[12]，可促進腫瘤細胞對胞外谷氨酰胺的轉(zhuǎn)運，從而促進腫瘤[13-16]的進展，靶向xCT可誘導細胞凋亡[17]。然而，對于病原體如何通過xCT促進食管癌進展尚未見報道。本研究中，我們結(jié)合測序數(shù)據(jù)及應用分子生物學和細胞生物學手段，探討xCT作為Pg進入細胞的宿主因子，對其發(fā)病機制的深入探索可為食管癌的病因?qū)W研究和防治策略的制定提供更多科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞及質(zhì)粒 人食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)細胞株來自河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室。人胚腎HEK293T細胞株來自BNCC公司。質(zhì)粒均由廣州易錦生物技術(shù)有限公司和美國GeneCopoeia公司聯(lián)合開發(fā)提供。

1.1.2 實驗動物 普通C57小鼠為雄性，7～8周齡，購買于河南斯克貝斯生物科技股份有限公司。xCT基因敲除小鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)科大學免疫系統(tǒng)遺傳調(diào)控基因?qū)嶒炇?GRIS)在國家111工程項目(D20036)支持下構(gòu)建。實驗小鼠飼養(yǎng)于河南科技大學第一附屬醫(yī)院SPF級實驗動物中心，所有動物實驗根據(jù)機構(gòu)動物護理和使用委員會批準的方案進行。

1.1.3 主要試劑 人類全基因組敲除文庫(Human Genome-scale CRISPR Knock-Out v2.0 library，GeCKOv2 libraries)質(zhì)粒和慢病毒包裝購于美國Genewiz公司，NanoBiT?PPI MCS Starter Systems(N2014)購于美國Promega公司。FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑(E2311)購自美國Promega公司，xCT一抗(PA1-16893)，F(xiàn)lag抗體(MA1-91878)和Co-IP試劑盒(88804)購自美國Thermofisher公司。HA抗體(ab9108)，谷氨酰胺合成酶1(GLS1)抗體(ab156876)，還原型/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)試劑盒(ab138881)購自美國Abcam公司。Pg抗體(ANT0085)購于意大利Diatheva公司。Pg特異性探針(16S rRNA特異探針)與RNAscope?試劑盒(322360)購自美國ACD公司。引物定制設計由上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.1.4 主要儀器設備 Nikon TE2000倒置熒光顯微鏡、Promega Glomax 96微孔板發(fā)光檢測儀、Leica TP1020全自動組織脫水機、Bio-rad凝膠成像分析儀、ZEISS激光共聚焦顯微鏡。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將KYSE30、KYSE140、KYSE150細胞接種于含1%雙抗和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，HEK293T細胞接種于含1%雙抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1～2 d換液、傳代。胰酶消化，收集對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗，實驗均重復3次。轉(zhuǎn)染前1 d，將細胞接種于無抗生素含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，按照密度為1×106個細胞/孔接種于6孔板中。取對數(shù)生長期細胞，使用FuGENE?HD細胞轉(zhuǎn)染，10 h后更換培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24 h后，對細胞進行相應處理，收集細胞進行下一步分析。

1.2.2 GeCKOv2 libraries B庫篩選細胞 將細胞接種于6孔板，24 h長到70%匯合時，將包裹慢病毒的B庫質(zhì)粒以MOI=10，與適當比例的Lv-assistance轉(zhuǎn)染試劑混合，感染細胞。24 h后，更換培養(yǎng)液并加入嘌呤霉素，篩選獲得穩(wěn)定敲除的細胞株。對穩(wěn)定敲除細胞株感染Pg(MOI=10)，培養(yǎng)一段時間后，選取存活的細胞進行NGS測序并篩選出差異基因。

1.2.3 細胞活力測定實驗 將對數(shù)生長期的KYSE150細胞進行細胞計數(shù)，稀釋為5×103/mL接種于96孔板，添加100 μL培養(yǎng)液，1 d后感染包裹慢病毒的sgRNA，并設對照組，培養(yǎng)1 d后換液并加入嘌呤霉素篩選，2 d后加入MTS試劑，按照試劑盒使用說明書用酶標儀檢測吸光度(A)值，根據(jù)A值計算每組細胞存活率并對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。

1.2.4 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP) 收集實驗所需細胞加入適量細胞IP裂解緩沖液，4 ℃下裂解30 min，12000 r/min離心30 min后取上清；取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液將1 μg相應的抗體和10～50 μL protein A/G-beads加入到細胞裂解液，4 ℃緩慢搖晃孵育過夜；免疫沉淀反應后，在4 ℃下以3000 r/min速度離心5 min，將protein A/G-beads離心至管底；將上清小心吸去，protein A/G-beads用1 mL裂解緩沖液洗3～4次；最后加入15 μL的2×SDS加樣緩沖液，沸水煮10 min；Western blot檢測分析。

1.2.5 NanoBiT?活細胞實時蛋白相互作用實驗方法參見文獻[18]。將HEK293T細胞鋪到白色96孔板中，在轉(zhuǎn)染當天達到60%～80%的融合度。24 h后根據(jù)分組使用FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的N端或C端帶有SmBiT和LgBiT的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后30 h，以1∶20的稀釋倍數(shù)，將NanoBiT?活細胞底物稀釋加入細胞中。添加后2 h之內(nèi)在Glomax 96微孔板發(fā)光檢測儀上檢測發(fā)光強度。

1.2.6 Western blot檢測 收集相應細胞，加入配置好的裂解液，冰上裂解刮取，4 ℃離心，收集上清，提取蛋白質(zhì)。采用BCA法測定蛋白含量。用濃度為10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h。加入對應一抗，4 ℃下孵育過夜。以含吐溫的Tris緩沖液(Tris buffered saline Tween，TBST)清洗4次，加入二抗，室溫孵育2 h。以TBST漂洗5次，化學發(fā)光液顯影，進行圖像分析。

1.2.7 xCT基因敲除小鼠的培育 采用CRISPR/Cas9技術(shù)建立C57基因敲除小鼠。該技術(shù)為通過設計針對目的基因的guide RNA引導Cas9核酸酶對插入位置的基因組進行修飾，從而造成該基因修飾區(qū)域片段缺失，將目的位點的目的片段敲除。挑選xCT的外顯子exon1作為敲除位點，設計針對該外顯子的3條sgRNA，通過胚胎顯微注射法引導Cas9內(nèi)切酶裂解xCT基因。通過非同源末端鏈接修復斷裂，刪除xCT的外顯子exon1，使該基因的mRNA缺失堿基，產(chǎn)生移碼突變，得到F0代小鼠。通過提取鼠尾DNA行PCR檢測(圖1)，將F0代陽性小鼠自交得到F1代小鼠，再次PCR鑒定，培育目的基因缺失型純合子小鼠至6～8周齡用于實驗。

Line 1為xCT敲除陽性對照，KO：基因敲除；WT：野生型；NC：陰性對照圖1 小鼠基因型PCR檢測結(jié)果Fig.1 The PCR genotype results of mice

1.2.8 RNAscope?檢測方法 參見文獻[19]，將Pg灌胃后的小鼠安樂死后進行食管剝離，將分離的食管組織進行石蠟包埋，以2 μm的厚度進行連續(xù)切片；60 ℃烤片后二甲苯脫蠟。靶標修復試劑及RNAscope?雙氧水處理，加入RNAscope?蛋白酶Plus處理，進行RNAscope?顯色檢測(含Pg特異性探針[20]雜交)并掃描拍照。

1.2.9 還原型/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)檢測 收集107～108個細胞，按GSH/GSSG試劑盒說明書操作，最后用熒光微板閱讀器監(jiān)測Ex/Em=490/520 nm處的熒光，并進行分析。

1.2.10 qRT-PCR檢測 用Trizol提取小鼠食管組織，和ESCC對應分組細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，SYBR Green探針進行實時熒光定量PCR，反應體系詳見諾唯贊AceQ qPCR SYBR Green Master Mix說明書(Q111-03)。特定引物序列如下：小鼠GLS1上游引物：5′-CA-CTCAAATCTACAGGATTGCG-3′，下游引物：5′-CCAGACTGCTTTTTAGCACTTT-3′；人GLS1上游引物：5′-CACTCAAATCTACAGGATTGCG-3′，下游引物：5′-CCAGACTGCTTTTTAGCAC-TTT-3′。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用Graphpad7軟件作圖，SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 全基因組CRISPR篩選識別Pg感染所需的宿主受體分子

在食管鱗癌細胞KYSE150中用GeCKOv2 libraries B庫[21]轉(zhuǎn)染篩選，細胞在全基因組敲除后感染Pg能夠選擇性生存(圖2A)。通過NGS測序來識別存活的細胞群中存在的單導體RNA(sgRNA)。評估個體sgRNA豐度變化的顯著性，計算相同基因在感染Pg前后樣本中的reads數(shù)差值，對差值進行l(wèi)og轉(zhuǎn)換，以避免差數(shù)范圍過大。log2值為正即顯示該基因為陽性篩選基因，是細胞在特定條件下生存的必需基因。根據(jù)富集分析結(jié)果，篩選得到差異最顯著的5個基因，分別是xCT、ANPEP、ACE2、PI3KC3和TMEM41B(圖2B)，其中xCT參與調(diào)控谷氨酰胺代謝，將其敲除可能影響腫瘤細胞的增殖。我們將上述關鍵的5個基因進行進一步驗證，細胞活力百分比結(jié)果顯示(圖2C)，與對照組比較，xCT轉(zhuǎn)染xCT sgRNA(P<0.0001)、ANPEP sgRNA(P=0.0012)、ACE2 sgRNA(P=0.0009)、PI3KC3 sgRNA(P=0.0043)、TMEM41B sgRNA(P=0.0011)的細胞活力降低，差異有統(tǒng)計學意義，說明敲除這些基因均可顯著抑制細胞增殖活性。其中，轉(zhuǎn)染xCT sgRNA組差異最為顯著，由此推測，xCT可能作為食管癌細胞系中Pg感染的一個重要的宿主因子。

A：篩選流程圖；B：富集基因分布圖(每個圓圈代表一個基因，其大小對應于富集的顯著性；y軸表示與對照組比較，感染Pg樣本中sgRNA豐度，每個基因的4個sgRNA豐度的平均變化)；C：細胞活力結(jié)果統(tǒng)計圖，與對照組比較，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001圖2 全基因組CRISPR篩選識別Pg感染所需的宿主受體分子Fig.2 Genome-wide CRISPR screening to identify host receptor molecules required for Pg infection

2.2 受體分子xCT可與鞭毛蛋白FimA互作

2.2.1 Co-IP實驗證實xCT和FimA蛋白可相互結(jié)合 在HEK293T細胞中，用編碼HA標記的FimA cDNA的質(zhì)粒和編碼Flag標記的xCT cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，分別使用HA和Flag抗體與磁珠結(jié)合后，將蛋白與磁珠進行4 ℃過夜孵育，得到免疫沉淀復合物，用Western blot檢測免疫沉淀復合物中HA和Flag即FimA和xCT的表達情況，免疫沉淀結(jié)果顯示：外源性FimA能夠與外源性xCT形成復合物，而與空白對照未結(jié)合(圖3)，表明FimA與xCT能夠在細胞內(nèi)相互結(jié)合。

圖3 Co-IP實驗表明xCT和FimA蛋白相互結(jié)合Fig.3 Co-IP experiment shows the binding interaction between xCT and FimA

2.2.2 NanoBiT?實驗驗證xCT與FimA蛋白的互作 使用常規(guī)基因重組技術(shù)構(gòu)建編碼FimA基因并N端或C端帶有LgBiT或SmBiT標簽的質(zhì)粒和編碼xCT基因并N端或C端帶有LgBiT或SmBiT標簽的質(zhì)粒，將帶有LgBiT或SmBiT標簽的xCT或FimA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，根據(jù)不同時間檢測底物發(fā)光值，NanoBiT?實驗結(jié)果顯示(圖4A)，在20 min左右，xCT與FimA結(jié)合能力最強，根據(jù)120 min內(nèi)的熒光強度值進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示(圖4B)，SmBiT-FimA和xCT-LgBiT質(zhì)粒的結(jié)合后相對熒光單位(relative light unit，RLU)為(133.00 ± 2.08)，陰性對照RLU為(46.52 ± 0.64)(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義，說明FimA蛋白和xCT可發(fā)生互作。

A：不同分組隨時間變化的熒光值；B：相應分組120 min內(nèi)平均熒光值統(tǒng)計圖，與陰性對照組比較，***P<0.001圖4 NanoBiT?活細胞實時蛋白互作實驗證明xCT與FimA互作Fig.4 NanoBiT? cell real-time protein interaction experiment proves the interaction between xCT and FimA

2.2.3 免疫細胞熒光證明xCT與FimA互作 將感染Pg后的食管癌細胞固定，分別進行用FimA一抗與AF488綠色熒光二抗染色，用xCT一抗與AF555紅色熒光二抗染色，F(xiàn)imA一抗與AF488綠色熒光二抗及xCT一抗與AF555紅色熒光二抗同時染色，進行共聚焦成像，結(jié)果顯示，當未感染Pg時，僅顯示紅色熒光，當感染Pg后，F(xiàn)imA被AF488綠色熒光標記，結(jié)合紅色熒光的xCT和結(jié)合綠色熒光的FimA可以出現(xiàn)共定位，兩者可以發(fā)生互作(圖5)。

圖5 免疫熒光證明xCT與FimA互作(標尺=20 μm)Fig.5 Immune fluorescence proves interaction between xCT and FimA(Scale bar=20 μm)

2.3 xCT -/-小鼠抑制Pg在其食管鱗狀上皮細胞的定殖

在小鼠狀態(tài)穩(wěn)定后第1～2周喂飼含抗生素(0.2 g/L氨芐青霉素，新霉素和甲硝唑以及0.1 g/L萬古霉素)的飲用水，用于清除小鼠自身攜帶的細菌。對照組為6只野生型(wild type，WT)小鼠正常飼養(yǎng)(未感染Pg)，對另一組WT小鼠及基因敲除(knockout，KO)小鼠(各6只)，每天進行口腔灌注Pg(1×108/mL濃度的Pg灌注0.1 mL)，持續(xù)4周，取其食管進行脫水及石蠟包埋，運用RNAscope?檢測Pg進入其食管鱗狀上皮細胞情況(圖6A)，以RNAscope?陽性區(qū)域占整個小鼠食管面積的百分比計算[19]，根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果(圖6B)，陰性對照組為(5.33±0.61)%，基因敲除小鼠為(10.33±0.95)%，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而普通小鼠陽性區(qū)域占比為(24.83±2.57)%，與基因敲除組小鼠相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A：小鼠食管上皮RNAscope?檢測；B：Pg的表達量統(tǒng)計圖，與對照組比較，*P<0.05，與KO mice+Pg組比較，△△P<0.01圖6 xCT-/-小鼠抑制Pg在其食管鱗狀上皮細胞的定殖Fig.6 Inhibition of Pg colonization in esophageal squamous epithelial cells in xCT-/- mice

2.4 Pg感染誘導食管癌細胞谷氨酰胺代謝增強

提取實驗各組小鼠食管組織總RNA，利用qRT-PCR方法檢測不同分組中小鼠食管組織谷氨酰胺合成酶GLS1的表達水平。結(jié)果表明，與對照組比較，GLS1的表達水平在KO mice+Pg組及WT mice+Pg組均顯著升高(均P<0.01)(圖7A)。本研究進一步提取不同處理組食管癌細胞系總RNA，以KYSE150轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒(150+NC)為對照組。結(jié)果顯示，與對照組比較，GLS1的表達水平在150+NC+Pg組及150+sh xCT+Pg組顯著增高(均P<0.01)(圖7B)。

GSH/GSSG試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)，Pg感染后24 h谷氨酰胺水平顯著升高。在存在谷氨酰胺的情況下，Pg感染細胞的GSH/GSSG比值為(19.33±2.73)，較未感染細胞的(6.00±0.33)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖7C)。

A:小鼠食管組織中GLS1的表達水平，與WT mice比較，**P<0.01；B：食管癌細胞不同處理組GLS1的表達，與對照組比較，**P<0.01；C：感染Pg后谷氨酰胺代謝增強，與對照組比較，**P<0.01圖7 Pg感染誘導谷氨酰胺代謝增強Fig.7 Pg infection enhances glutamine metabolism

3 討論

腫瘤研究中有關病原微生物與宿主之間的作用機制探討不多，多種病原微生物均可通過影響宿主表面受體分子，在腫瘤細胞中長期定植，促進腫瘤生長，促進其惡性進展[22]。盡管病原微生物感染對腫瘤的作用機制尚不完全明確，但清除病原微生物有助于控制腫瘤的惡性進展[23]。

在本研究中，我們通過探究微生物毒力因子對腫瘤宿主細胞的分子相互結(jié)合機制，首次發(fā)現(xiàn)促進Pg進入食管鱗癌細胞的宿主因子。腫瘤細胞中xCT的高水平表達及其作為Pg進入細胞的宿主因子，說明腫瘤細胞的膜受體分子在Pg感染期間發(fā)揮重要作用。體外實驗證實xCT能夠與FimA互相結(jié)合，促進Pg進入ESCC，從而增強腫瘤細胞對胞外谷氨酰胺的攝取。體內(nèi)實驗表明xCT在Pg進入食管上皮細胞的轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用，在Pg感染食管癌細胞后，細胞谷氨酰胺代謝活力增強，表明xCT在腫瘤細胞代謝過程中可參與維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)。因此，xCT可作為食管癌防治的潛在靶點之一。雖然本研究尚未探究其他癌種中類似的細胞功能機制，但當xCT被抑制時，具有較高xCT表達的腫瘤細胞均會對細胞侵襲產(chǎn)生類似的影響[24]。

越來越多的科學研究證據(jù)表明，細菌在腫瘤發(fā)生和化療耐藥中發(fā)揮著重要作用[25]。多項研究結(jié)果表明，xCT在多種腫瘤中均具有更高的表達水平[26-27]。xCT不僅與細胞的谷氨酰胺代謝相關，還在細胞的鐵死亡過程中起著關鍵作用，對其靶向抑制已被證明可在體內(nèi)體外抑制多種腫瘤生長。近年研究還發(fā)現(xiàn)，活性氧在細胞內(nèi)的積累可誘導細胞發(fā)生自噬，但抑制xCT的表達后是否通過在細胞內(nèi)積累活性氧誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬尚不清楚。目前，關于Pg影響腫瘤細胞功能的分子機制尚不完全明確，以及在Pg感染條件下，xCT如何維持食管癌細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的具體機制仍需進一步探討。

我們的研究結(jié)果表明，Pg的鞭毛蛋白FimA可與xCT特異性結(jié)合，xCT在調(diào)節(jié)食管癌細胞惡性演進方面發(fā)揮重要作用，提示xCT可作為Pg陽性食管癌患者潛在治療靶點之一。在進一步提高患者整體預后水平，挖掘影響食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展的危險因素，探尋新的分子治療靶點中具有重要臨床意義。此外，明確xCT在食管腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用將有助于其進一步的臨床應用。