王婭南， 魏亞寧， 范翔宇， 張 培， 王 盼， 李靖華

河北大學附屬醫(yī)院 1病理科 2腫瘤內(nèi)科 3外科，保定 071000

胃癌(gastric cancer，GC)是最常見惡性腫瘤之一。雖然近年來外科手術(shù)、放療、化療和分子靶向治療在診治GC上取得了較大的進展，但GC患者在確診后生存期仍然較短，其中晚期患者的5年生存率為5%～20%，中位生存期不到1年[1-4]。由于GC臨床表現(xiàn)不具有特異性，故早期診斷和干預對改善和延長GC患者生存期具有重要意義。因此深入探尋GC發(fā)生的潛在機制將有助于尋找新的診斷生物標志物和有效的治療干預措施。

微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA。miRNA通過與其靶點信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)的不完全堿基配對來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達[5]。研究發(fā)現(xiàn)一些miRNA在GC發(fā)生和發(fā)展過程中呈現(xiàn)出正向或者負向調(diào)節(jié)作用[6-10]。miR-183-5p是一種癌癥相關(guān)的miRNA，參與調(diào)節(jié)骨肉瘤、肝癌和肺癌等多種惡性腫瘤的進展[11-14]。有研究報道m(xù)iR-183-5p參與調(diào)節(jié)GC細胞的遷移和侵襲[15]，提示其在GC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究觀察miR-183-5p在GC組織和細胞的表達水平，初步探討miR-183-5p對GC生物學行為的影響及其潛在的分子機制，為GC臨床診斷和治療提供一個潛在的生物學靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年5月至2020年5月在河北大學附屬醫(yī)院接受胃切除術(shù)的66例經(jīng)內(nèi)鏡活檢并行術(shù)后病理檢查的GC確診患者。所有患者或其親屬都簽署了知情同意書。本研究經(jīng)河北大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準。GC患者手術(shù)前未接受局部或全身放療或化療。腫瘤組織和癌旁組織收集后，冷凍并儲存在液氮(-196℃)中備用。

1.2 細胞株及轉(zhuǎn)染

人GC細胞株(AGS、BGC-823、MKN45、SGC-7901)和人正常胃上皮細胞株GES-1購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(美國ATCC)。所有細胞培養(yǎng)均在含10%胎牛血清(美國HyClone公司)、100 U/mL青霉素和100 μg/ mL鏈霉素(美國Invitrogen公司)的DMEM培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。構(gòu)建的慢病毒載體轉(zhuǎn)染BGC-823細胞，包括LV2-has-miR-183-5p和LV2空白慢病毒構(gòu)建載體(陰性對照，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。在含有5 μg/mL嘌呤霉素(Sigma-Aldrich)的培養(yǎng)物中篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞。

1.3 miRNA靶點預測

使用在線工具TargetScan(http：//www.targetscan.org/)和miRanda(http：//www.microrna.org/)對miR-183-5p靶點進行預測和分析。

1.4 熒光素酶報告基因測定

非典型FAT鈣粘蛋白1(FAT1)野生型3′-UTR序列與預測目標位點內(nèi)miR-183-5p或突變序列相互作用合成并插入pGL3對照載體(美國Promega公司)。BGC-823細胞接種在24孔板中，采用上述構(gòu)建體和miR-183-5p/對照載體轉(zhuǎn)染。48 h后收集細胞并使用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)(美國Promega公司)測量熒光素酶活性。

1.5 qRT-PCR法檢測基因表達水平

使用TRIzol?試劑(美國賽默飛世爾科技公司)從組織或者細胞系中提取總RNA。使用cDNA合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后基于TaqMan miRNA檢測試劑盒(美國Applied Biosystems)在ABI7900實時PCR系統(tǒng)中通過miR-183-5p特異性引物對miR-183-5p進行定量檢測。使用引物試劑盒(TaKaRa，大連，中國)合成FAT1的cDNA，使用實時PCR定量系統(tǒng)檢測FAT1 mRNA水平。GAPDH和U6分別為mRNA和miRNA的內(nèi)標。

1.6 細胞增殖和凋亡檢測

將2×104個BGC-823細胞或轉(zhuǎn)染后BGC-823細胞種植于96孔板中，分別設(shè)為對照組(BGC-823細胞)、空白轉(zhuǎn)染對照組(空白載體轉(zhuǎn)染的BGC-823細胞)、miR-183-5p轉(zhuǎn)染組(miR-183-5p轉(zhuǎn)染的BGC-823細胞)，各組細胞孵育特定時間(0～72 h)。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，將10 μL MTT(美國Sigma公司)溶液加入每個孔中，繼續(xù)孵育4 h。酶標儀測量490 nm處的吸光度值。將1×105個BGC-823細胞或轉(zhuǎn)染后BGC-823細胞種植于6孔板中。細胞培養(yǎng)48 h后離心棄去細胞培養(yǎng)液，經(jīng)PBS洗滌后，使用碘化丙啶(PI，10 μg/mL，美國Sigma公司)和Annexin Ⅴ-FITC(50 μg/mL，美國BD Biosciences公司)對細胞進行雙染。采用FACScan流式細胞儀(美國Beckman Coulter)檢測細胞凋亡水平。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測

使用蛋白提取試劑盒(中國碧云天試劑有限公司)從細胞或組織中提取總蛋白。采用BCA試劑盒(中國碧云天試劑有限公司)對蛋白濃度進行定量。取約20 μg蛋白質(zhì)提取物，在10% SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜封閉并與FAT1一抗(英國Abcam公司)在4℃下孵育過夜，然后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(中國碧云天試劑有限公司)在室溫下孵育1 h。使用PierceTMECL蛋白質(zhì)印跡底物(美國賽默飛世爾科技公司)對蛋白條帶進行可視化。使用Image J軟件對蛋白條帶進行半定量分析。

1.8 免疫組織化學染色

將患者組織標本固定，包埋在石蠟中，然后制備組織切片。將5 μm厚的組織切片進行脫蠟、脫水并在檸檬酸鹽緩沖液中加熱15 min。將組織切片先與FAT1抗體4 ℃下孵育過夜，然后與二抗繼續(xù)孵育2 h。使用DAB試劑盒(中國碧云天試劑有限公司)對切片進行顯色。

1.9 小鼠移植瘤模型

6周齡雄性BALB/c裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物實驗按照河北大學動物實驗倫理委員會的指導方針進行。分別將5×106個BGC-823細胞、空白轉(zhuǎn)染的BGC-823細胞、miR-183-5p穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BGC-823細胞注射植入裸鼠腋窩皮下部位。每4天測量1次腫瘤長度(L)和寬度(W)。腫瘤體積計算公式：V=0.5×L×W2。造模后第24天，處死小鼠并剝離腫瘤組織。采用4%多聚甲醛將腫瘤組織進行固定后，進行下一步研究。

1.10 TUNEL檢測

小鼠腫瘤組織經(jīng)石蠟包埋并切片(5 μm)后，使用TUNEL凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物技術(shù))檢測腫瘤組織中的細胞凋亡水平。采用共聚焦顯微鏡(德國徠卡公司)觀察組織切片的凋亡水平，在5個隨機視野(×200)下對組織標本中凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)進行計數(shù)。凋亡率=凋亡細胞/總細胞×100%。

1.11 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 GC腫瘤組織和細胞株中miR-183-5p水平下調(diào)

與癌旁組織相比，GC腫瘤組織miR-183-5p水平顯著降低(圖1A，P<0.01)。與GES-1相比，GC細胞株(AGS、BGC-823、MKN45和SGC-7901)miR-183-5p水平均顯著降低(圖1B，均P<0.01)。miR-183-5p水平與腫瘤大小(圖1C)、GC腫瘤分型(腸型7.72vs.彌漫型3.85，P<0.01)、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期7.2vs.Ⅲ+Ⅳ期4.4，P<0.05)、生存時間(圖1D)呈負相關(guān)。

A：GC組織miR-183-5p水平，**P<0.01；B：GC細胞株(MKN45、BGC-823、SGC-7901、AGS)和正常胃上皮細胞(GES-1)miR-183-5p水平，**P<0.01；C：miR-183-5p與腫瘤大小的相關(guān)性分析，n=66；D：GC患者生存時間Kaplan-Meier曲線，n=66圖1 GC腫瘤組織和細胞miR-183-5p水平下調(diào)Fig.1 Downregulation of miR-183-5p levels in GC tissues and cells

2.2 miR-183-5p抑制BGC-823細胞增殖

基于miR-183-5p在BGC-823細胞表達水平最低，轉(zhuǎn)染實驗選擇BGC-823細胞進行。如圖2A所示，qRT-PCR確認了miR-183-5p轉(zhuǎn)染效率。與空白轉(zhuǎn)染對照組比較，miR-183-5p轉(zhuǎn)染組miR-183-5p水平顯著上調(diào)(P<0.01)。如圖2B、2C所示，與空白轉(zhuǎn)染對照組比較，miR-183-5p轉(zhuǎn)染組細胞增殖能力降低，凋亡水平顯著升高(均P<0.01)。

A：BGC-823細胞轉(zhuǎn)染miR-183-5p；B：miR-183-5p對BGC-823細胞增殖的影響；C：miR-183-5p對BGC-823細胞凋亡的影響；與空白轉(zhuǎn)染對照組比較，**P<0.01圖2 miR-183-5p抑制BGC-823細胞增殖Fig.2 miR-183-5p inhibits BGC-823 proliferation

2.3 FAT1是miR-183-5p的靶標

使用在線預測工具TargetScan和miRanda搜索miR-183-5p目標mRNA。因為FAT1具有miR-183-5p潛在的結(jié)合位點(圖3A)，故選擇FAT1作為潛在靶標進行實驗驗證。如圖3B所示，轉(zhuǎn)染miR-183-5p后，BGC-823細胞中FAT1表達水平顯著降低(P<0.01)。將帶有野生型和突變型miR-183-5p結(jié)合位點的3′-UTR FAT1片段克隆到pmirGLO雙熒光素酶載體中。如圖3C所示，熒光素酶活性測定結(jié)果表明在轉(zhuǎn)染miR-183-5p的BGC-823中野生型FAT1 3′UTR報告基因活性受到明顯抑制(P<0.01)，但對突變型FAT1無抑制作用。

1：空白轉(zhuǎn)染對照組；2：miR-183-5p轉(zhuǎn)染組；A：預測的miR-183-5p靶序列；B：BGC-823過表達miR-183-5p對FAT1表達的影響；C：轉(zhuǎn)染細胞熒光素酶活性；與空白轉(zhuǎn)染對照組比較，**P<0.01圖3 FAT1是miR-183-5p的直接靶標Fig.3 FAT1 is a direct target of miR-183-5p

2.4 GC腫瘤組織和細胞株中FAT1表達水平上調(diào)

如圖4A所示，與癌旁組織比較，腫瘤組織中FAT1 mRNA水平顯著升高(P<0.01)。如圖4B所示，免疫組織化學染色結(jié)果顯示腫瘤組織FAT1蛋白表達水平顯著高于癌旁組織。如圖4C所示，Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明GC組織中miR-183-5p水平與FAT1水平呈現(xiàn)負相關(guān)(rs=-0.2577，P=0.0367)。如圖4D所示，與GES-1細胞相比，GC細胞株MKN45、BGC-823、SGC-7901、AGS中FAT1表達水平均顯著上調(diào)(均P<0.01)。

A：GC腫瘤組織FAT1轉(zhuǎn)錄水平；B：免疫組化檢測GC腫瘤組織FAT1表達水平；C：GC腫瘤組織miR-183-5p和FAT1水平相關(guān)性分析；D：Western blot檢測GC細胞株(MKN45，BGC-823，SGC-7901，AGS)和正常胃上皮細胞(GES-1)的FAT1表達水平；與癌旁組織比較，##P<0.01；與GES-1細胞比較，**P<0.01圖4 GC腫瘤組織FAT1水平上調(diào)且與miR-183-5p表達呈負相關(guān)Fig.4 The level of FAT1 in GC tissues is upregulated and negatively correlated with miR-183-5p

2.5 miR-183-5p抑制GC移植瘤模型生長

將轉(zhuǎn)染不同載體的BGC-823細胞注射到裸鼠的腋窩皮下部位，考察腫瘤形成大小。如圖5A所示，與空白轉(zhuǎn)染對照組比較，miR-183-5p轉(zhuǎn)染組腫瘤體積明顯減小(均P<0.01)。如圖5B所示，與空白轉(zhuǎn)染對照組比較，miR-183-5p轉(zhuǎn)染組腫瘤組織TUNEL陽性率顯著升高，凋亡水平顯著增加(P<0.01)。如圖5C所示，與空白轉(zhuǎn)染對照組比較，miR-183-5p轉(zhuǎn)染組腫瘤組織FAT1表達水平顯著下調(diào)(P<0.01)。

1：對照組；2：空白轉(zhuǎn)染對照組；3：miR-183-5p轉(zhuǎn)染組；A：BGC-823移植瘤模型腫瘤體積；B：TUNEL法檢測腫瘤組織凋亡水平；C：Western blot檢測腫瘤組織FAT1表達水平，n=6；與空白轉(zhuǎn)染對照組比較，**P<0.01圖5 miR-183-5p抑制BGC-823移植瘤的生長Fig.5 miR-183-5p inhibits the growth of BGC-823 xenograft tumor model

3 討論

miRNA在惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[5]。研究表明miRNA水平異常在GC進展中起關(guān)鍵作用[6-10]。miR-183是一種癌癥相關(guān)的miRNA[16]，在多種惡性腫瘤中存在著異常表達[11-14]。本研究初步考察GC患者、GC細胞系miR-183-5p的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GC腫瘤組織miR-183-5p水平顯著低于癌旁組織，AGS、BGC-823、MKN45和SGC-7901中miR-183-5p水平也明顯低于GES-1細胞株。相關(guān)性分析結(jié)果表明miR-183-5p表達水平與GC分型、腫瘤組織大小、TNM分期和患者生存時間存在顯著的負相關(guān)，提示miR-183-5p參與了GC的發(fā)生和發(fā)展。已有研究報道m(xù)iR-183-5p參與調(diào)節(jié)GC細胞的遷移和侵襲，因此為了進一步揭示miR-183-5p在GC中精確的生物學功能，本研究觀察了轉(zhuǎn)染miR-183-5p的GC細胞的增殖和凋亡水平變化。結(jié)果表明，過表達miR-183-5p抑制GC細胞增殖并促進其凋亡。與體外研究結(jié)果相一致，在BGC-823移植瘤小鼠模型中，轉(zhuǎn)染miR-183-5p能夠顯著抑制BGC-823在裸鼠體內(nèi)的惡性生長。當前研究結(jié)果提示miR-183-5p是GC發(fā)展過程中重要的負性調(diào)節(jié)因子。

已有研究報道PTEN、PIK3CA、ITGB1是miR-183-5p的靶標[17-19]。為了進一步闡明miR-183-5p通過何種途徑抑制GC的進展，本研究基于開放的在線預測工具TargetScan和miRanda初步預測FAT1可能是miR-183-5p的作用靶點之一，并通過熒光素酶報告基因法對該靶標的有效性進行了驗證。FAT1基因與人類癌癥具有密切的聯(lián)系，在惡性腫瘤中發(fā)揮著雙面角色的作用，在不同的腫瘤中同時具有致癌和抗癌作用。研究發(fā)現(xiàn)導管癌發(fā)展為浸潤性導管癌過程中存在著FAT1缺失；體外降低FAT1表達可以增加食管鱗狀細胞的增殖、遷移和侵襲能力[20-21]。與原代肝細胞和非腫瘤肝組織相比，人類肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)腫瘤組織中FAT1表達增加[22]，而降低FAT1表達水平可以抑制HCC細胞的增殖和遷移能力。此外，研究發(fā)現(xiàn)FAT1參與調(diào)節(jié)惡性腫瘤的發(fā)展可能與其調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號通路有關(guān)[23]。本研究首次發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，GC腫瘤組織和細胞株AGS、BGC-823、MKN45和SGC-7901中FAT1水平顯著升高，且GC腫瘤組織中FAT1水平與miR-183-5p水平呈現(xiàn)負相關(guān)，提示miR-183-5p發(fā)揮腫瘤抑制功能與降低FAT1表達有關(guān)。

綜上所述，生物信息學工具TargetScan和miRanda預測miR-183-5p潛在靶標是FAT1。本研究發(fā)現(xiàn)miR-183-5p在GC腫瘤組織中表達水平下調(diào)，且與GC進展和預后存在密切的聯(lián)系。此外，miR-183-5p在GC腫瘤惡性生長中發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用，這一功能可能與靶向調(diào)控FAT1水平有關(guān)。miR-183-5p有望成為GC潛在的診斷和治療靶點。