高娜，馬鑫，燕茹，萬富鑫，馬學(xué)平，王琴*

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心臟中心功能檢查部，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心內(nèi)科，寧夏 銀川 750004；*通信作者 王琴 13995290877@163.com

肥胖是罹患心血管疾病的重大危險(xiǎn)因素，肥胖患者在冠狀動脈粥樣硬化之前即已經(jīng)出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)和功能改變[1]。肥胖會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)系統(tǒng)性、低水平慢性炎癥[2-3]，肥胖相關(guān)異常代謝產(chǎn)物會激活NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白-3（NLRP3）炎癥小體，上調(diào)炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)炎癥因子半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）的產(chǎn)生[4]，引起炎癥反應(yīng)，致使心肌缺血、心肌細(xì)胞壞死、心室重塑、心肌纖維化形成及心肌收縮功能減低，最終導(dǎo)致肥胖心肌損傷[5-6]。因此，深入研究NLRP3炎癥小體、Caspase-1炎癥因子激活機(jī)制，抑制其炎癥信號傳導(dǎo)，是預(yù)防肥胖早期心肌損傷的有效措施[7]。

超聲生物顯微鏡（ultrasound biomicroscopy，UBM）活體成像技術(shù)在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用，主要應(yīng)用于心臟成像、血管成像、腫瘤成像及分子成像，其應(yīng)變技術(shù)是近年檢測心肌功能的新技術(shù)[8]，可無創(chuàng)、活體檢測左心室形態(tài)、血流動力學(xué)以及心肌的應(yīng)變，為定量評價(jià)肥胖受損心肌收縮功能提供了新方法。本實(shí)驗(yàn)通過UBM與病理相結(jié)合，進(jìn)一步驗(yàn)證應(yīng)變技術(shù)對肥胖小鼠心肌收縮功能監(jiān)測的有效性，以及肥胖所致心肌損傷改變與NLRP3炎癥小體、Caspase-1炎癥因子的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取6周齡、體重為20～25 g的C57BL/6J雄性小鼠50只[寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（寧）2020-0001]，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為肥胖組30只和對照組20只；肥胖組給予高脂飼料（16%脂質(zhì)，0.25%膽固醇），對照組飼料成分為5%脂質(zhì)，不添加膽固醇；所有小鼠自由飲水?dāng)z食。于SPF級屏障內(nèi)飼養(yǎng)12周后，選取體重和Lee's指數(shù)體長×1 000][9]符合納入標(biāo)準(zhǔn)（肥胖組小鼠體重和Lee's指數(shù)＞對照組ˉx+1.5s）的肥胖組小鼠24只、對照組20只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（動物倫理批號：IACUC-NYLAC-2020-067）。

1.2 主要試劑及儀器 天狼星紅染色試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，BP-DL030-50ML）、NLRP3抗體（Abmart，T55651S）、Caspase-1（Abmart，T55429S）、山羊抗兔IgG/FITC標(biāo)記（中杉金橋，ZF-0311）、熒光封片劑DAPI（中杉金橋，ZLI-9557）、UBM（Vevo2100，富士VisualSonics）、冷凍切片機(jī)（瑞沃德，F(xiàn)S800）、光學(xué)顯微鏡（日本Olympus BX43）。

1.3 檢測方法

1.3.1 UBM檢測 使用10%水合氯醛麻醉小鼠后，胸部脫毛備皮，連接心電圖，采用VisualSonics Vevo 2100 Imaging System UBM獲取小鼠心臟相關(guān)數(shù)據(jù)。于左心室長軸切面獲取室間隔舒張末期厚度（interventricular septal end-diastolic thickness，IVS-D）、室間隔收縮末期厚度（interventricular septal endsystolic thickness，IVS-S）、左心室后壁舒張末期厚度（left ventricular posterior wall end-diastolic thickness，LVPW-D）、左心室后壁收縮末期厚度（left ventricular posterior wall end-systolic thickness，LVPW-S）；于左心室短軸切面獲取左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVID-D）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVID-S）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。采用應(yīng)變技術(shù)定量分析軟件（Vevo StrainTMElastography Imaging Mode 3.1.1）獲取左心室心肌應(yīng)變參數(shù)，縱向應(yīng)變參數(shù)于左心室長軸切面測量，徑向和圓周應(yīng)變參數(shù)于乳頭肌水平左心室短軸切面測量，描記心肌運(yùn)動范圍，得出各切面心肌的整體應(yīng)變曲線。

1.3.2 HE染色 制作冰凍切片，采用HE染色觀察細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的變化，其中細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。

1.3.3 天狼星紅染色 采用天狼星紅染色試劑盒檢測心肌細(xì)胞組織纖維化水平，其中膠原纖維呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.3.4 小麥胚芽凝集素+異硫氰酸熒光素檢測 采用小麥胚芽凝集素（wheat germ agglutini，WGA）+異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）綠色免疫熒光反應(yīng)檢測NLRP3、Caspase-1炎癥因子表達(dá)情況，其中心肌細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，炎癥因子呈綠色；使用正常山羊血清封閉，加入一抗（1∶100）、二抗（1∶100）、WGA染液（1∶100）避光孵育，DAPI封片，拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)超聲參數(shù)比較 與對照組相比，肥胖組小鼠LVEF及LVFS水平顯著降低，LVID-S、IVS-D、IVSS、LVPW-D及LVPW-S顯著增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.001），兩組LVID-D差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組小鼠UBM常規(guī)參數(shù)比較（±s）

表1 兩組小鼠UBM常規(guī)參數(shù)比較（±s）

注：LVEF：左心室射血分?jǐn)?shù)；LVFS：左心室短軸縮短率；LVID-D：左心室舒張末期內(nèi)徑；LVID-S：左心室收縮末期內(nèi)徑；IVS-D：室間隔舒張末期厚度；IVS-S：室間隔收縮末期厚度；LVPW-D：左心室后壁舒張末期厚度；LVPW-S：左心室后壁收縮末期厚度

參數(shù)對照組（n=20）肥胖組（n=24）t值P值LVEF（%） 75.04±2.81 63.63±2.03 14.82 0.000 0.000 LVID-D（mm） 3.22±0.28 3.31±0.37 0.80 0.428 LVFS（%）43.17±2.63 33.71±1.50 14.04 0.000 IVS-D（mm） 0.78±0.09 1.01±0.06 9.33 0.000 LVID-S（mm）1.84±0.20 2.20±0.24 5.07 0.000 LVPW-D（mm） 0.78±0.09 0.93±0.14 3.97 0.000 IVS-S（mm）1.10±0.11 1.40±0.10 9.51 LVPW-S（mm）1.09±0.07 1.21±0.11 4.18 0.000

2.2 應(yīng)變參數(shù)比較 與對照組相比，肥胖組小鼠縱向應(yīng)變、徑向應(yīng)變及圓周應(yīng)變值均減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見表2。

表2 兩組小鼠UBM應(yīng)變參數(shù)比較（±s）

表2 兩組小鼠UBM應(yīng)變參數(shù)比較（±s）

參數(shù)對照組（n=20）肥胖組（n=24）t值P值縱向應(yīng)變 24.81±2.97 9.43±2.49 11.91 0.000 0.029圓周應(yīng)變 26.49±5.40 14.25±6.03 4.65 0.000徑向應(yīng)變26.56±5.46 19.17±8.03 2.40

2.3 病理結(jié)果 與對照組相比，肥胖組小鼠室間隔與左心室后壁明顯增厚，心室腔內(nèi)徑明顯變小，呈向心性肥厚（圖1）。

圖1 肥胖組和對照組小鼠左心室病理大體圖片。A.大體橫切；B.大體縱切

2.4 HE染色 對照組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，邊界清晰，胞核大小一致，胞質(zhì)染色均勻；肥胖組小鼠心肌細(xì)胞肥大，邊界模糊，排列紊亂且形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核大小不均一（圖2）。

圖2 肥胖組和對照組小鼠HE染色結(jié)果。A、C：肥胖組；B、D：對照組；A、B：HE染色，×12.5；C、D：HE染色，×100

2.5 WGA染色 與對照組相比，肥胖組小鼠心肌細(xì)胞明顯變大（圖3）。

圖3 肥胖組和對照組小鼠WGA染色結(jié)果（×400）。A、D分別為肥胖組與對照組WGA染色：B、E分別為肥胖組與對照組DAPI染色；C、F分別為肥胖組與對照組Merge；WGA可以特異地結(jié)合在心肌細(xì)胞膜上，心肌細(xì)胞為紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色，與對照組相比，肥胖組心肌細(xì)胞明顯增大

2.6 天狼星紅染色 對照組小鼠心肌膠原纖維分布正常，排列整齊；肥胖組小鼠心肌膠原纖維分布明顯增多，排列紊亂（圖4）。

圖4 肥胖組和對照組小鼠天狼星紅染色結(jié)果（×100）。A.肥胖組；B.對照組；心肌膠原纖維染色呈紅色，與對照組相比，肥胖組小鼠心肌膠原纖維增多，排列紊亂，提示發(fā)生心肌纖維化

2.7 WGA+FITC 與對照組相比，肥胖組小鼠心臟組織中NLRP3、Caspase-1均呈高表達(dá)（圖5、6）。

圖5 肥胖組和對照組小鼠Caspase-1表達(dá)免疫熒光結(jié)果（×100）。A～D：肥胖組；E～H：對照組；A、E：Caspase-1染色；B、F：WGA染色；C、G：DAPI染色；D、H：Merge；心肌細(xì)胞為紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色，Caspase-1免疫熒光為綠色，與對照組相比，心臟組織中Caspase-1明顯呈高表達(dá)

圖6 肥胖組和對照組小鼠NLRP3表達(dá)免疫熒光結(jié)果（×100）。A～D：肥胖組；E～H：對照組；A、E：NLRP3染色；B、F：WGA染色；C、G：DAPI染色；D、H：Merge；心肌細(xì)胞為紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色，NLRP3免疫熒光為綠色，與對照組相比，心臟組織中NLRP3明顯呈高表達(dá)

3 討論

C57BL/6小鼠基因組數(shù)據(jù)完整，是目前實(shí)驗(yàn)性研究常用的近交系小黑鼠，主要應(yīng)用于糖尿病、肥胖癥、炎癥和自身免疫性疾病研究，常作為肥胖模型復(fù)制的首選用鼠[10]。隨著超聲新技術(shù)的發(fā)展，新型UBM可對小鼠心臟的形態(tài)、血流動力學(xué)、心功能進(jìn)行實(shí)時(shí)、動態(tài)評估，為臨床試驗(yàn)性研究提供精確的檢測結(jié)果。心肌應(yīng)變是指心肌組織相對于其原始形狀的變形程度，體現(xiàn)局部心肌的收縮功能[11]。應(yīng)變技術(shù)是UBM中檢測心肌功能的新技術(shù)，用于確定和跟蹤心臟邊界，不受心臟整體運(yùn)動和角度的影響，可追蹤分析心肌的各層運(yùn)動，全面、定量評估心肌的收縮功能[12]。因此，本研究采用Vevo 2100 Imaging System UBM中自帶的最新應(yīng)變技術(shù)對高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠心肌收縮功能進(jìn)行評估。

UBM檢測結(jié)果顯示，LVID-S、IVS-D、IVS-S、LVPW-D及LVPW-S均顯著增大，提示左心室形態(tài)學(xué)已經(jīng)發(fā)生改變，而病理結(jié)果顯示肥胖小鼠室間隔與左心室后壁明顯增厚，心肌細(xì)胞明顯肥大，形態(tài)不規(guī)則，心肌纖維化形成，進(jìn)一步佐證了左心室結(jié)構(gòu)發(fā)生重塑改變。心室重塑描述了分子、細(xì)胞和間質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，通常在各種心肌損傷或超負(fù)荷后演變，特征是心腔幾何形態(tài)的改變、心肌細(xì)胞質(zhì)量增加、肌節(jié)重排、心肌細(xì)胞肥大、炎癥信號傳導(dǎo)[13]和免疫細(xì)胞激活等[14]；心室壁肥厚所致心室重塑可分為向心性重塑改變和離心性重塑改變。本研究中兩組LVID-D無顯著差異，表示左心室向心性重塑改變，是心臟適應(yīng)肥胖所致慢性容量超負(fù)荷所致，便于維持心臟正常血供，van den Berge等[15]認(rèn)為肥胖主要引起向心性重塑，本研究與其相符。此外，本研究發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠左心室心肌收縮功能明顯下降，應(yīng)變值減低，提示已經(jīng)發(fā)生心肌損傷改變，其中縱向應(yīng)變與圓周應(yīng)變結(jié)果較徑向應(yīng)變結(jié)果更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能因?yàn)閺较驊?yīng)變值所體現(xiàn)的心外膜下層纖維受損程度較輕。He等[16]認(rèn)為心外膜下層心肌纖維是最后受灌注影響的，與本研究結(jié)果相符。

本研究免疫熒光反應(yīng)顯示肥胖小鼠體內(nèi)NLRP3炎癥小體、Caspase-1炎癥因子表達(dá)水平明顯升高，與Liu等[17]的研究結(jié)果一致。肥胖是引起心血管疾病的重大危險(xiǎn)因素，會導(dǎo)致全身系統(tǒng)性慢性炎癥反應(yīng)，有研究[18]指出NLRP3炎癥小體在心血管疾病發(fā)病機(jī)制中的重要性；Caspase-1是炎癥小體相關(guān)的Caspase家族成員，在哺乳動物體內(nèi)無活性，主要以酶原的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)NLRP3激活后作用于下游炎癥相關(guān)分子[4]；IL-1β是IL-1超家族的一員，是NLRP3、Caspase-1炎癥小體的效應(yīng)分子[19]，其生物活性受炎癥小體調(diào)節(jié)，而肥胖導(dǎo)致異常代謝產(chǎn)物堆積，激活炎癥信號通路，其中NF-κB是調(diào)控炎癥信號通路的關(guān)鍵，可促進(jìn)NLRP3形成炎癥小體，導(dǎo)致炎癥因子表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)炎癥因子pro-Caspase-1被激活成為Caspase-1，最終導(dǎo)致IL-1β的成熟與分泌，引起炎癥反應(yīng)發(fā)生[20]，最終導(dǎo)致肥胖心肌損傷。

本研究的局限性：本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NLRP3炎癥小體及Caspase-1炎癥因子，僅采用免疫熒光觀察其表達(dá)強(qiáng)弱，未使用蛋白質(zhì)印跡法檢測其在組織中的表達(dá)情況，且未對其下游炎癥因子IL-1β進(jìn)行驗(yàn)證，存在一定的局限性。

總之，UBM及其應(yīng)變技術(shù)可為肥胖小鼠心肌收縮功能檢測提供實(shí)時(shí)、無創(chuàng)、定量檢測，驗(yàn)證了NLRP3炎癥小體和Caspase-1炎癥因子與肥胖心肌細(xì)胞早期炎癥有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突