朱志鵬，劉慧玲，吳可鑫，虞健翔，王博文，孫 淼,2*

(1 江蘇省鹽土生物資源研究重點實驗室,鹽城師范學院海洋與生物工程學院，江蘇鹽城 224002；2 南京農(nóng)業(yè)大學，作物遺傳與種質改良國家重點實驗室，南京 210095)

秋葵[Abelmoschusesculentus(L.) Moench]為錦葵科(Malvaceae)秋葵屬(AbelmoschusMedicus)，又稱黃秋葵，在世界范圍內(nèi)廣泛種植，具有觀賞價值、食用價值和藥用價值[1]。秋葵的莖為圓柱形，疏生散刺；其葉呈掌狀，裂片闊至狹，托葉線形，被疏硬毛；其蒴果為筒狀尖塔形。秋葵性喜暖，耐熱力強，多生長于熱帶和亞熱帶地區(qū)[2]。秋葵中含豐富的鉀、鈣、鐵、鋅、錳等元素，具有極高的營養(yǎng)價值，已逐漸成為一種新型蔬菜；它還具有果膠類物質、膳纖維、酚類化合物等多種生物活性物質，可以有效防治心血管疾病、消化疾病等[3]。

植物在自然生長發(fā)育過程中會面對各種生物或非生物脅迫影響，面對這些逆境條件，植物體內(nèi)通常會通過一系列的生理、生化反應作為自身的防御保護措施[4]。在植物逆境響應系統(tǒng)中，轉錄因子對功能基因表達的調控是植物逆境響應的關鍵環(huán)節(jié)[1]。MYB基因家族是與生理代謝、細胞的形態(tài)和模式建成等生理過程有關的一類轉錄因子，廣泛參與了植物器官的生長發(fā)育以及對非生物脅迫的特異性響應[5]。迄今為止，研究者已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[6]、棉花(GossypiumhirsutumL.)[7]、大豆(GlycinemaxL.)[8]、漆樹(Toxicodendronvernicifluum)[9]等多種植物中擴增獲得MYB類基因，且過度表達MYB基因的擬南芥[10]、番茄(SolanumlycopersicumL.)[11]等均表現(xiàn)出了較強的非生物脅迫抗性。但秋葵MYB基因的功能研究尚無相關報道。

本研究以‘北海道1號’秋葵為實驗材料，擴增獲得了1個MYB類轉錄因子基因AeMYB1R1，基于生物信息學技術分析其核苷酸序列和編碼的氨基酸序列。并采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術分析了AeMYB1R1基因在秋葵不同器官(葉、莖、根)和非生物脅迫(低溫、干旱、鹽和高溫脅迫)中的表達特異性，為進一步開展秋葵MYB類轉錄因子的分子調控機制研究提供理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗研究對象為秋葵(圖1)品種‘北海道1號’(A.esculentus, cv ‘Hokkaido No.1’)，待秋葵幼苗長至三葉一心時移入培養(yǎng)箱進行脅迫處理。脅迫處理試驗分為4組，分別為38 ℃的高溫脅迫處理(A組)，200 mmol/L NaCl溶液的鹽脅迫處理(B組)，200 g/L PEG6000溶液的干旱脅迫處理(C組)和-7 ℃低溫脅迫處理(D組)，每組6株用于采樣，每個處理設置3個生物學重復。在處理6、12和24 h時分別取秋葵相同位置的葉、莖、根等組織，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱以用于后續(xù)實驗。

1.2 方 法

1.2.1 RNA的提取與cDNA的合成使用RNA提取試劑盒(RNAsimple Total RNA Kit試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司，目錄號：DP419)分別提取秋葵的不同時期和不同組織的Total RNA，提取完成后，參照反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒，購自北京TaKaRa生物醫(yī)藥科技有限公司，目錄號：RR036A)的使用說明，將提取的總RNA反轉錄為cDNA。

1.2.2 秋葵AeMYB1R1基因克隆根據(jù)本課題組上傳的秋葵轉錄組數(shù)據(jù)庫(NCBI登錄號：SRR13983395)[12]，檢索獲得編碼秋葵MYB轉錄因子的基因AeMYB1R1 (GenBank登錄號：OM963000)，利用DNAMAN設計1對引物(正向引物：5′-CTGCGGAGGAGTGAAACTGT-3′，反向引物：5′-TCTCACCGCGATGATTAGCC-3′)。以反轉錄得

到的cDNA為模板，使用20 μL體系(PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 10.0 μL，cDNA 1.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，ddH2O 7.0 μL)進行AeMYB1R1基因PCR擴增(高保真PCR酶購自北京TaKaRa生物醫(yī)藥科技有限公司，目錄號R045A)。PCR反應程序為：98 ℃預變性10 s，98 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物使用1.2 %瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.3AeMYB1R1基因的生物信息學分析采用ExPASy-Translatetool可對AeMYB1R1核酸序列進行翻譯，將AeMYB1R1基因序列翻譯成相應的氨基酸序列。使用ExPASy-Protparamtool分析蛋白質的理化性質。信號肽分析利用SignalP 5.0 Server軟件完成，跨膜結構分析利用TMHMM Server v.2.0軟件完成。通過NCBI網(wǎng)站進行BLAST對比，得到AeMYB1R1蛋白的保守域以及其他物種MYB蛋白的氨基酸序列。選用SOPMA軟件進一步分析蛋白質二級結構，蛋白質三級結構模型由Swiss-Model在線建立。DNAMAN 6.0軟件被用于物種間MYB蛋白的多重對比和AeMYB1R1蛋白的親/疏水性分析。AeMYB1R1蛋白糖基化位點的預測采用NetOGlyc軟件。使用Netphos3.1 Server PredictProtein對AeMYB1R1蛋白的磷酸化位點進行分析。使用Plant CARE識別轉錄因子識別并特異結合的目標基因旁側的DNA序列(順式作用元件)。本研究所用生物信息學分析在線網(wǎng)址及軟件如表1所示。

表1 生物信息學分析在線網(wǎng)址及軟件Table 1 Bioinformatics analysis online URL and software

1.2.4 實時定量PCR反應基于PCR擴增且經(jīng)過測序分析的AeMYB1R1基因序列，設計qRT-PCR熒光定量引物，AeMYB1R1基因表達正向引物為5′-CTGCGGAGGAGTGAAACTGT-3′，反向引物為5′-TCTCACCGCGATGATTAGCC-3′。以秋葵AeActin7為內(nèi)參基因，正向引物為5′-TCGCAGACCGTATGAGCAAG-3′，反向引物為5′-GGTGCTGAGTGATGCCAAGA-3′。使用qRT-PCR檢測系統(tǒng)分析該基因在不同組織中和不同非生物脅迫下的表達情況。反應體系20 μL，包括TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)10.0 μL，cDNA 2.0 μL，正、反向引物各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，ddH2O 6.0 μL(TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自北京TaKaRa生物醫(yī)藥科技有限公司)。使用GraphPad Prism 8.0軟件，采用2-ΔΔCt方法對‘北海道1號’秋葵AeMYB1R1基因在不同器官和不同脅迫條件下的相對表達量進行分析。

2 結果與分析

2.1 秋葵AeMYB1R1基因的克隆及序列分析

對AeMYB1R1基因的PCR擴增結果顯示，得到一條長約 1 100 bp 長度的目的條帶(圖2)，目的片段大小基本符合預期。本研究從‘北海道1號’秋葵中克隆得到AeMYB1R1基因，結果顯示AeMYB1R1基因的開放閱讀框(open reading frame, ORF)長度為 1 056 bp，編碼352個氨基酸(圖3)。

2.2 AeMYB1R1蛋白的氨基酸組成及理化性質

ExPASy-Protparamtool對AeMYB1R1蛋白序列和理化性質分析表明，其分子量為37 891.57 Da，理論等電點為8.75，分子式為C1647H2615N489O515S12，總原子數(shù)為5 278，脂肪指數(shù)為70.37，總平均親水性為-0.495，不穩(wěn)定指數(shù)(The instability index Ⅱ)為40.22。根據(jù)不穩(wěn)定指數(shù)標準，當指數(shù)<40時為穩(wěn)定蛋白,指數(shù)>40時為不穩(wěn)定蛋白，因此由不穩(wěn)定性指數(shù)可判定AeMYB1R1蛋白為不穩(wěn)定蛋白質[13]。在堿基組成方面，AeMYB1R1基因序列由A、C、G、T四種堿基組成，其中含量占比最高的為腺嘌呤A，其數(shù)量為306，占比29.0%；胞嘧啶C的數(shù)量為254，占比24.1%；胸腺嘧啶T的數(shù)量為250，占比23.7%；鳥嘌呤G的數(shù)量為246，其占比為23.3%。表2顯示，在氨基酸組成方面，組成AeMYB1R1蛋白的20種氨基酸中絲氨酸(Ser)含量最高，色氨酸(Trp)數(shù)量最少，包括其中帶負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)32個以及帶正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)36個。

表2 AeMYB1R1蛋白中的20種氨基酸含量表Table 2 The list of 20 amino acids in AeMYB1R1 protein

2.3 AeMYB1R1蛋白的保守結構域分析

NCBI-CDD在線工具分析結果顯示，AeMYB1R1的保守結構域為第104～156位氨基酸的序列區(qū)域，特定匹配(Specific hits)得分最高的是myb_SHAQKYF，該匹配所屬SANT超家族(SANT superfamilies)，而SHAQKYF類MYB家族轉錄因子(域架構ID 10019308)在植物的發(fā)育過程和防御反應中起著核心作用。

利用NCBI在線網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索木槿(Hibiscussyriacus)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、榴蓮(Duriozibethinus)、可可(Theobromacacao)等19種植物的MYB1R1氨基酸序列，將其與秋葵AeMYB1R1氨基酸序列共同導入MEGA-X進行同源性比對。結果(圖4)表明，AeMYB1R1的氨基酸序列與其他物種中MYB1R1的氨基酸相似度均超過65%，具有較高的一致性，說明MYB1R1在不同植物物種間的保守性較高。

2.4 AeMYB1R1蛋白結構和信號肽預測及其跨膜結構分析

利用SOPMA對AeMYB1R1蛋白進行二級結構分析。結果顯示，AeMYB1R1編碼蛋白由α-螺旋、延伸主鏈、β-轉角、無規(guī)則卷曲4種結構組成，分別占比為21.31%、9.94%、2.27%和66.48%。其中，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是AeMYB1R1主要的二級結構(圖5，A)。Swiss-Model對蛋白質三維結構的預測分析結果與二級預測結果基本相符(圖5，B)。以Entamoeba histolytica EhMybS3(SMTL ID:6nvz.1)為模板，所構建的模型與其序列一致性為41%，覆蓋率為15%，氨基酸序列范圍為104～158。

對AeMYB1R1轉錄因子的信號肽預測分析未發(fā)現(xiàn)特異性結果，推測AeMYB1R1蛋白序列中沒有信號肽的存在，推斷該蛋白無跨膜結構。TMHMM Server v.2.0分析結果顯示，AeMYB1R1蛋白的1～352位氨基酸均位于細胞膜表面，無跨膜螺旋區(qū)。氨基酸序列不存在跨膜區(qū)和信號肽，推測該蛋白屬于定位在細胞質基質或細胞器基質中的蛋白，不屬于膜蛋白或分泌蛋白。

2.5 AeMYB1R1氨基酸序列的親/疏水性預測

AeMYB1R1蛋白的親/疏水性分析結果表明，在AeMYB1R1蛋白的親水性區(qū)域(圖6，A)，第163位賴氨酸(Lys)的親水性最強；在AeMYB1R1蛋白的疏水性區(qū)域(圖6，B)，第118位亮氨酸(Leu)的疏水性最強。組成AeMYB1R1蛋白的氨基酸中，35%為親水性氨基酸，65%為疏水性氨基酸，AeMYB1R1蛋白的疏水區(qū)域多于親水區(qū)域，因此推測其屬于疏水性蛋白。

2.6 AeMYB1R1蛋白的修飾位點

2.6.1 AeMYB1R1蛋白的磷酸化位點預測NetPhos 3.1 Server預測結果表明(圖7)，AeMYB1R1蛋白中共發(fā)現(xiàn)86處可能存在的磷酸化位點以及47個特異性激酶位點，包含了31個絲氨酸(Ser)、14個蘇氨酸(Thr)和2個酪氨酸(Tyr)。同時，AeMYB1R1蛋白涉及到13種特異性激酶，包括以鈣和磷脂依賴的蛋白激酶PKC，以環(huán)腺苷酸依賴的蛋白激酶PKA，環(huán)鳥苷酸依賴的蛋白激酶PKG，以及作用于下游的磷酸化級聯(lián)系統(tǒng)的p38MAPK、cdc2、cdk5，還包括DNA依賴性蛋白激酶DNAPK，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶的糖原合成酶激酶-3(GSK-3)，參與信號傳導的蛋白激酶核糖體S6激酶(RSK)，酪蛋白激酶1、2(CKI、CKII)，以及其他植物蛋白激酶INSR、ATM。

2.6.2 AeMYB1R1蛋白的糖基化位點預測采用在線網(wǎng)站YinOYang 1.2 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/)，本研究對AeMYB1R1蛋白潛在的O-糖基化位點進行預測和分析。結果表明，氨基酸序列的第2、52、58、59、60位等共19處O-糖基化位點，其中位點所對應的氨基酸分別為6個蘇氨酸(Thr)和13個絲氨酸(Ser)(圖8，A)。NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)在線工具主要預測N-糖基化位點，分析結果表明，第50、158、208、340位含有潛在的N-糖基化位點，但此序列不包含信號肽，無信號肽的蛋白質不可能暴露在N-糖基化機制中，也不可能在體內(nèi)被糖基化(圖8，B)。

2.7 AeMYB1R1蛋白的同源性分析

利用MEGA-X對秋葵和其他20種植物的MYBs構建系統(tǒng)進化樹，分析其同源進化關系(圖9)。結果表明，AeMYB1R1與同屬于錦葵科(Malvaceae)的木槿(Hibiscussyriacus)和陸地棉(Gossypiumhirsutum)等植物的MYB蛋白進化關系最近，與木棉科(Bombacaceae)的榴蓮(Duriozibethinus)、梧桐科(Sterculiaceae)的可可(Theobromacacao)等植物有著近緣關系，而與茄科(Solanaceae)、蕓香科(Rutaceae)、葡萄科(Vitaceae)、豆科(Leguminosae)、胡桃科(Juglandaceae)等植物MYB1R1蛋白的進化關系較遠。因此，同屬錦葵科的秋葵、木槿、陸地棉、可可等植物中的MYB1R1蛋白在進化中更為保守。

2.8 AeMYB1R1在秋葵不同組織中的表達

通過qRT-PCR檢測分析‘北海道1號’秋葵AeMYB1R1基因在不同組織中的相對表達。結果(圖10)顯示，AeMYB1R1基因在‘北海道1號’秋葵的葉片、莖部和根部都有不同程度的表達，在葉部表達量最高，其次是根部，而在莖部的表達水平最低。其中，秋葵葉部AeMYB1R1基因的表達水平是莖的21.23倍，是根部的7.95倍。

2.9 在非生物脅迫下AeMYB1R1的表達特性

通過順式作用元件分析，在AeMYB1R1序列中預測到了CGTCA-motif(茉莉酸甲酯響應元件)、ABRE(脫落酸響應元件)、MBS(干旱響應元件)、G-box(光響應元件)等多個與植物激素和逆境脅迫相關的響應元件，表明該基因可能在秋葵響應非生物脅迫的轉錄調控機制發(fā)揮作用。

進一步通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，‘北海道1號’秋葵AeMYB1R1基因在高溫脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫和低溫脅迫下具有表達特異性(圖11)，在秋葵不同組織和不同處理時間相對表達水平存在明顯差異。

高溫(38 ℃)脅迫數(shù)據(jù)表明(圖11，A)，高溫處理6 h時，AeMYB1R1基因在秋葵葉片相對表達水平最高，分別為莖的7.64倍、根的1.45倍；處理12 h，AeMYB1R1基因在葉片中的表達量有略微增加，

而在莖部和根部的表達量顯著提高，與6 h數(shù)據(jù)相比，葉、莖、根中AeMYB1R1的相對表達量分別提高了15.48%、83.34%和110.34%；處理24 h，AeMYB1R1基因相對表達量在葉、莖、根中均有顯著提高，相較于6 h，葉、莖、根中AeMYB1R1的相對表達量則分別提高了2.69、3.50和3.28倍。

鹽(200 mmol/L NaCl溶液)脅迫試驗數(shù)據(jù)表明(圖11，B)，鹽處理6 h，AeMYB1R1基因在葉中的表達量分別為莖的5.03倍、根的29.80倍；處理12 h時，AeMYB1R1基因的相對表達水平呈現(xiàn)顯著上升趨勢，與6 h數(shù)據(jù)相比，葉、莖、根中AeMYB1R1的相對表達量分別提高了1.46、8.45和26.33倍；處理24 h，AeMYB1R1基因在葉和根部的相對表達量明顯提升，并在根部顯著表達，與6 h數(shù)據(jù)相比，葉、莖、根中AeMYB1R1的相對表達量分別提高了14.85、10.38和1 339.17倍。

干旱(20% PEG6000溶液)脅迫試驗數(shù)據(jù)表明(圖11，C)，處理6 h時，AeMYB1R1基因在秋葵的葉、莖和根部的相對表達水平較低，且無顯著差異；干旱脅迫12 h時，AeMYB1R1的相對表達水平開始上升，與6 h數(shù)據(jù)相比，葉、莖、根中AeMYB1R1的相對表達量分別提高了99.20%、400.14%和160.12%；干旱脅迫24 h，AeMYB1R1基因在秋葵的葉片和根部的表達量提升較快，且在根部相對表達量最高，與6 h數(shù)據(jù)相比，葉、莖、根中AeMYB1R1的相對表達量分別提高了9.38、12.08和125.96倍。

低溫(-7 ℃)脅迫試驗數(shù)據(jù)表明(圖11，D)，低溫處理6和12 h時，AeMYB1R1基因在秋葵的葉、莖和根部的相對表達水平緩慢提高，未出現(xiàn)顯著變化；24 h時，AeMYB1R1基因在秋葵的葉、莖和根部的相對表達量提高較為顯著，相比于12 h時，AeMYB1R1基因在秋葵的葉、莖和根部分別提高了5.43、7.21和2.77倍。

3 討 論

非生物脅迫可通過破壞系統(tǒng)結構和功能影響滲透調控和離子平衡等，直接或間接地損害植物細胞，從而嚴重影響植物的生長發(fā)育[14]。據(jù)報道，植物體內(nèi)主要存在5類與抗逆性相關的轉錄因子，它們精準地調控下游功能基因適時適量表達，實現(xiàn)對非生物脅迫的應答，包括NAC、MYB、WRKY、bZIP和ERF/DREB[15]。其中，MYBs成員眾多，分布廣泛，參與植物次生代謝、激素轉導和環(huán)境因子反應，并在細胞分化、細胞周期和葉片形態(tài)發(fā)生中起著重要的調節(jié)作用[16]。本研究從‘北海道1號’秋葵中擴增獲得了1個AeMYB1R1基因，其氨基酸序列具有較高的保守性。同時，AeMYB1R1屬于SHAQKYF類MYB家族轉錄因子，研究表明，SHAQKYF類MYBs可以調控植物的防御反應機制[17]，這也暗示了AeMYB1R1可能參與秋葵的抗脅迫機制。

在柳枝稷(PanicumvirgatumL.)中，PvMYB4在葉片、葉鞘、節(jié)間、花序和節(jié)間表達量較高，但在根部表達受限[18]。在茶樹(Camelliasinensis)中，CsMYB47和CsMYB17在葉和芽中高表達，CsMYB34則在老葉、莖和根部特異性表達[19]。Yang等[20]證明，在白果樹(GinkgobilobaL.)中，MYB41在未成熟和成熟果實中表現(xiàn)出最高的轉錄積累，MYB1在根和莖部高表達，而MYB5、MYB7、MYB21、MYB24、MYB25、MYB49、MYB52和MYB57則在所有組織中幾乎無表達。以上研究表明，MYBs具有顯著的組織表達特異性。在橡膠(Heveabrasiliensis)的愈傷組織萌發(fā)中，HbMYB1R1被鑒定為體細胞胚胎發(fā)育的關鍵標記基因[21]。本研究中，AeMYB1R1在秋葵葉中表達量最高，其次是根部，而在莖部的表達水平最低，說明AeMYB1R1基因在秋葵中具有器官表達特異性，并可能在秋葵的發(fā)育過程中起到重要作用。

除了在植物生長發(fā)育中的功能，MYBs在植物響應脅迫的作用逐漸被揭示。蘋果中的MdMYB308L通過與MdbHLH33的相互作用，增強其與MdCBF2和MdDFR啟動子的結合，從而充當蘋果耐寒性和花青素積累的正調節(jié)劑[22]。黃角牛(Xanthocerassorbifolium)中的XsMYB44通過觸發(fā)氣孔關閉以維持水位和調節(jié)ROS穩(wěn)態(tài)，進而抵御干旱和高溫的聯(lián)合脅迫[23]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)AeMYB1R1特異性地應答高溫、鹽、干旱和低溫脅迫；同時，與高溫和低溫脅迫相比，AeMYB1R1在鹽脅迫和干旱脅迫下的相對表達量更為顯著。據(jù)報道，玉米ZmMYB3R受干旱、鹽分和脫落酸誘導，其在擬南芥中的過表達增強了轉基因植物對干旱脅迫和鹽脅迫的耐受能力[24]。番茄LeMYB49可作為一種正調節(jié)劑，通過增強清除活性氧的能力，抑制細胞膜損傷和細胞死亡，保護葉綠體，從而提高對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性[25]。芝麻中的SiMYB75受干旱脅迫、鹽脅迫、脫落酸和甘露醇強烈誘導，在根部特異性表達，并通過脫落酸介導的途徑正向調節(jié)干旱、鹽分和滲透脅迫反應[26]。以上研究表明，部分MYBs參與了脫落酸介導的活性氧清除途徑，從而響應鹽堿和干旱環(huán)境帶來的滲透壓脅迫。因此，我們推測AeMYB1R1可能受脫落酸介導，通過調節(jié)活性氧清除系統(tǒng)，從而參與秋葵響應鹽和干旱脅迫的分子機制。

綜上所述，本研究以‘北海道1號’秋葵為試驗材料，擴增并獲得了1個編碼AeMYB1R1轉錄因子的基因AeMYB1R1，并發(fā)現(xiàn)其在葉中特異性表達。通過對該基因在多種非生物脅迫中表達模式的分析，發(fā)現(xiàn)AeMYB1R1特異性地響應高溫脅迫和低溫脅迫，尤其在鹽脅迫和干旱脅迫下，該基因的相對表達量顯著提高，因此推測AeMYB1R1是調控秋葵抗鹽和抗旱的關鍵轉錄因子。本研究為了解AeMYB1R1基因在秋葵生長發(fā)育和抗逆境機制提供了一定的理論參考，以便為秋葵的育種和抗逆性增強工作奠定基礎。