霍鴻波，王 琳，胡樑臣

氯吡格雷是抗血小板聚集藥物的一種，被廣泛用于改善人體血凝狀態(tài)、減少血栓等治療中，其在冠心病經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)術后抗血栓療效也被臨床廣泛肯定[1]。但大量研究發(fā)現(xiàn)，PCI術后病人的氯吡格雷療效往往因個體差異而出現(xiàn)巨大差別，部分病人即便嚴格按照醫(yī)囑服藥依然無法避免心血管血栓、支架內再狹窄等并發(fā)癥的發(fā)生，臨床將這一現(xiàn)象命名為氯吡格雷抵抗[2-3]。隨著醫(yī)學界的進一步研究發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷療效受病人年齡、既往病史、藥物相互作用以及基因多態(tài)性等因素影響[4]。血小板ADP受體亞基12(P2Y12)是血小板膜表面上的一種二磷酸腺苷受體，是氯吡格雷的主要活性作用靶，可與氯吡格雷不可逆結合，并抑制腺苷酸環(huán)化酶表達，最終抑制血小板聚集。P2Y12基因多態(tài)性可直接影響氯吡格雷的療效[5]。血小板糖蛋白Ⅲa(GPⅢa)則是血小板激活的重要通道，已有研究顯示，GPⅢa具有很高多態(tài)性，其中外顯子2第1 565位核苷酸突變研究最為深入，該位點決定了人PLA1及PLA2基因，而心血管疾病病人PLA2突變率高達30%以上。本研究旨在探討P2Y12、GPⅢa基因多態(tài)性與冠心病病人PCI術后氯吡格雷抵抗的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月—2020年4月在我院治療的冠心病病人300例，其中，男175例，女125例；年齡<60歲164例，≥60歲136例。納入標準：①符合《中國經皮冠狀動脈介入治療指南(2016)》[6]制定的標準；②在我院行冠狀動脈造影并行PCI治療，且術后服用氯吡格雷進行抗血小板治療；③18歲以上漢族病人；④病人及家屬知情同意。排除標準：①合并肝、腎、肺等重要臟器疾病、惡性腫瘤、凝血功能疾病等；②入院前6個月有腦卒中、內臟出血性疾病史；③入院前1個月內服用過阿司匹林等藥物；④入院前6個月內有手術史者。

1.2 治療方法 病人均在雙聯(lián)抗血小板治療基礎上加用氯吡格雷，術前給予病人口服75 mg氯吡格雷[賽諾菲(杭州)制藥有限公司生產，生產批號：S14202003034]+0.1 g阿司匹林(拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產，生產批號：B14202005047)，持續(xù)3 d；隨后于首日加用300 mg氯吡格雷，之后每天加用75 mg氯吡格雷，持續(xù)12個月[7]。

1.3 實驗室檢查 收集病人術后5 d(氯吡格雷服藥5 d)的空腹靜脈血3 mL，將150 μL血液樣本滴入至含150 μL Lysis Buffer+15 μL蛋白酶K的試管內，于55 ℃條件下進行水浴，時長為10 min。取出后滴入450 μL Binding Buffer，混勻并80 ℃水浴10 min，滴入560 μL NaCl，混勻靜置10 min，4 000 r/min，6 cm半徑離心10 min，收集上清，滴入50～100 μL Elution Buffer，混勻并80 ℃水浴10 min，輕輕晃動，確保DNA有效洗脫，冷藏備用。在PUBNED上查詢P2Y12基因rs4244285及GPⅢa基因PLA位點的基因序列，P2Y12基因rs4244285位點的正向引物序列：5-′CAGAGCTTGGCATATTGTATC-3′，反向引物序列：5-′AAATTGTTTCCAATCATTTAGCT-3′；GPⅢa基因PLA位點正向引物序列：5-′CAGGAGGTAGAAGTCGCCATAG-3′，反向引物序列：5-′TATCCTTCAGCAGATTCTCCTTCA-3′。聚合酶鏈式反應(PCR)條件如下，P2Y12基因rs4244285 PCR：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)。GPⅢa基因PLA PCR：50 ℃預變性1 min，95 ℃變性10 min，90 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，共45個循環(huán)。選用美國ABI公司生產的7700 HT熒光定量PCR儀讀取最終結果。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較 300例病人中，76例發(fā)生氯吡格雷抵抗(觀察組)，224例未發(fā)生氯吡格雷抵抗(對照組)。觀察組年齡≥60歲、總膽固醇(TC)≥6.0 mmol/L的比例明顯高于對照組(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組P2Y12基因rs4244285多態(tài)性比較 觀察組與對照組P2Y12基因rs4244285多態(tài)性符合Hardy-Weinberg平衡；觀察組P2Y12基因rs4244285位點GA+AA基因型比例和等位基因A比例分別為72.37%和52.63%，明顯高于對照組(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組P2Y12基因rs4244285多態(tài)性比較 單位：例(%)

2.3 兩組GPⅢa基因多態(tài)性比較 觀察組與對照組GPⅢa基因多態(tài)性符合Hardy-Weinberg平衡。觀察組GPⅢa基因PLA1/PLA2+PLA2/PLA2基因型和等位基因PLA2比例分別為50.00%，28.29%，明顯高于對照組(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組GPⅢa基因多態(tài)性比較 單位：例(%)

2.4 觀察組不同基因多態(tài)性病人血小板聚集率降低幅度比較 觀察組P2Y12基因rs4244285位點GA+AA基因型病人血小板聚集率降低幅度明顯低于GG基因型病人(P<0.05)；觀察組GPⅢa基因PLA1/PLA2+PLA2/PLA2基因型病人血小板聚集率降低幅度明顯低于PLA1/PLA1基因型病人(P<0.05)。詳見表4。

表4 觀察組不同基因多態(tài)性病人血小板聚集率降低幅度比較(±s) 單位：%

2.5 多因素分析 將臨床資料有統(tǒng)計學變量、P2Y12基因rs4244285位點多態(tài)性、GPⅢa基因多態(tài)性作為自變量，將是否發(fā)生氯吡格雷抵抗作為因變量進行Logistic回歸分析，結果顯示：年齡、TC、P2Y12基因rs4244285位點GA+AA、GPⅢa基因PLA1/PLA2+PLA2/PLA2是冠心病病人PCI術后氯吡格雷抵抗發(fā)生的影響因素[OR值分別為1.365，1.409，2.686，2.776，P均<0.001]。詳見表5。

表5 Logistic回歸分析結果

3 討 論

氯吡格雷屬于噻吩吡啶類藥物，本身無生物活性，作用于人體后可與肝臟細胞色素P450酶系統(tǒng)結合而生成具有生物活性的代謝產物，這一代謝產物可抑制血小板膜上的二磷酸腺苷與其受體結合，最終形成抗血小板聚集效應[8-9]。但受個體差異影響，氯吡格雷用藥后部分病人血小板功能無法被有效抑制，即出現(xiàn)氯吡格雷抵抗[10]。文獻報道，氯吡格雷抵抗發(fā)生率為4%～31%[11]。氯吡格雷抵抗誘因多元，如年齡、糖尿病、血小板更新速度等均可導致本現(xiàn)象。本研究中，觀察組年齡≥60歲、TC≥6.0 mmol/L的比例均明顯高于對照組，表明高齡、高血脂與氯吡格雷抵抗密切相關，臨床需加強對高齡及高血脂冠心病病人的用藥管理，積極觀察病人是否有氯吡格雷抵抗現(xiàn)象，并合理調整藥物，避免醫(yī)療資源的浪費。近年來，研究顯示，基因多樣性也是氯吡格雷抵抗現(xiàn)象出現(xiàn)的重要誘因[12]。P2Y12作為氯吡格雷的作用靶點，其基因多態(tài)性被臨床廣泛認為與氯吡格雷抵抗有關[13]。本組研究中，觀察組P2Y12基因rs4244285位點GA+AA基因型比例和等位基因A比例均明顯高于對照組，同時GA+AA基因型病人血小板聚集率降低幅度明顯低于GG基因型病人，可以發(fā)現(xiàn)P2Y12基因rs4244285位點A等位基因突變病人更易出現(xiàn)氯吡格雷抵抗現(xiàn)象，其原因可能與這種突變將導致P2Y12受體蛋白氨基酸中的磷酸腺苷脫氨酶改變，并影響P2Y12受體結構，最終影響P2Y12受體的活化，抑制氯吡格雷的抗血小板聚集作用。有研究將P2Y12受體上的6個位點組成6個單倍型后，發(fā)現(xiàn)單倍型F(rs6787801位點已突變成胞嘧啶C，其余位點為原生狀態(tài))的病人血小板聚集率較單倍型A(rs6787801及rs6801273位點已突變)病人更低，這一定程度上佐證了本研究的結論[14-15]。該學者還認為，rs6787801位于P2Y12基因啟動子區(qū)域，多態(tài)性位點變化將可能通過影響P2Y12基因轉錄活性，來抑制P2Y12受體蛋白翻譯，最終引發(fā)氯吡格雷抵抗現(xiàn)象，而rs4244285位點同樣處于P2Y12受體基因的啟動子區(qū)域。

GPⅢa基因位于人基因17號q21～22帶，多以復合物形成存在，當血小板活化后，GPⅡb/Ⅲa將獲得纖維蛋白原結合能力，并以此誘導血小板聚集，進而參與止血及血栓生成[16]。GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原結合是血栓生成的最后步驟，也是抗血小板聚集藥物的治療靶點[17]。PLA1/PLA2是GPⅡb/Ⅲa上發(fā)現(xiàn)最早的多態(tài)性位點，已有研究顯示，PLA2基因型人群冠心病發(fā)病率顯著高于健康人群[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組GPⅢa基因PLA1/PLA2+PLA2/PLA2基因型和等位基因PLA2比例明顯高于對照組，并且GPⅢa基因PLA1/PLA2+PLA2/PLA2基因型病人血小板聚集率降低幅度明顯低于PLA1/PLA1基因型病人，這表明GPⅢa基因PLA2多態(tài)性與冠心病病人PCI術后氯吡格雷抵抗有關。有研究發(fā)現(xiàn)，47歲以前患心肌梗死的病人，50%攜帶著PLA2等位基因，而年齡相匹配的對照組PLA2攜帶率僅為25%，提示PLA2等位基因突變與年齡有關，同時還是年輕人發(fā)生心肌梗死的影響因素[3]，這也佐證了本研究結論。Logistic回歸分析顯示：年齡、TC、P2Y12基因rs4244285位點GA+AA、GPⅢa基因PLA1/PLA2+PLA2/PLA2是冠心病病人PCI術后氯吡格雷抵抗發(fā)生的影響因素，提示臨床需加強對高齡、高血脂以及P2Y12、GPⅢa基因A及PLA2多態(tài)性的用藥管理工作，觀察病人是否有氯吡格雷抵抗現(xiàn)象，并積極應對。

氯吡格雷是臨床冠心病防治的常規(guī)藥物，而我國逐年增高的冠心病發(fā)病率將使該藥的需求逐年增高，如何合理利用氯吡格雷，避免氯吡格雷抵抗帶來的醫(yī)療資源浪費及經濟負擔已成為臨床研究的又一重點。而P2Y12、GPⅢa基因多態(tài)性篩查工作則可一定程度指導氯吡格雷用藥，避免氯吡格雷浪費情況，但現(xiàn)行的P2Y12、GPⅢa基因多態(tài)性篩查方法推廣難度較大，但這正是需要醫(yī)務人員努力的方向。