李蘭花

我國是乙型肝炎(乙肝)患者和肝炎病毒攜帶人數(shù)最高的國家，且臨床調(diào)查顯示乙肝病毒(HBV)攜帶者占我國總人口10%左右[1-2]。原發(fā)性肝細胞癌是常見的一種惡性腫瘤，其發(fā)生與HBV慢性感染間存在明顯的流行病學關系，嚴重威脅患者生命安全[3-4]。因此，采取及時有效的診斷和治療HBV相關原發(fā)性肝細胞癌方法尤為重要。近年來，外泌體的臨床和機制研究受到重視。外泌體主要是由多種類型細胞分泌的一種小囊泡，外泌體中含豐富的mRNA和蛋白質(zhì)。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是長度超過200nt的一類非編碼RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及表現(xiàn)遺傳調(diào)控等過程。研究報道顯示，LncRNA-結腸癌相關轉(zhuǎn)錄因子1(CCAT1)在多種腫瘤中異常高表達，并且與腫瘤分期及患者預后相關[5-6]。但目前，臨床上尚無有關LncRNA-CCAT1與原發(fā)性肝細胞的相關報道。本研究探討血清外泌體LncRNA-CCAT1表達對HBV相關原發(fā)性肝細胞癌診斷價值，旨在為臨床診斷、治療及預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院于2017年1月至2019年1月收治的HBV相關原發(fā)性肝細胞癌患者79例作為觀察組。納入標準：①依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》[7]中關于HBV診斷標準，且臨床表現(xiàn)、影像學及經(jīng)病理學證實為原發(fā)性肝細胞癌；②預計患者生存期超過3個月者；③患者臨床資料完整，且患者隨訪資料完整；④獲得患者知情同意。排除標準：①甲、丙、丁和戊型肝炎；②其他非乙肝原因引起的肝臟損傷；③合并其他惡性腫瘤者；④嚴重精神疾病者；⑤心、肺、腎功能嚴重異常者。納入的79例患者中，其中，男49例，女30例；年齡43～78歲，平均年齡(62.13±7.68)歲；病程3～21年，平均病程(11.36±3.25)年；平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(23.12±1.26)kg/m2。選擇我院于2017年1月至2019年1月收治的單純HBV患者83例作為對照組，其中，男54例，女29例；年齡45～79歲，平均年齡(62.64±6.54)歲；病程3～20年，平均病程(10.92±3.46)年；平均BMI(22.89±1.30)kg/m2。另選擇我院于2017年1月至2019年1月健康體檢者80例作為正常組，其中，男47例，女33例；年齡41～79歲，平均年齡(62.48±3.65)歲；平均BMI(22.71±1.23)kg/m2。三組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 肝功能檢測 受試者均于清晨空腹采集外周靜脈血3 mL，以2 500 r/min離心半徑10 cm，離心12 min，取上清液(血清標本)，置于-70 ℃保存待測，采用放射免疫法測定谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平，應用Dxc 800TB全自動生化儀及配套試劑盒，嚴格按照試劑盒標準測定。

1.2.2 血清外泌體LncRNA-CCAT1表達 受試者均于清晨空腹采集外周靜脈血3 mL，以2 500 r/min離心半徑10 cm，離心12 min，取上清液(血清標本)，置于-70 ℃保存待測。①總RNA提?。喝〕鰳悠方鈨龊蠹尤隩rizol試劑(北京百奧萊博科技有限公司)，充分混合均勻后加入氯仿，振蕩，以2 500 r/min離心半徑10 cm，離心5 min后取上層無色液體，加入異丙醇充分混合均勻后離心，將上清液棄去，加入焦碳酸二乙酯溶解。②逆轉(zhuǎn)錄準備cDNA：參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)操作說明書進行。③實時熒光定量PCR：參照熒光定量PCR試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)使用說明書，反應條件：95 ℃ 3 min預變性，95 ℃ 30 s變性、58 ℃ 30 s退火、72 ℃ 30 s延伸，共完成35個循環(huán)，繪制熔解曲線分析PCR產(chǎn)物，每孔設置3個復孔，取3個孔平均值，以GAPDH作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt表示相對表達量。LncRNA-CCAT1：上游引物：5′-GCCGTGTTAAGCATTGCGAA-3′，下游引物：5′-AGAGTAGTGCCTGGCCTAGA-3′。

1.3 預后評價

HBV相關原發(fā)性肝細胞癌患者均隨訪至2021年1月31日，以死亡或隨訪末為終點，觀察患者平均生存期，采用電話、微信、門診等方式隨訪。

1.4 觀察指標

①觀察三組肝功能指標變化；②觀察三組血清外泌體LncRNA-CCAT1表達；③采用ROC曲線分析血清外泌體LncRNA-CCAT1對HBV相關原發(fā)性肝細胞癌的診斷；④觀察HBV相關原發(fā)性肝細胞癌預后情況；⑤分析血清外泌體LncRNA-CCAT1與生存相關性。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 三組肝功能變化比較

觀察組血清AST和ALT水平高于對照組和正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且對照組血清AST和ALT水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組肝功能變化比較

2.2 三組LncRNA-CCAT1表達比較

觀察組LncRNA-CCAT1表達高于對照組和正常組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而對照組和正常組LncRNA-CCAT1表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 三組LncRNA-CCAT1表達水平比較

2.3 血清外泌體LncRNA-CCAT1對HBV相關原發(fā)性肝細胞癌預測價值

采用ROC曲線分析血清外泌體LncRNA-CCAT1對HBV相關原發(fā)性肝細胞癌的預測價值，結果顯示，ROC曲線下面積為0.902，最佳截斷值為0.814，見圖1。

圖1 ROC曲線分析LncRNA-CCAT1對HBV相關原發(fā)性肝細胞癌的預測價值

2.4 HBV相關原發(fā)性肝細胞癌預后情況

所有患者均隨訪至2021年1月31日，隨訪12～48個月。平均總生存期為34.52個月(見圖2)。

圖2 HBV相關原發(fā)性肝細胞癌生存分析

2.5 血清外泌體LncRNA-CCAT1與生存時間的

血清外泌體LncRNA-CCAT1與生存呈線性負相關(r=-0.714,P=0.005)。

3 討論

HBV是原發(fā)性肝細胞癌的主要致病病因，高載量的HBV不僅與原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展關系緊密，且是影響原發(fā)性肝細胞治療效果及預后的關鍵因素[8-12]。流行病學調(diào)查顯示，原發(fā)性肝細胞癌發(fā)病率呈不斷上升趨勢，位居惡性腫瘤死亡原因的第3位，嚴重影響人們的生存質(zhì)量[13]。由于原發(fā)性肝細胞癌具有早期診斷困難、惡性程度高、預后差及生存時間等特點，嚴重威脅患者生命安全[14-16]。因此，提高原發(fā)性肝細胞癌的早期診斷率是改善預后及延長患者生存期的有效措施之一。AST和ALT是目前用于診斷HBV及評價肝功能的輔助指標，可反映肝臟內(nèi)的炎癥程度[17]。本文研究表明，觀察組和對照組血清AST和ALT水平高于正常組，由此可見HBV相關原發(fā)性肝細胞癌患者肝功能明顯下降，認為其原因可能是由于HBV相關原發(fā)性肝細胞癌當機體感染易感病毒后除乙肝病毒對肝臟的損傷作用外，肝細胞癌對機體特異性免疫同樣會對肝功能和肝細胞造成嚴重損傷。

外泌體可包含微小RNAs、信使RNA和蛋白質(zhì)，是穩(wěn)定有效的一種細胞信號傳遞和交換方式，并且在外泌體的保護下這些內(nèi)容物不易被降解[17]。LncRNA-CCAT1位于染色體8q24.21 cMyc基因增強子區(qū)域。而其中cMyc可通過與LncRNA-CCAT1啟動子區(qū)域的特定區(qū)域結合，促進癌細胞從G1期進入S期，使細胞獲得無限增殖能力，且可抑制細胞凋亡[18-19]。近年來，多項研究證實，LncRNA-CCAT1與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關[20-21]。甘兆義等[22]學者研究報道顯示，下調(diào)結腸癌細胞中LncRNA-CCAT1表達能夠抑制細胞遷移、增殖，且可誘導凋亡。任瀟凡等[23]學者研究報道顯示，術前收集胰腺癌患者66例與健康體檢者66例作為研究對象，胰腺癌患者血清外泌體LncRNA-CCAT1表達明顯升高，外泌體LncRNA-CCAT1監(jiān)測胰腺癌敏感度為89.4%、特異性為87.9%、準確性為89.4%，且血清外泌體LncRNA-CCAT1過表達與不良預后呈正相關，及為影響不良預后獨立因素。本文研究表明，觀察組LncRNA-CCAT1表達高于對照組和正常組，且與生存呈線性負相關，由此可見HBV相關原發(fā)性肝細胞癌患者血清外泌體LncRNA-CCAT1表達明顯升高，且與預后密切相關，故而其可作為原發(fā)性肝細胞癌診斷及預后評價的有效標志物，但其與原發(fā)性肝細胞癌具體發(fā)病機制尚不十分明確。

綜上所述，血清外泌體LncRNA-CCAT1表達對HBV相關原發(fā)性肝細胞癌具有良好診斷價值，可作為早期篩查原發(fā)性肝細胞癌的一種新型標志物，且與預后密切相關，具有重要研究價值。