鄭嫻嫻,葛魏巍

克羅恩病病(Crohn′s disease,CD)病因未明,可能與環(huán)境因素亦或腸道菌群參與下的免疫紊亂等因素有關(guān)[1]。病情反復，可累及整個消化道，其中30%患者病變僅局限于小腸稱為小腸克羅恩病病(small bowel Crohn′s disease,SBCD)[2]，目前尚無根治的方法。近年來，由于多種檢查方法的應用[3-6]，小腸克羅恩病的早期診斷率有所提升，然而對于非穿孔或非狹窄的小腸克羅恩病早期發(fā)現(xiàn)率仍較低[7]。因此，如果能從分子水平揭示疾病發(fā)生的機制，尋找分子治療靶點，并為疾病的診斷提供分子標志物，將會大大提高患者生活質(zhì)量[8]。本研究挖掘GEO數(shù)據(jù)庫中有關(guān)小腸克羅恩病的相關(guān)數(shù)據(jù)，利用生物信息學方法構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控，并篩選關(guān)鍵致病基因，從分子水平上探尋小腸克羅恩病的發(fā)病機制并為分子治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 資料來源

GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncb i.nlm.nih.gov/geo/)收錄了世界各國研究機構(gòu)提交的高通量基因表達數(shù)據(jù)。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中檢索克羅恩病的表達譜芯片，選取小腸黏膜及正常小腸黏膜的表達數(shù)據(jù)，最終選定GSE102127用于差異表達miRNA(DEMs)的篩選、GSE20881、GSE75214、GSE102133經(jīng)數(shù)據(jù)融合及批次校正后用于篩選差異表達基因(DEGs)及診斷效能分析，數(shù)據(jù)集對應的檢測平臺及樣本數(shù)見表1。GEO數(shù)據(jù)完全公開，因此本研究無需倫理委員會審查。

表1 GEO數(shù)據(jù)庫樣本

1.2 研究路線

1.3 生物信息學分析

1.3.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異分析及可視化 GSE102127數(shù)據(jù)集利用GEO數(shù)據(jù)庫的在線分析軟件，設定過濾條件adj.P.Val<0.05且|logFC|>1，篩選DEMs。GSE20881、GSE75214、GSE102133三個數(shù)據(jù)集首先進行融合，經(jīng)批次校正后利用perl軟件(https://www.perl.org/)將探針I(yè)D轉(zhuǎn)換為對應的基因名稱；采用R語言(https://www.r-project.org/)的“l(fā)imma”包進行DEGs的篩選，設定過濾條件為adj.P.Val<0.05且|logFC|>2，并后續(xù)進行GO (Gene Ontology) 富集和 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書) 富集分析。

圖1 研究路線圖

1.3.2 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡構(gòu)建 利用FunRich(version 3.1.3 http://www.funrich.org/)軟件對差異表達的miRNA進行靶基因預測，篩選出符合以下條件的miRNA及mRNA進行調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建：①miRNA及mRNA在各自數(shù)據(jù)集中均差異表達；②miRNA及mRNA呈負相關(guān)。調(diào)控網(wǎng)絡利用Cytoscape(https://cytoscape.org/)軟件進行可視化。

1.3.3 功能注釋及可視化 融合后的數(shù)據(jù)集中DEGs利用R語言進行GO富集和 KEGG通路功能注釋。GO 富集分為分子生物學功能(molecular function, MF)、生物學過程(biological process, BP)和細胞學組分(cellular components, CC)三大類。KEGG 是一個整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的綜合數(shù)據(jù)庫，被廣泛用于基因通路的富集注釋。設置篩選參數(shù)為Pvalue cutoff =0.05且q value cutoff = 0.05為具有統(tǒng)計學意義。

1.3.4 關(guān)鍵基因篩選及診斷效能分析 將融合后的數(shù)據(jù)集中DEGs通過String(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫進行分子蛋白互作網(wǎng)絡分析，并將網(wǎng)絡結(jié)果導入Cytoscape軟件(版本號3.9.0)，基于“cytohubba”模塊中“Degree”、“MCC”、“Betweenness”算法篩選排名前10的關(guān)鍵基因，取交集后得到關(guān)鍵基因，并通過ROC曲線分析關(guān)鍵基因的診斷效能。

1.4 統(tǒng)計學分析

利用受試者工作特征曲線評價關(guān)鍵基因?qū)π∧c克羅恩病的診斷效能，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果

GSE3102127數(shù)據(jù)集經(jīng)在線分析后得到DEMs15個，9個表達上調(diào)，6個表達下調(diào)。經(jīng)FunRich軟件預測后得到2699個可能調(diào)控的靶基因。GSE20881、GSE75214、GSE10213三個數(shù)據(jù)集經(jīng)融合及批次校正后，利用R語言“l(fā)imma”包篩選出DEGs 273個，其中上調(diào)基因66個，下調(diào)基因207個，具體見圖2。

2.2 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡構(gòu)建結(jié)果

基于miRNA-mRNA 負向調(diào)控原理，結(jié)合FunRich軟件預測結(jié)果，本研究共篩選出38個調(diào)控軸用于調(diào)控網(wǎng)絡構(gòu)建，其中miRNA 11個，mRNA34 個，調(diào)控網(wǎng)絡構(gòu)建結(jié)果見圖3。

2.3 差異表達基因功能注釋結(jié)果

將273個DGEs進行功能注釋分析，GO富集在白細胞遷移、中性粒細胞遷移等生物過程；KEGG富集注釋表明差異基因主要參與IL-17、腫瘤壞死因子等信號通路，見圖4，圖5。

圖2 差異表達mRNA火山圖，紅色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)

圖3 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡，三角代表miRNA，圓形代表mRNA，紅色表示上調(diào)，黃色表示下調(diào)

圖4 GO富集結(jié)果

2.4 關(guān)鍵基因篩選及診斷效能分析

將273個差異表達的mRNA 導入String網(wǎng)站，進行蛋白互作網(wǎng)絡分析，最低互動分數(shù)>0.700時共得到157個節(jié)點，538條邊，具體見圖6。將String網(wǎng)站數(shù)據(jù)導入Cytoscape軟件，cytoHubba模塊下基于“Degree”、“MCC”、“Betweenness”算法篩選排名前10的關(guān)鍵基因，取交集后得到4個關(guān)鍵基因(圖7)，分別為IL6、IL1B、MMP9 及ICAM1。受試者工作特征曲線分析以上4個關(guān)鍵基因中僅MMP9可用于診斷小腸克羅恩病，其P值為0.025，AUC為0.361，敏感性100%，特異性31%，具體見圖8。

圖5 KEGG富集結(jié)果

圖6 DEGs蛋白互作網(wǎng)絡圖

圖7 關(guān)鍵基因篩選結(jié)果

3 討論

SBCD缺乏特異性臨床表現(xiàn)，同時小腸鏡檢查普及程度不一，因此患者從癥狀出現(xiàn)到發(fā)現(xiàn)病灶歷時較長，診斷較為困難[9-10]。目前，有關(guān)SBCD的發(fā)病機制尚不明確，可能與免疫功能紊亂、遺傳、環(huán)境等因素等有關(guān)，治療上仍缺乏有效藥物[11]。因此，從分子水平探究小腸克羅恩病的發(fā)病機制及尋找治療靶點是目前研究的一個方向[12-14]。本研究借助生物信息學技術(shù)，分析了GEO數(shù)據(jù)庫中有關(guān)CD小腸黏膜轉(zhuǎn)錄組表達數(shù)據(jù)。研究結(jié)果表明miRNA及mRNA在正常小腸黏膜及病變黏膜組織中均差異表達。為增加致病基因篩選的可信性，我們將3個mRNA數(shù)據(jù)集進行融合，擴大樣本量，經(jīng)R語言處理后篩選出DEGs 273個，其中上調(diào)基因66個，下調(diào)基因207個，聯(lián)合miRNA篩選結(jié)果我們成功構(gòu)建出38個調(diào)控軸，為SBCD的分子調(diào)控研究提供了理論依據(jù)。

圖8 IL6、IL1B、MMP9 、ICAM1診斷小腸克羅恩病ROC曲線

針對273個DEGs，我們進行了GO富集分析，注釋結(jié)果表明DEGs參與了白細胞遷移、中性粒細胞遷移、細胞趨化性等生物過程。白細胞遷移是啟動炎癥免疫反應的重要的步驟之一，過程相當復雜。在體內(nèi)，通過抑制白細胞遷移有望治療炎癥性腸病/克羅恩病、多發(fā)性硬化癥和類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。既往研究同樣表明克羅恩病患者中性粒細胞遷移受損與趨化因子的產(chǎn)生減少有關(guān)，通過粒細胞集落刺激因子治療后病情有所緩解[15]。而KEGG注釋則表明DEGs參與IL-17、腫瘤壞死因子(TNF)、類風濕性關(guān)節(jié)炎等信號通路。IL17細胞因子家族由6個配體組成，IL17A到IL17F，是Th17細胞產(chǎn)生的關(guān)鍵細胞因子。IL17信號通路能夠誘導TNF、IL22、IL1β和脂多糖等促炎分子的產(chǎn)生，從而導致黏膜免疫系統(tǒng)的過度激活和異常的細胞因子反應[16]。TNF是由157個氨基酸亞基組成的同源三聚體，主要由活化的巨噬細胞以可溶性或跨膜形式產(chǎn)生，通過與兩個膜受體TNFR1和TNFR2的相互激發(fā)來發(fā)揮作用。在炎癥過程中，TNF是炎癥級聯(lián)反應后期的關(guān)鍵介質(zhì)。除了促炎功能，TNF在維持腸道菌群與黏膜免疫系統(tǒng)之間的穩(wěn)態(tài)平衡中同樣發(fā)揮作用，積極參與腸道屏障功能[17]。在炎癥過程的早期階段，TNF對腸道黏膜有保護作用，而在疾病的晚期階段，TNF則發(fā)揮促炎作用[18-19]。以上情況表明DEGs在腸道菌群平衡、腸黏膜屏障功能及腸道免疫等方面參與了小腸克羅恩病的發(fā)生發(fā)展過程。

我們通過String網(wǎng)站對差異表達的mRNA 進行蛋白互作網(wǎng)絡分析，最低互動分數(shù)>0.700時共得到157個節(jié)點，538條邊，經(jīng)Cytoscape軟件，篩選出IL6、IL1B、MMP9 及ICAM1為關(guān)鍵基因。IL6、IL1B作為炎性細胞因子和炎性反應介質(zhì)，可破壞腸黏膜屏障，導致腸黏膜腸黏膜滲出、增生，組織損傷[20-21]。在動物模型中，抗 IL-6R 單克隆抗體通過抑制血管內(nèi)皮粘附分子表達而用于治療腸道炎癥性疾病[22]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP 9)是一種依賴金屬鋅離子的金屬酶，主要來源于單核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和成纖維細胞，具有降解細胞外基質(zhì)和觸發(fā)炎癥等作用。既往多項研究發(fā)現(xiàn)MMP9水平升高與CD患者的疾病活動密切相關(guān)，可用于評估疾病活動程度[23-24]。細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)，屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族中的一員，是介導黏附反應的一個重要黏附分子，在促進炎癥部位黏連、調(diào)節(jié)機體免疫反應中起重要作用。通過與其受體的特異性結(jié)合，增強炎癥細胞與內(nèi)皮細胞間的黏附作用，促使炎性細胞向炎癥部位遷移，參與CD的腸道炎癥過程。國內(nèi)學者研究發(fā)現(xiàn)CD 患者血漿中ICAM-1水平與疾病嚴重程度密切相關(guān)，與年齡、病變部位等臨床特征無明顯關(guān)聯(lián)[25]。

本研究篩選的4個關(guān)鍵基因均參與了SBCD的發(fā)生、發(fā)展的過程，證實了利用生物信息學技術(shù)尋找疾病相關(guān)致病基因的可行性。由于SBCD早期診斷相對困難，為進一步探討關(guān)鍵基因能否早期診斷SBCD，我們利用ROC曲線分析其診斷效能，ROC結(jié)果顯示4個關(guān)鍵基因中僅MMP9可用于SBCD的診斷，其P值為0.025。然而MMP9的診斷效能偏低，其AUC為0.361，且特異性欠佳，僅為31%。從ROC分析結(jié)果可以看出目前SBCD的診斷很大程度上仍取決于臨床醫(yī)師的經(jīng)驗及膠囊內(nèi)鏡、氣囊輔助小腸鏡等輔助檢查，從分子水平上尋找SBCD早期診斷生物標志物仍是未來我們研究的方向。

綜上所述，我們利用多芯片聯(lián)合分析的方法篩選了SBCD患者DEGs，這些差異基因在腸道菌群失衡、腸黏膜屏障功能、炎性細胞遷移及腸道免疫等方面參與了小腸克羅恩病病的發(fā)生發(fā)展過程。雖然目前差異基因尚無法作為SBCD診斷的分子標志物，然而我們構(gòu)建的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡為SBCD的分子治療提供了理論依據(jù)及未來可能的分子靶點，以期從分子水平上達到治愈SBCD的目的。