于嬪，朱蔚遠，彭文斌，范月娥，王躍平

胃癌是最為常見的消化道癌癥，流行病學研究發(fā)現(xiàn)，2018年共有782 685例胃癌患者死亡，占所有癌癥死亡人數(shù)的8.2%，是全球癌癥死亡的第三大原因[1-3]，嚴重威脅患者身心健康[4]。我國胃癌早期診斷率不到10%，遠低于發(fā)達國家。因此，尋找早期指示胃癌發(fā)展的生物標志物對胃癌早期診斷及時治療具有重要臨床意義[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，肌動蛋白細胞骨架網(wǎng)絡在腫瘤細胞遷移、侵襲中起重要作用，成束蛋白1(Fascin1，F(xiàn)SCN1)是一種與肌動蛋白結(jié)合的細胞骨架蛋白，參與內(nèi)皮細胞纖足形成，促進內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移[7-8]。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SCN1在胃癌組織中表達上調(diào)，受Notch1信號通路調(diào)控參與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移過程[9-10]。越來越多的研究認為，細胞骨架改變對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起促進作用[11]。本研究通過檢測胃癌患者腫瘤組織中FSCN1蛋白的表達水平，探究其與胃癌發(fā)展及預后的關(guān)系，分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2015年12月我院手術(shù)切除的82例胃癌患者，術(shù)中取得胃癌組織標本82例及癌旁正常胃黏膜組織標本63例，所有患者組織標本均經(jīng)病理檢查證實為胃癌。所有患者均為首次治療，術(shù)前均未行放療、化療或其他抗腫瘤治療，臨床病理資料及隨訪資料完整。所有患者均自愿簽署知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是一個由北京大學開發(fā)的數(shù)據(jù)庫，是基于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)的數(shù)據(jù)分析及可視化的網(wǎng)站，可實現(xiàn)相關(guān)癌癥基因的生物標志物鑒定、表達圖譜分析、生存預后分析等。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫，對FSCN1 mRNA在胃癌組織及正常胃黏膜組織中表達差異進行比較。

1.2.2 免疫組化法檢測胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中FSCN1蛋白表達 將石蠟組織標本以4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化處理，采取免疫組化EnVision兩步染色法檢測FSCN1蛋白表達情況，操作均由檢驗科同一名經(jīng)驗豐富的醫(yī)師嚴格按照試劑盒說明書步驟進行。一抗采用兔抗人FSCN1抗體(購自美國Sigma公司)，即用型二抗購自北京索萊寶科技有限公司。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片后觀察。用已知陽性切片標本為陽性對照，陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗制成。

結(jié)果判定標準：①按染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，黃色或黃棕色為2分，棕褐色為3分；②按陽性細胞所占比例評分：無陽性細胞記0分，陽性細胞所占比例<25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。兩種評分方法得分的乘積為最終結(jié)果，以最終結(jié)果>2分定義為表達陽性(+)，≤2分定義為表達陰性(-)；同時定義最終結(jié)果≥3分為高表達，<3分為低表達。

1.2.3 隨訪 胃癌患者術(shù)后均以電話或門診方式進行隨訪，隨訪起始日期為術(shù)后第一個月，截止日期為2020年12月或患者死亡。第1～2年每1～3個月隨訪一次，第3～4年每6個月隨訪一次，之后每年隨訪一次。記錄胃癌患者預后情況，分析FSCN1蛋白表達水平與患者生存時間的關(guān)系。

1.2.4 FSCN1共表達基因互作分析 基于Coexpedia數(shù)據(jù)庫(https://www.coexpedia.org/)分析FSCN1共表達基因互作關(guān)系，選取共表達的對數(shù)似然分數(shù)(Log likelihood score，LLS)，基因?qū)Π凑誔earson相關(guān)系數(shù)的降序排列，計算每個bin的LLS。

1.2.5 FSCN1共表達基因的富集分析 使用R3.6.3軟件中的clusterProfiler包進行共表達基因的富集分析，并利用Enrichr(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr)在線分析工具進行GO功能注釋和KEGG通路分析，分析FSCN1參與的生物學功能、信號通路等內(nèi)容。

1.2.6 FSCN1表達與胃癌患者免疫細胞浸潤的相關(guān)性分析 利用TCGA數(shù)據(jù)庫下載數(shù)據(jù)，分析胃癌患者FSCN1表達與免疫細胞浸潤之間的關(guān)系。利用R3.6.3軟件中的GSVA包繪圖，并以ssGSEA算法評估腫瘤細胞免疫浸潤程度。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 FSCN1 mRNA在胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達水平

利用TCGA數(shù)據(jù)庫比較408例胃癌組織和211例正常胃黏膜組織中FSCN1 mRNA的表達情況，結(jié)果顯示FSCN1 mRNA胃癌組織中表達顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1。

圖1 FSCN1 mRNA在胃癌組織及正常胃黏膜組織中的表達水平

2.2 免疫組化結(jié)果分析

免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)SCN1主要定位于細胞質(zhì)，見圖2。FSCN1蛋白在胃癌組織中的陽性表達率為60.98%(50/82)，明顯高于正常胃黏膜中的19.05%(12/63)(P<0.05)，見表1。

圖2 免疫組化結(jié)果(SP，×400)

表1 FSCN1蛋白在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的陽性表達情況 n(%)

2.3 FSCN1蛋白表達水平與胃癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

結(jié)果顯示，F(xiàn)SCN1蛋白表達水平與胃癌患者年齡、性別、腫瘤位置無關(guān)(P>0.05)，與患者TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 FSCN1蛋白表達水平與胃癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 [n(%)]

2.4 生存分析

圖3 FSCN1蛋白表達水平與胃癌患者生存時間的關(guān)系

2.5 影響胃癌患者預后的多因素Cox回歸分析

多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FSCN1蛋白高表達是影響胃癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 影響胃癌患者預后的多因素Cox回歸分析

2.6 FSCN1共表達基因互作分析

本研究共分析FSCN1與303個基因的互作關(guān)系，根據(jù)LLS評分分析，相關(guān)性較強的前10個基因分別為APOE、ZYX、HOMER3、AXL、RBM42、ARHGDIA、ITGA3、PMAIP1、COL4A1、TP53，見表4。

表4 FSCN1共表達基因分析

2.7 FSCN1共表達基因的富集分析

FSCN1共表達基因主要參與細胞外基質(zhì)組織、白細胞遷移、血小板活化、白細胞增殖、淋巴細胞增殖等生物學過程，富集到的主要通路包括黏著斑、阿米巴病、ECM-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、Hippo信號通路、病毒性心肌炎、細胞間黏附分子等信號通路。見圖4。

圖4 FSCN1共表達基因通路的富集分析

2.8 FSCN1表達與胃癌患者免疫細胞浸潤的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，F(xiàn)SCN1表達與NK細胞、Tem細胞、浸潤性樹突狀細胞(iDC)、巨噬細胞(Macrophages)、樹突狀細胞(DC)、Th1細胞、肥大細胞(Mast cells)、漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)、Tgd細胞、中性粒細胞(Neutrophils)、NK CD56dim細胞、濾泡輔助性T細胞(TFH)均呈正相關(guān)(r=0.408、0.259、0.230、0.222、0.195、0.174、0.171、0.167、0.156、0.142、0.139、0.129，P均<0.05)，與調(diào)節(jié)性T細胞(TReg)、中央記憶型T細胞(Tcm)、NK CD56bright細胞、嗜酸性粒細胞(Eosinophils)、B細胞、CD8 T細胞、自體樹突狀細胞(aDC)、細胞毒性細胞(Cytotoxic cells)、T細胞、Th2細胞均無明顯相關(guān)性(r=0.099、0.095、0.080、0.060、0.054、0.049、0.043、0.037、-0.022、-0.022，P均>0.05)；與輔助性T細胞(T helper cells)、Th17細胞均呈負相關(guān)(r=-0.145、-0.188，P均<0.05)。見圖5。

圖5 FSCN1表達與胃癌患者免疫細胞浸潤的相關(guān)性

3 討論

FSCN1是一種55KD的單鏈肌動蛋白絲結(jié)合蛋白，與腫瘤活動進展和腫瘤細胞活動性有關(guān)，可調(diào)節(jié)細胞表面的絲狀偽足、片狀偽足和微穗狀突起的形成，通過典型的Smad依賴通路促進細胞遷移、運動[12-13]。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SCN1在多種惡性腫瘤如結(jié)直腸癌[14]、前列腺癌[15]、腎細胞癌[16]中表達上調(diào)，參與腫瘤進展，并與患者預后不良有關(guān)[17]。Wang等[18]研究報道稱，F(xiàn)SCN1在胃癌細胞系及胃癌組織中的表達量高于正常細胞及正常胃黏膜組織，且隨細胞分化程度降低而表達增加，體外實驗證實沉默F(xiàn)SCN1基因可抑制胃癌細胞遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物的表達，提示FSCN1可能在胃癌中發(fā)揮癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中FSCN1蛋白的陽性表達率明顯高于癌旁正常黏膜組織，與Wang等[18]報道一致，表明FSCN1可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。分析患者臨床病理資料發(fā)現(xiàn)，胃癌患者TNM分期越重、分化程度越低，F(xiàn)SCN1蛋白高表達人數(shù)所占比例越大，并且FSCN1蛋白高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明FSCN1可能參與胃癌增殖、分化、遠處轉(zhuǎn)移作用。生存分析顯示，F(xiàn)SCN1高表達患者5年累積生存率及中位生存時間均低于低表達患者，與一項薈萃分析[19]結(jié)果一致，表明FSCN1可能作為胃癌發(fā)生、進展及預后的潛在標志物。最后，Cox回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)SCN1蛋白高表達是影響胃癌患者預后的獨立危險因素，表明FSCN1蛋白高表達患者預后不良風險增加，可能成為指示胃癌患者病情發(fā)展及預后的潛在生物指標。

既往研究發(fā)現(xiàn)[20-22]，F(xiàn)SCN1與多種腫瘤細胞的增殖分化、黏附、轉(zhuǎn)移侵襲及免疫反應等方面有一定關(guān)聯(lián)。本研究利用Coexpedia數(shù)據(jù)庫共預測與FSCN1共表達的基因303個，且富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SCN1共表達基因主要參與細胞外基質(zhì)組織、白細胞遷移、血小板活化、白細胞增殖、淋巴細胞增殖等生物學過程，富集到的主要通路包括黏著斑、阿米巴病、ECM-受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、Hippo信號通路、細胞間黏附分子等信號通路[23]。進一步提示FSCN1可能參與胃癌的發(fā)展過程。由于腫瘤發(fā)展存在復雜的微環(huán)境改變，而抗腫瘤的療效與自身免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，因此通過分析腫瘤免疫系統(tǒng)可在一定程度上幫助癌癥患者的免疫治療[24-25]。本研究利用利用TCGA數(shù)據(jù)庫及R3.6.3軟件，分析胃癌患者FSCN1表達與免疫細胞浸潤之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FSCN1表達與NK細胞、Tem細胞、浸潤性樹突狀細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、Th1細胞、肥大細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、Tgd細胞、中性粒細胞、NK CD56細胞、濾泡輔助性T細胞均呈正相關(guān)，與輔助性T細胞、Th17細胞均呈負相關(guān)。提示FSCN1表達與NK細胞、輔助性T細胞等多種免疫細胞的浸潤程度密切相關(guān)，其可能在胃癌免疫治療方面具有重要的研究價值。

綜上所述，胃癌組織中FSCN1蛋白高表達，其表達水平與胃癌患者TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是指示腫瘤發(fā)生發(fā)展及患者預后的潛在標志物，有望成為胃癌免疫治療的新靶點。FSCN1的差異表達可能與細胞骨架改變有關(guān)，可能在胃癌細胞侵襲過程中發(fā)揮重要作用，值得進一步細胞實驗或動物實驗研究。