陳凱銳,余誠,林楚妹,童華生,鄭于劍

近年來，我國原發(fā)性肝癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，化療是肝癌最常見的治療方式，但某些肝癌患者對化療藥物的耐藥性強(qiáng)，導(dǎo)致化療藥物抵抗。肝癌細(xì)胞存在化療耐藥性，是肝癌患者化療失敗的主要原因[1-2]。MicroRNAs(miRNAs)是一類高度保守序列的內(nèi)源性非編碼RNAs，近年來，miRNAs被證實廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種生命活動，miRNAs可通過多種途徑介導(dǎo)腫瘤耐藥[3-4]。miR-340是腫瘤干細(xì)胞重要微小RNA成員之一，有研究表示[5-6]，miR-340在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織內(nèi)呈低表達(dá)，而過表達(dá)miR-340能抑制細(xì)胞增殖、侵襲及遷移。

驅(qū)動蛋白家族成員14(kinesin family14,KIF14)是潛在致癌基因，KIF過表達(dá)將增加有絲分裂出錯率，導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常，參與各種惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制[7]。劉瓊等[8]研究表示，干擾KIF14會抑制子宮內(nèi)膜癌順鉑耐藥細(xì)胞shikawa/DDP增殖，促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡，減輕細(xì)胞對順鉑的耐藥性。TargetScan在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-340-3’ UTR上存在KIF14的結(jié)合位點，為研究miR340與KIF14之間的靶向關(guān)系，以及miR340與肝癌耐藥性之間的關(guān)系，我院開展如下研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料及儀器

1.1.1 細(xì)胞株 人肝癌耐藥細(xì)胞HepG2/CDDP與親本細(xì)胞HepG2細(xì)胞均購自醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞庫。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國GIBICO公司，胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、均購自杭州昊天生物工程，KIF14模擬物(mimics-KIF14)及陰性對照物、miR-340小干擾RNA(si-MiR-340)及陰性對照(si-NC)、miR-340模擬物(mimics-miR-340)及陰性對照均由上海吉凱基因公司提供。Trizol試劑及LipofectamineTM200試劑盒購自美國Invitrogen公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司提供，KIF14兔多克隆抗體、P-gp兔多克隆抗體、GST-π兔多克隆抗體均購自英國Abcam公司， BCA蛋白檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司，雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promerga公司， 細(xì)胞凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物股份有限公司。

1.1.3 實驗儀器及耗材 TS100型倒置相差顯微鏡購自Nikon公司，DYY-5型電泳儀、電泳槽均購自北京六一儀器廠，光學(xué)顯微鏡購自日本OlymPus公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI，PCR儀購自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇HepG2/CDDP與親本細(xì)胞HepG2，使用含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2濃度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%左右，吸棄培養(yǎng)基，加入適量PBS清洗細(xì)胞，吸棄PBS，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期生長的HepG2/CDDP細(xì)胞，調(diào)節(jié)濃度為2.5×104個/mL，每2.5 mL接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞融合至60%時，更換為無FBS的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染操作按照LipofectamineTM200試劑盒相關(guān)步驟進(jìn)行。轉(zhuǎn)染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細(xì)胞分組處理 HepG2、HepG2/CDDP細(xì)胞均使用含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基干預(yù)48 h，HepG2轉(zhuǎn)染si-miR-340、si-NC，HepG2/CDDP轉(zhuǎn)染mimics-miR-340、mimics-NC，HepG2/CDDP細(xì)胞共轉(zhuǎn)染mimics-miR-340與mimics-KIF14、mimics-miR-340與mimics-NC。將其分別標(biāo)記為HepG2+si-miR-340組、HepG2+si-NC組、DDP+mimics-miR-340組、DDP+mimics-NC組、DDP+mimics-miR-340+mimics-FIK14組及DDP+mimics-miR-340+mimics-NC-FIK1組，未經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的HepG2及HepG2/CDDP細(xì)胞分別標(biāo)記為control 1組及control 2組。

1.2.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) Trizol試劑提取HepG2/CDDP及親本細(xì)胞HepG2內(nèi)總RNA，微量核酸儀檢測RNA濃度及純度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系20 μL，包括：Labeling buffer 8 μL、Fluorescent label C3TM 2 μL、Fluorescent label C5TM 2 μL、Labeling enzyme 2 μL、RAN 5 μg、DDH20 1 μL。以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸30 s。引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt計算miR-340及KIF14的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.5 流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×104個/mL，每孔1 mL接種于24孔板內(nèi)，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)48 h，加入胰蛋白酶，收集細(xì)胞，取1.0×106個細(xì)胞，加入適量PBS清洗細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min，吸棄PBS，加入400 μL結(jié)合緩沖液，輕輕吹打，細(xì)胞混懸后，加入10 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min，加入5 μLPI，室溫避光孵育5 min，最后加入100 μL結(jié)合緩沖液，混勻后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖情況。

1.2.6 MTT檢測細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×104個/mL，每孔200 μL接種于96孔板內(nèi)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)結(jié)束后每孔內(nèi)加入20 μL MTT溶液(濃度5 g/L)，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜，輕輕震蕩混勻，在酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度值(A)，重復(fù)測量3次，計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.6 蛋白印跡(Western Blot)法檢測細(xì)胞內(nèi)耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入胰蛋白酶，收集細(xì)胞，取1.0×106個細(xì)胞，加入適量PBS清洗細(xì)胞，RIPA細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取適量蛋白溶液，沸水浴中煮沸5 min，蛋白變性后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳，蛋白上樣為每泳道30 μg，電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜后置于5%脫脂牛奶中封閉1 h，分別加入miR-340(1 ∶2 000)、KIF14多克隆抗體(1 ∶5 000)、P-gp(稀釋度1 ∶4 00)、GST-π(稀釋度1 ∶200)抗體，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(稀釋度1 ∶200)，室溫孵育2 h，滴加ELC顯影液，避光顯影后凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，以GAPDH為內(nèi)參，Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測miR-340的靶向基因 StarBase預(yù)測顯示miR-340與KIF14之間存在結(jié)合位點，分別構(gòu)建野生型WT-miR-340與突變型載體MUT-miR-340，分別將WT-miR-34與MUT-miR-340共轉(zhuǎn)染至HepG2/CDDP細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后，檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HepG2/CDDP及親本細(xì)胞內(nèi)miR-340及KIF14 RNA表達(dá)水平比較

與親本細(xì)胞(HepG2)相比，HepG2/CDDP細(xì)胞株內(nèi)miR-340 RNA表達(dá)量低，KIF14 RNA表達(dá)量高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 HepG2/CDDP及親本細(xì)胞內(nèi)miR-340及KIF14 RNA表達(dá)水平比較

2.2 抑制miR-340提高HepG2細(xì)胞耐藥性

與control1組及si-NC組相比，轉(zhuǎn)染si-miR-340將下調(diào)HepG細(xì)胞內(nèi)miR-340水平，細(xì)胞凋亡減少，藥物對細(xì)胞的IC50值增大，耐藥相關(guān)蛋白P-糖蛋白(P-gp)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶π(GST-π)蛋白表達(dá)上升(P<0.05)，見表3、4，圖1。

表3 抑制miR-340對HepG2細(xì)胞凋亡及IC50值的影響

表4 抑制miR-340對HepG2細(xì)胞內(nèi)P-gp及GST-π蛋白的影響

注：與control組比較，aP<0.05，與si-NC組比較，bP<0.05。

2.3 過表達(dá)miR-340降低HepG2/CDDP細(xì)胞耐藥性

與mimics-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-340 mimics的HepG2/CDDP細(xì)胞內(nèi)miR-340水平上調(diào)，細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡增多，藥物對細(xì)胞的IC50值降低，耐藥相關(guān)蛋白P-gp及GST-π水平下降(P<0.05)見表5、6。

表5 過表達(dá)miR-340對HepG2/CDDP細(xì)胞凋亡率及IC50值的影響

表6 過表達(dá)miR-340對HepG2/CDDP細(xì)胞內(nèi)P-gp及GST-π蛋白的影響

2.4 miR-340靶向負(fù)調(diào)控KIF14

熒光素基因?qū)嶒烌炞CmiR-340與KIF14的靶向性，見圖3。發(fā)現(xiàn)與mimics-NC組相比，KIF14組共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T miR-340的熒光素酶活性降低，而共轉(zhuǎn)染MUT-miR340的熒光素酶活性無明顯改變，見表7。說明miR-340靶向負(fù)調(diào)控KIF14。

注：與control組比較，aP<0.05，與mimics組比較，bP<0.05; 組1為Control2組，組2為mimics--NC組，組3為mimics--miR-340組。

圖3 miR-340與KIF14的核苷酸序列含有連續(xù)互補的結(jié)合位點

表7 雙熒光素酶報告實驗

2.5 過表達(dá)KIF14逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-340對HepG2/CDDP細(xì)胞耐藥性的影響

HepG2/CDDP+mimics-miR-340+mimics-KIF14組細(xì)胞凋亡率較HepG2/CDDP+mimics-miR-340+mimics-NC-KIF14組細(xì)胞凋亡率下降，藥物對細(xì)胞的IC50值上升，耐藥相關(guān)蛋白P-gp及GST-π水平上升，見表8、9。

表8 過表達(dá)KIF14逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-340對HepG2/CDDP細(xì)胞凋亡及IC50值的影響

表9 過表達(dá)KIF14逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-340對HepG2/CDDP細(xì)胞內(nèi)P-gp及GST-π蛋白的影響

注：組1為DDP+mimics-miR-340+mimics-NC-KIF14組，組2為DDP+mimics-miR-340+mimics-KIF14組。

3 討論

化療是復(fù)發(fā)肝癌及晚期肝癌治療的主要手段，鉑類及紫杉醇聯(lián)合化療方案是臨床肝癌化療的常見方案，順鉑化療通過干擾癌細(xì)胞DNA復(fù)制及細(xì)胞代代謝發(fā)揮抑癌作用[9-13]。但耐藥細(xì)胞的存在將嚴(yán)重影響肝癌化療療效，是降低肝癌患者預(yù)后的主要原因。

研究肝癌耐藥相關(guān)機(jī)制，是改善細(xì)胞耐藥，提高肝癌化療效果的有效前提。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為，干細(xì)胞是惡性腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的根源，也是化療抗性的重要原因。miR-340是腫瘤干細(xì)胞中重要的miRNA成員之一，有研究表示，miR-340能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。Zhang Z還有研究發(fā)現(xiàn)[20]，Circ-CH13L1.2能通過敲低miR-340-5p-LPAATβ軸，降低骨肉瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性。提示miR-340不僅參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等生理活動，還可能調(diào)控腫瘤的耐藥性，推測miR-340可能參與肝細(xì)胞耐藥機(jī)制[14-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與親本HepG2細(xì)胞相比，HepG2/CDDP耐藥株內(nèi)miR-340表達(dá)量更低，KIF14表達(dá)量更高。說明耐藥肝癌細(xì)胞內(nèi)miR-340及KIF14表達(dá)量異常。P-gp及GST-π是腫瘤耐藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，P-gp是一種多藥耐藥基因編碼的跨膜糖蛋白，可通過泵出腫瘤內(nèi)化療藥物發(fā)揮耐藥作用，GST-π主要通過降解藥物、減弱化療藥物對腫瘤的殺傷作用，促進(jìn)腫瘤耐藥。與control組及si-NC組相比，抑制親本細(xì)胞內(nèi)miR-340表達(dá)后，其凋亡率下降、IC50值、耐藥性蛋白P-gp及GST-π表達(dá)水平均上升，提示抑制miR-340將增加HepG2細(xì)胞的耐藥性。而過表達(dá)miR-340將提高HepG2/CDDP細(xì)胞凋亡率，降低IC50值及P-gp、GST-π蛋白表達(dá)水平，說明過表達(dá)miR-340將逆轉(zhuǎn)肝癌耐藥細(xì)胞的耐藥性，提高其化療敏感性。

雙熒光素酶實驗表明，miR-340可逆向調(diào)節(jié)KIF14。KIF14屬于血管依賴性細(xì)胞骨架運動蛋白驅(qū)動蛋白3超家族成員，其位于染色體1q32.1上，參與細(xì)胞質(zhì)分裂，是一種潛在致癌基因，在多種惡性腫瘤中被激活，并能作用于周期蛋白D1與P27，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18-21]。Zhu Q[22]等研究發(fā)現(xiàn)，沉默KIF14可逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞對索拉非尼的獲得性耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)KIF14可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-340對HepG2/CDDP細(xì)胞增殖及凋亡的影響，降低細(xì)胞凋亡率，提高IC50值及凋亡蛋白P-gp及GST-π蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，耐藥肝癌細(xì)胞株內(nèi)miR-340表達(dá)量下降，KIF14表達(dá)量上升，F(xiàn)IK14是miR-340的靶基因，miR-340能靶向FIK14，逆轉(zhuǎn)肝癌HepG2/CDDP對順鉑的耐藥性。