鞏婧婷，王遠(yuǎn)，李先義，羅瑞峰，張金磊，羅小玲

新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測(cè)試中心（石河子 832000）

球蟲病是一種有極強(qiáng)傳染性的腸道寄生蟲病[1-2]，由于規(guī)?；酿B(yǎng)殖、飼養(yǎng)密度大、家禽管理系統(tǒng)不良等因素導(dǎo)致球蟲病容易爆發(fā)呈常年流行[3-5]?，F(xiàn)階段藥物防治球蟲病經(jīng)濟(jì)成本低、起效快而養(yǎng)殖戶所青睞[6-8]。氯苯胍屬于胍基衍生物，分子式是C15H14Cl3N5，屬于為化學(xué)合成抗球蟲藥。因不良反應(yīng)輕、易吸收、對(duì)急慢性球蟲病均有良好效果[9-11]。鹽酸氯苯胍是一種難以直接被降解的物質(zhì)，不規(guī)范使用不但會(huì)使雞產(chǎn)生耐藥性，而且會(huì)影響雞相關(guān)產(chǎn)品品質(zhì)。長(zhǎng)期食用高殘留氯苯胍食品可使消費(fèi)者的身體健康受到傷害[12]。

氯苯胍常用的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]等。但液相色譜法耗時(shí)長(zhǎng)且容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，故選擇液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法來(lái)提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。普通前處理試劑和耗材消耗大，繁瑣費(fèi)時(shí)成本高。因此試驗(yàn)擬采用QuEChERS法進(jìn)行前處理，通過對(duì)色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立LC-MS/MS法快速測(cè)定雞肉和雞蛋中的氯苯胍。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈、甲醇、甲酸（HPLC級(jí)，德國(guó)CNW公司）；正己烷（AR，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；超純水；雞蛋、雞肉經(jīng)勻漿機(jī)處理后裝入樣品瓶中置于-20 ℃下冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器設(shè)備

液質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent 1200+6460型，美國(guó)Agilent公司）；漩渦混合器（MS3 basic，德國(guó)IKA公司）；高速冷凍離心機(jī)（Multifuge X Pro Series，Thermo Fisher Scientific公司）；超聲波清洗器（KQ-600DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；超純水儀（IQ7000，美國(guó)MilliQ公司）；電子天平[BSA4202S-CW，Sartorius科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

購(gòu)買溶解在甲醇中的鹽酸氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 000 μg/mL，置于-20 ℃下避光保存。用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級(jí)稀釋并配制成1，2，5，10，20和50 ng/mL的氯苯胍系列工作溶液，置于4 ℃下避光保存。

1.4 樣品預(yù)處理

雞肉去骨、雞蛋破殼后用勻漿機(jī)攪打混勻后準(zhǔn)確稱取2.00 g雞肉/雞蛋于50 mL離心管中，加入20 mL的0.2%甲酸乙睛水（80∶20，V/V）溶液提取，渦旋離心1 min后35 ℃下恒溫超聲提取15 min；以10 000 r/min高速離心5 min后，取5 mL上清液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中并加入5 mL乙睛飽和的正己烷渦旋30 s后，在5 000 r/min下離心5 min棄去正己烷，加入5 mL正己烷重復(fù)操作1遍，向溶液中加入50 mg C18粉末渦旋30 s，以5 000 r/min離心5 min后，經(jīng)0.2 μm聚四氟乙烯疏水性濾膜過濾裝入進(jìn)樣瓶，供HPLC-MS/MS分析。

1.5 HPLC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-AqSolvent Saver Plus（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相組成：0.1%甲酸水-乙睛（梯度）；進(jìn)樣量5 μL；流速0.6 mL/min，梯度洗脫。梯度洗脫程序（見表1）。

表1 以0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相的梯度洗脫程序

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；質(zhì)譜掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓4 000 V，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流量10 L/min，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min。氯苯胍監(jiān)測(cè)離子、碰撞電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表2 氯苯胍的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在電噴霧電離和MRM模式下對(duì)10 ng/mL的氯苯胍標(biāo)準(zhǔn)溶液多次注射進(jìn)樣。通過對(duì)鞘氣的溫度、鞘氣的流速，毛細(xì)管的電壓、碰撞電壓和碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行過優(yōu)化。選擇穩(wěn)定性好、離子豐度高和干擾小的2個(gè)碎片離子作為氯苯胍定性離子和定量離子，并以豐度最強(qiáng)，響應(yīng)值最高的作為定量離子對(duì)。標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為10 ng/mL的氯苯胍MRM離子對(duì)質(zhì)譜圖（如圖1）。

圖1 氯苯胍的MRM離子對(duì)質(zhì)譜圖

2.2 色譜條件優(yōu)化

通過比較同一濃度下氯苯胍在水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈5種流動(dòng)相體系下的峰面積和峰高，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)流動(dòng)相為A、B體系時(shí)，基線噪音大、峰不對(duì)稱且拖尾；C體系色譜柱壓力高，出峰時(shí)間滯后，峰形為雙頭峰且響應(yīng)值低；D體系響應(yīng)高且對(duì)稱性好；E體系響應(yīng)值低于D體系。因此，試驗(yàn)選擇0.1%甲酸水溶液-乙腈（以D表示）作為檢測(cè)氯苯胍的流動(dòng)相體系（如圖2所示）。

圖2 不同流動(dòng)相體系對(duì)氯苯胍提取效率的影響

2.3 優(yōu)化提取溶劑

通過試驗(yàn)觀察不同提取溶劑的提取效果，在同一提取條件下（添加0.2%甲酸），當(dāng)提取溶劑中乙腈含量小于60%后提取溶劑渾濁。因此試驗(yàn)對(duì)比含0.2%甲酸的乙睛溶液（用A表示）、含0.2%甲酸的乙睛-水（9∶1，V/V）溶液（用B表示）、含0.2%甲酸的乙睛-水（8∶2，V/V）溶液（用C表示）、含0.2%甲酸的乙睛-水（7∶3，V/V）溶液（用D表示）4種乙腈含量不同的溶劑提取雞蛋和雞肉中的氯苯胍。結(jié)果顯示，隨著乙睛含量降低，氯苯胍提取效率先升高后降低，質(zhì)控樣回收率在60%～99%。用B溶液提取雞蛋和雞肉中的氯苯胍，質(zhì)控樣的回收率分別能達(dá)到97.2%和94.6%，高于其他比例溶液的提取效果。因此試驗(yàn)選取含0.2%甲酸酸化的乙睛-水（8∶2，V/V）溶液（用C表示）作為最佳提取溶劑（如圖3所示）。

圖3 不同提取溶劑對(duì)氯苯胍提取效率的影響

2.4 濾膜材質(zhì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

通過比較混合纖維素（MCX）微孔濾膜、尼龍（PA）微孔濾膜和聚四氟乙烯（PTFE）疏水性濾膜，這3種不同材質(zhì)濾膜對(duì)同一質(zhì)量濃度（50.0 ng/mL）氯苯胍溶劑標(biāo)的吸附差異如圖4所示。裝瓶前同時(shí)棄去前5滴液體，取0.5 mL上機(jī)測(cè)定。結(jié)果表明，只有聚四氟乙烯疏水性濾膜損失最少，過濾前后上機(jī)濃度差異最小，其余濾膜有較大損失。

圖4 不同材質(zhì)濾膜過濾效果

2.5 離子色譜圖

按照優(yōu)化后的質(zhì)譜條件和色譜條件，對(duì)經(jīng)過前處理后得到的雞蛋和雞肉的空白樣品、質(zhì)控樣品及基質(zhì)標(biāo)進(jìn)行分析，得到的TIC色譜圖（如圖5和圖6所示）。目標(biāo)物氯苯胍出峰時(shí)間在3.4 min左右，峰形尖銳且對(duì)稱，基質(zhì)中在目標(biāo)峰前后無(wú)干擾。由峰面積數(shù)值可得，雞蛋和雞肉質(zhì)控樣的加標(biāo)回收率分別是88.5%和91.5%，能滿足檢測(cè)的要求。

圖5 雞蛋中氯苯胍TIC譜圖

圖6 雞肉中氯苯胍TIC譜圖

3 方法的評(píng)價(jià)

3.1 線性范圍和檢出限

通過比較相同濃度下的氯苯胍溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液與空白基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，故選用空白基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行線性范圍的驗(yàn)證。在優(yōu)化條件后對(duì)一系列氯苯胍基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，氯苯胍在1～50 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，雞蛋和雞肉中線性相關(guān)系數(shù)均為（R2=0.999 4）。在信噪比rSN為3時(shí)，計(jì)算得出氯苯胍的檢出限為5 μg/kg；在信噪比rSN為10時(shí)，計(jì)算得出氯苯胍的定量限為10 μg/kg。該方法線性關(guān)系良好（見表3）。

表3 雞蛋和雞肉中氯苯胍的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

3.2 回收率和精密度

任意選取一份空白雞蛋和雞肉樣品，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行3個(gè)濃度加標(biāo)測(cè)定回收率，對(duì)各濃度6個(gè)平行樣品進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果（見表4），雞蛋中氯苯胍的平均回收率為91.3%～94.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～3.0%，雞肉中氯苯胍的平均回收率為80.3%～93.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%～1.8%，說(shuō)明該方法回收率穩(wěn)定且精密度良好。

表4 雞蛋和雞肉中氯苯胍的回收率和精密度

3.3 實(shí)際樣品的測(cè)定

收集新疆地區(qū)雞肉和雞蛋樣品共96個(gè)，按照優(yōu)化后試驗(yàn)條件對(duì)雞蛋和雞肉樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，所有收集樣品中均未檢出氯苯胍。

4 結(jié)論

采用HPLC-MS/MS質(zhì)譜法分離。通過對(duì)儀器條件優(yōu)化、前處理環(huán)節(jié)優(yōu)化（不同流動(dòng)相、不同提取溶劑等因素），提高雞蛋和雞肉中氯苯胍的提取效率并減少預(yù)處理時(shí)間。在方法學(xué)驗(yàn)證和實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果中表明，該方法具有分析速度快，經(jīng)濟(jì)成本低的特點(diǎn)，適于雞蛋和雞肉中氯苯胍的定性定量檢測(cè)。