賀志喬，吳樹棟，朱富強(qiáng)，高翠

濱州市檢驗(yàn)檢測(cè)中心（濱州 256600）

近年來，伴隨我國經(jīng)濟(jì)社會(huì)飛速發(fā)展，保健食品行業(yè)也呈現(xiàn)迅猛發(fā)展態(tài)勢(shì)[1]。保健食品是指具有特定保健功能或者以補(bǔ)充維生素、礦物質(zhì)為目的的食品。即適用于特定人群食用，具有調(diào)節(jié)機(jī)體功能，不以治療疾病為目的，并且對(duì)人體不產(chǎn)生任何急性、亞急性或慢性危害的食品[2]。隨著生活質(zhì)量的提高，消費(fèi)者日益注重自身健康和食品的保健功能，保健食品以其功能性和安全性成為更好的選擇[3]。然而，為謀取暴利不法商家向保健食品中添加非法藥物以增強(qiáng)保健食品的使用效果。長(zhǎng)期服用非法添加藥物的保健食品嚴(yán)重影響消費(fèi)者的身體健康，并帶來經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。因此，我國監(jiān)管部門對(duì)保健食品非法添加藥物持續(xù)加強(qiáng)監(jiān)管，檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)的提高也是持續(xù)關(guān)注的重點(diǎn)[6]。

保健食品中非法添加藥物常見的檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)有色譜法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、色譜光譜聯(lián)用法、直接質(zhì)譜法、核磁共振波譜法、光譜法等[7-10]。其中質(zhì)譜法以其分析速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用。大氣壓固體分析探針（Ambient solid analysis probe，ASAP）是一種常壓離子化（Ambient ionization，AI）質(zhì)譜分析技術(shù)，即在大氣壓環(huán)境下，無需或只需極少的前處理過程，可對(duì)固體探針攜帶的樣品直接進(jìn)行熱脫附，經(jīng)過電暈針放電離子化后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行定性、定量分析[11]。ASAP質(zhì)譜法在食品安全領(lǐng)域已有應(yīng)用[12-18]，在保健食品非法添加物檢測(cè)方面的應(yīng)用鮮見報(bào)道。喹諾酮類藥物是一類廣譜抗生素，添加至某些中成藥及保健食品中有快速高效的顯著效果[19-20]。針對(duì)保健食品中非法添加的喹諾酮類藥物，建立一種快速高效簡(jiǎn)便的大氣壓固體分析探針質(zhì)譜檢測(cè)方法，以期為保健食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（溶劑均為甲醇，質(zhì)量濃度均為100 μg/mL）：氟羅沙星、依諾沙星、奧比沙星、惡喹酸、培氟沙星、氘代恩諾沙星-D5（壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；司帕沙星（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所）；氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、洛美沙星、丹諾沙星、雙氟沙星、沙拉沙星、氟甲喹、氘代諾氟沙星-D5、氘代環(huán)丙沙星-D8（BePure公司）。

試驗(yàn)用水為超純水；甲醇（色譜純，美國TEDIA公司）；乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；甲酸（色譜純，美國ACS恩科化學(xué)）；乙酸銨（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

市售固體和液體保健食品。

1.2 儀器與設(shè)備

Xevo TQ-XS三重四極桿質(zhì)譜儀：配有大氣壓固體分析探針（Ambient solid analysis probe，ASAP）離子源（美國Waters公司）；MILLI-QADWANTAGE A10超純水機(jī)（美國密理博公司）；ME204T電子天平（精度0.000 1 g，上海梅特勒—托利多儀器有限公司）；3k15高速冷凍離心機(jī)（美國SIGMA公司）；SB25-12 DTD超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取20粒市售保健食品油狀膠囊樣品，將其內(nèi)容物混勻；取10～20粒粉狀膠囊樣品，去掉膠囊，將粉劑混勻；取10～20片的片劑樣品，置研缽中研磨均勻；取液體樣品搖勻。準(zhǔn)確稱取1.00 g樣品于50 mL離心管中，加入10.0 mL甲醇，超聲提取10 min，轉(zhuǎn)移至50.0 mL容量瓶中用水定容。過0.22 μm微孔濾膜，待測(cè)。

1.3.2 質(zhì)譜條件

大氣壓固體分析探針離子源；ASAP正離子模式；掃描方式：多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)；去溶劑氣溫度500℃；去溶劑氣流量1 000 L/Hr，錐孔氣流量150 L/Hr，霧化氣流量7.0 Bar，碰撞氣流量0.15 mL/min，電暈針放電電流0.7 μA。各物質(zhì)的分子離子與特征碎片離子等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 15種喹諾酮類藥物和3種內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.3 上樣方式

按住ASAP源（圖1）外部的密封桿，取下進(jìn)樣桿，插入封端毛細(xì)玻璃管至進(jìn)樣桿頂端，用微量移液器將1 μL樣品處理液滴加至毛細(xì)玻璃管封端，將進(jìn)樣桿快速插入ASAP源內(nèi)部，確保毛細(xì)玻璃管封端和樣液不接觸其他組件。樣液經(jīng)熱的氮?dú)饬骺焖倜摳剑陔姇炨樂烹娮饔孟码x子化后，直接進(jìn)入質(zhì)譜分析。

圖1 ASAP離子源及進(jìn)樣桿[20]

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

影響ASAP源離子化效率的主要因素有去溶劑氣溫度、電暈針放電電流、氣流量、毛細(xì)管封端與電暈針和進(jìn)樣錐孔之間的相對(duì)位置等。Waters Xevo TQ-XS三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀已將電暈針、進(jìn)樣錐孔和源位置設(shè)置為最優(yōu)狀態(tài)為固定值，氣流量選用推薦值，故質(zhì)譜條件的優(yōu)化重點(diǎn)在前兩者。

2.1.1 去溶劑氣溫度的優(yōu)化

去溶劑氣溫度影響樣品處理液的氣化速度、待測(cè)物質(zhì)的離子化效率、檢測(cè)靈敏度及峰形。在去溶劑氣溫度分別為250，300，350，400，450和500 ℃的條件下對(duì)15種喹諾酮類藥物進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)去溶劑氣溫度在500 ℃時(shí)，響應(yīng)值最高，峰形最好，易于積分，因此將去溶劑氣溫度設(shè)為500 ℃（圖2）。

圖2 去溶劑氣溫度對(duì)峰形的影響

2.1.2 電暈針電流的優(yōu)化

ASAP源的電離需經(jīng)電暈針放電進(jìn)行離子化生成質(zhì)子化或去質(zhì)子化離子，有正離子和負(fù)離子兩種模式。在電暈針電流分別為0.1，0.3，0.5，0.7，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 μA的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣3次，對(duì)比15種喹諾酮類藥物的峰面積，發(fā)現(xiàn)電暈針放電電流在0.7 μA時(shí)，大部分物質(zhì)響應(yīng)值最大，故電暈針電流設(shè)為0.7 μA（圖3為電暈針電流分別為0.5，0.7，1.0和1.5 μA時(shí)對(duì)峰形的影響差異）。

圖3 電暈針電流對(duì)峰面積的影響（1.0 μg/mL，n=3）

2.2 進(jìn)樣方式的優(yōu)化

2.2.1 樣品溶劑的優(yōu)化

分別選取甲醇、乙腈、水及甲醇+水（1+1，V/V）為溶劑，配制1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液連續(xù)進(jìn)樣分析7次，分析不同溶劑的待測(cè)物質(zhì)在相同試驗(yàn)條件下的響應(yīng)值。發(fā)現(xiàn)大部分物質(zhì)在水為溶劑時(shí)，有較高的響應(yīng)值且精密度較好。優(yōu)于乙腈、甲醇+水（1+1，V/V）和甲醇為溶劑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。分析原因可能為水的表面張力較大，易在毛細(xì)玻璃封端形成穩(wěn)定的液滴，而甲醇、乙腈表面張力小、沸點(diǎn)較水低易揮發(fā)，因此選用水為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶劑（圖4）。

圖4 溶劑對(duì)峰面積的影響（1.0 μg/mL，n=7）

2.2.2 進(jìn)樣方式的考察

ASAP離子源可采取將毛細(xì)玻璃管封端浸入或蘸取樣品溶液或樣品的形式進(jìn)行上樣分析，考慮到這種進(jìn)樣方式的精度較差，為提高進(jìn)樣精度和準(zhǔn)確度，采用微量移液器吸取1 μL樣品溶液，點(diǎn)加于毛細(xì)玻璃管封端的形式進(jìn)行上樣分析。每個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣分析7次，對(duì)比外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)校正法兩種方式下不同物質(zhì)的峰面積和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差SRSD，發(fā)現(xiàn)差別不明顯（圖5）。

圖5 進(jìn)樣方式對(duì)峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的影響（1.0 μg/mL，n=7）

2.3 ASAP-MS/MS定性定量分析

2.3.1 定性分析

15種喹諾酮類藥物經(jīng)過質(zhì)譜條件優(yōu)化，分別確定一級(jí)質(zhì)譜母離子的質(zhì)荷比（m/z）與錐孔電壓，并選取兩個(gè)響應(yīng)值最高的離子碎片作為二級(jí)質(zhì)譜子離子進(jìn)行定性，其中強(qiáng)度最高的離子碎片作為定量離子，次強(qiáng)碎片為定性離子。樣品中檢測(cè)到相同的母離子與子離子質(zhì)荷比后，其子離子次強(qiáng)碎片的離子相對(duì)豐度，與濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)豐度相比，應(yīng)在一定誤差范圍內(nèi)，則可定性為樣品中存在對(duì)應(yīng)的被測(cè)物質(zhì)（表2）。

表2 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許誤差

2.3.2 定量分析

直接質(zhì)譜法因受到大氣壓環(huán)境、上樣方式等因素的制約，其定量的準(zhǔn)確度與精密度較色譜質(zhì)譜聯(lián)用法差，故為半定量分析。采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)15種喹諾酮類藥物進(jìn)行定量分析，用水配制質(zhì)量濃度分別為10，50，100，200和500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液。其中氟羅沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依諾沙星和諾氟沙星以氘代諾氟沙星為內(nèi)標(biāo)；洛美沙星、奧比沙星、丹諾沙星、雙氟沙星和環(huán)丙沙星以氘代環(huán)丙沙星為內(nèi)標(biāo)；恩諾沙星、沙拉沙星、司帕沙星、惡喹酸和氟甲喹以氘代恩諾沙星為內(nèi)標(biāo)。以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液中的待測(cè)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，單位為ng/mL，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照3倍信噪比確定喹諾酮類檢出限SLOD為0.25 mg/kg，按照10倍信噪比確定定量限SLOQ為0.50 mg/kg。重復(fù)進(jìn)樣分析質(zhì)量濃度為10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液7次，計(jì)算精密度SRSD為10.1%～29.4%。15種喹諾酮類藥物在0.50～25.0 mg/kg質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均高于0.98，符合篩選方法[21]的要求（表3）。

表3 15種喹諾酮類藥物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及精密度

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

分別選取有代表性的膠囊劑和片劑陰性樣品基質(zhì)考察基質(zhì)效應(yīng)，比較不同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線斜率與溶劑中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線斜率的差異。分別用膠囊劑和片劑的陰性樣品提取液配制質(zhì)量濃度為10，50，100，200和500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，采取與上節(jié)相同的方式建立標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同保健食品基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線斜率存在差異，即存在基質(zhì)效應(yīng)，不同待測(cè)物質(zhì)間差異不同。如圖6所示，氟甲喹在膠囊中的曲線斜率高于在片劑中和水中的曲線斜率，基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)。如圖7所示，雙氟沙星在片劑中的曲線斜率高于在膠囊中和水中的曲線斜率，基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)。氟甲喹的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)更為明顯。因此，ASAP源在該試驗(yàn)過程中的應(yīng)用應(yīng)考慮基質(zhì)效率，可采取基質(zhì)添加或基質(zhì)匹配的方式配制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線，或進(jìn)一步凈化和稀釋樣品處理液來削弱基質(zhì)效應(yīng)。

圖6 氟甲喹在不同基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖7 雙氟沙星在不同基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 樣品測(cè)定

試驗(yàn)共收集市售保健食品9批，包括1批含油狀物膠囊劑，4批含粉狀物膠囊劑，3批片劑和1批液體保健食品。取每個(gè)樣品按1.3.1小節(jié)所述方式制備樣品提取液，按1.3.2小節(jié)質(zhì)譜條件和1.3.3小節(jié)中內(nèi)標(biāo)法上樣方式進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)2.3小節(jié)定性定量方法對(duì)樣品進(jìn)行分析。9種保健食品中均未檢出該15種喹諾酮類藥物，與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的驗(yàn)證結(jié)果一致。

選用一批片劑保健食品作為陰性樣品，按1.3.1小節(jié)所述方式制備樣品提取液，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平為0.5，2.5和5.0 mg/kg的15種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，按1.3.2小節(jié)質(zhì)譜條件和1.3.3小節(jié)中內(nèi)標(biāo)法上樣方式進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得15種喹諾酮類藥物的平均回收率為59%～123%，精密度SRSD范圍分別為6.9%～46.4%，8.7%～36.4%和3.4%～31.9%。

3 結(jié)論

綜上所述，大氣壓固體分析探針質(zhì)譜法為保健食品中喹諾酮類藥物的篩查提供了簡(jiǎn)便快速高效的檢測(cè)方法。樣品前處理簡(jiǎn)單快速經(jīng)濟(jì)，無需色譜分離，實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)同時(shí)快速分析，定性準(zhǔn)確，可在大批量保健食品快速篩查或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等方面得到應(yīng)用。與色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法相比較，存在上樣精密度較差的局限性，對(duì)操作人員的熟練程度有較高要求，有進(jìn)一步加深相關(guān)研究的必要性。