藍(lán)小河，吳雪輝*，陳嘉慧，陳雪梅，黃永芳，謝克娜

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（廣州 510642）；2. 佛山市林業(yè)科學(xué)研究所（佛山 528000）；3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院（廣州 510642）

金花茶是山茶科山茶屬植物，是藥食兩用植物，在我國(guó)廣西、云南等地分布，有很高的藥用價(jià)值[1]。由于金花茶不同部位所含有的主要化學(xué)成分不同，其藥理活性也不同，而金花茶葉中主要含有皂苷、黃酮和多酚等活性物質(zhì)，具有良好的降血糖作用[2-3]。蘇琳等[4]研究發(fā)現(xiàn)，金花茶葉皂苷能調(diào)節(jié)糖代謝，降低生物體的血糖水平。

皂苷是類固醇或三萜天然糖苷類重要活性成分，廣泛存在于人參、三七、黃芪等多種中藥材中[5]，可以通過抑制口腔和腸道中α-淀粉酶活性，從而減少碳水化合物的分解和消化，降低生物體的血糖水平，是天然的α-淀粉酶抑制劑[6]。包瑞敏等[7]研究顯示黃精總皂苷對(duì)α-淀粉酶抑制率達(dá)82%，高于糖尿病臨床使用的酶抑制劑阿卡波糖，是良好的α-淀粉酶抑制劑。Kamal等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)摩洛哥堅(jiān)果皂苷提取物與阿卡波糖相比，具有更好的α-淀粉酶抑制活性，對(duì)肝臟的損害更小。

目前，對(duì)于皂苷的α-淀粉酶抑制活性的研究主要集中于三七、遠(yuǎn)志等中藥皂苷[9]，而關(guān)于金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶抑制作用的研究鮮見報(bào)道，因而該研究以金花茶葉皂苷為原料，探究其對(duì)α-淀粉酶的抑制機(jī)制及效果，以期為金花茶葉皂苷作為天然α-淀粉酶抑制劑以及金花茶葉資源的開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金花茶葉（廣東省佛山市林業(yè)科學(xué)研究所金花茶示范林）；α-淀粉酶（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；乙醇（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；可溶性淀粉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；3, 5-二硝基水楊酸（純度≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

DK-8D型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；UV-5200型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金花茶葉皂苷樣品制備

選取無病蟲害，無腐爛、枯萎的金花茶葉，于50℃烘干、粉碎，采用60%乙醇溶液提取皂苷，粗提液經(jīng)LX-213大孔樹脂和HP-20大孔樹脂純化分離，蒸發(fā)濃縮后干燥得到金花茶葉皂苷樣品[10]。

1.2.2 金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶的抑制試驗(yàn)

參考范銘[11]的方法，取已配制成一定質(zhì)量濃度的金花茶葉皂苷溶液、質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的α-淀粉酶溶液以及緩沖溶液各0.5 mL混合均勻，于37 ℃中恒溫水浴10 min后，加入0.5 mL的1%可溶性淀粉溶液繼續(xù)水浴10 min，最后加0.5 mL的3, 5-二硝基水楊酸顯色劑在沸水浴中加熱10 min，冷卻并稀釋一定倍數(shù)，置于540 nm處測(cè)定吸光度。以緩沖溶液代替α-淀粉酶溶液作為試驗(yàn)空白組、代替皂苷溶液作為對(duì)照組、代替皂苷溶液和α-淀粉酶溶液2種溶液作為背景組，按式（1）計(jì)算α-淀粉酶的抑制率。

式中：A為試驗(yàn)組吸光度；B為試驗(yàn)空白組吸光度；C為對(duì)照組吸光度；D為背景組吸光度。

1.2.3 金花茶葉皂苷質(zhì)量濃度對(duì)α-淀粉酶活性的影響

固定金花茶葉皂苷溶液與α-淀粉酶溶液的反應(yīng)時(shí)間10 min、反應(yīng)pH 7.0，測(cè)定不同質(zhì)量濃度的皂苷溶液與α-淀粉酶溶液反應(yīng)后溶液的吸光度，計(jì)算抑制率并繪制抑制效果曲線。

1.2.4 金花茶葉皂苷與α-淀粉酶反應(yīng)pH對(duì)α-淀粉酶活性的影響

固定金花茶葉皂苷溶液質(zhì)量濃度0.5 mg/mL、與α-淀粉酶溶液反應(yīng)時(shí)間10 min，分別測(cè)定金花茶葉皂苷溶液與α-淀粉酶溶液在pH為6.0，6.5，7.0，7.5和8.0條件下反應(yīng)后溶液的吸光度，計(jì)算抑制率并繪制抑制效果曲線。

1.2.5 金花茶葉皂苷與α-淀粉酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)α-淀粉酶活性的影響

固定金花茶葉皂苷溶液質(zhì)量濃度0.5 mg/mL、反應(yīng)pH 7.0，分別測(cè)定金花茶葉皂苷溶液與α-淀粉酶溶液在反應(yīng)時(shí)間為0，5，10，15和20 min條件下反應(yīng)后溶液的吸光度，計(jì)算抑制率并繪制抑制效果曲線。

1.2.6 金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶抑制類型的研究

金花茶葉皂苷溶液質(zhì)量濃度設(shè)置為0，0.5和1.0 mg/mL，以1%可溶性淀粉溶液為底物，分別與0.3，0.4，0.5，0.6和0.7 mg/mL的α-淀粉酶溶液反應(yīng)10 min，測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度變化，以酶質(zhì)量濃度對(duì)反應(yīng)速率作圖。不可逆抑制的速率直線不通過坐標(biāo)原點(diǎn)，不加抑制劑和可逆性抑制的速率直線均通過坐標(biāo)原點(diǎn)，且可逆性抑制的速率直線斜率比不加抑制劑的直線斜率小，確定金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶的抑制類型為可逆或不可逆。

為了進(jìn)一步確定金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶的具體抑制類型，金花茶葉皂苷溶液質(zhì)量濃度設(shè)置為0，0.5和1.0 mg/mL，分別與0.5%，0.75%，1%，1.25%和1.5%的可溶性淀粉溶液反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)體系的吸光度變化，作雙倒數(shù)圖。從雙倒數(shù)圖中的直線相交于x軸或y軸可以判斷其屬于可逆的非競(jìng)爭(zhēng)性或競(jìng)爭(zhēng)性抑制，如直線均不相交則為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制，確定金花茶葉皂苷溶液對(duì)α-淀粉酶溶液的具體抑制類型[12]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，使用Origin 2019軟件作圖，使用Excel和SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同金花茶葉皂苷質(zhì)量濃度對(duì)α-淀粉酶活性影響

不同金花茶葉皂苷溶液質(zhì)量濃度對(duì)α-淀粉酶活性影響如圖1所示。由圖1可知，金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶具有抑制作用，且皂苷溶液質(zhì)量濃度與α-淀粉酶抑制率呈一定劑量依賴關(guān)系。當(dāng)金花茶葉皂苷質(zhì)量濃度從0.5 mg/mL增加到5 mg/mL時(shí)，α-淀粉酶的抑制率上升較快；超過5 mg/mL后，隨著皂苷質(zhì)量濃度的增加，α-淀粉酶的抑制率增加減緩；皂苷質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，α-淀粉酶的抑制率達(dá)到54.69%，IC50值為7.974 mg/mL。與徐艷陽等[13]研究的黑果腺肋花楸多酚溶液對(duì)α-淀粉酶的抑制率隨多酚溶液質(zhì)量濃度變化趨勢(shì)相似。

圖1 金花茶葉皂苷質(zhì)量濃度對(duì)α-淀粉酶抑制作用的影響

2.2 金花茶葉皂苷和α-淀粉酶反應(yīng)pH對(duì)α-淀粉酶活性大小影響

不同反應(yīng)pH對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響如圖2所示。金花茶葉皂苷溶液對(duì)α-淀粉酶溶液的抑制率隨著pH的增加先升高后下降。當(dāng)pH為7.0時(shí)，其對(duì)α-淀粉酶的抑制率達(dá)到最大，此時(shí)皂苷對(duì)α-淀粉酶的抑制效果最佳，pH繼續(xù)升高，金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶的抑制率逐漸減小。α-淀粉酶在人體腸道中水解碳水化合物，將其分解成適合吸收的單糖，而金花茶葉皂苷抑制α-淀粉酶效果最好時(shí)的pH為7.0，與腸道的pH接近[14]，因此可認(rèn)為金花茶葉皂苷在人體內(nèi)能夠較好地發(fā)揮其對(duì)α-淀粉酶的抑制作用。

圖2 不同反應(yīng)pH對(duì)α-淀粉酶抑制作用的影響

2.3 金花茶葉皂苷和α-淀粉酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)α-淀粉酶活性大小影響

不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)α-淀粉酶活性影響如圖3所示。由圖3可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，金花茶葉皂苷溶液對(duì)α-淀粉酶溶液的抑制率先增加后下降。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)，皂苷溶液與α-淀粉酶溶液反應(yīng)較為完全，α-淀粉酶受到最大程度的抑制；反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，由于皂苷溶液和α-淀粉酶溶液的質(zhì)量濃度逐漸減小，結(jié)合速率降低，皂苷溶液對(duì)α-淀粉酶溶液的抑制率逐漸下降[15]，因此可認(rèn)為反應(yīng)時(shí)間為10 min有利于金花茶葉皂苷發(fā)揮其對(duì)α-淀粉酶的抑制作用。

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)α-淀粉酶抑制作用的影響

2.4 金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶的抑制類型

圖4為金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶抑制作用的抑制動(dòng)力學(xué)曲線。如圖4所示，不同皂苷溶液質(zhì)量濃度的3條直線近似穿過坐標(biāo)原點(diǎn)，加入皂苷溶液后的速率直線斜率較不加皂苷溶液時(shí)低，說明金花茶葉皂苷溶液對(duì)α-淀粉酶溶液的抑制類型為可逆性抑制[16]。金花茶葉皂苷與α-淀粉酶通過非共價(jià)鍵可逆性結(jié)合，從而使α-淀粉酶活性降低或喪失，可以通過透析等方法去除抑制劑后使α-淀粉酶活性得到恢復(fù)。

圖4 金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶抑制動(dòng)力學(xué)曲線

圖5為金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶抑制作用的雙倒數(shù)曲線。由圖5可知，不同皂苷溶液質(zhì)量濃度的3條直線相交且交點(diǎn)位于x軸，說明金花茶葉皂苷溶液對(duì)α-淀粉酶溶液的抑制作用不影響酶促反應(yīng)的米氏常數(shù)，不會(huì)改變?chǔ)?淀粉酶對(duì)底物的親和力；加入的皂苷溶液的質(zhì)量濃度越大，其對(duì)應(yīng)直線的斜率越小，說明金花茶葉皂苷溶液的存在會(huì)降低酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速度，因此判斷金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶的抑制類型為可逆的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制[17]。金花茶葉皂苷與α-淀粉酶活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合，底物質(zhì)量濃度不影響皂苷對(duì)α-淀粉酶的抑制作用，抑制過程取決于抑制劑的質(zhì)量濃度，與劉雪輝[18]研究發(fā)現(xiàn)武靴藤中皂苷類化合物對(duì)α-淀粉酶抑制的作用機(jī)制一致。

圖5 金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶的雙倒數(shù)曲線

3 結(jié)論

通過金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶抑制活性的抑制作用條件以及抑制類型進(jìn)行探究，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶有一定抑制作用，且抑制效果與皂苷質(zhì)量濃度呈一定劑量依賴關(guān)系，當(dāng)pH為7.0、反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)，皂苷抑制α-淀粉酶活性的效果最佳，此條件下皂苷質(zhì)量濃度為8 mg/mL時(shí)，金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶的抑制率可達(dá)54.69%，IC50值為7.974 mg/mL，金花茶葉皂苷對(duì)α-淀粉酶的抑制類型為可逆的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，研究結(jié)果可為金花茶葉皂苷在α-淀粉酶抑制劑領(lǐng)域的開發(fā)利用提供一定參考。