周方

1. 安徽國科檢測科技有限公司（合肥 230041）；2. 安徽省智慧監(jiān)測工程研究中心（合肥 230041）

霍山石斛（Dendrobium huoshanenseC.Z. Tang et S.J. Cheng），又被稱為米斛、霍山米斛、霍斛等，主產(chǎn)于我國安徽霍山及周邊地區(qū)[1]，具有益胃生津、滋陰清熱、增強(qiáng)免疫力等功效，素有“中華仙草之首”稱號[2-3]，是石斛中的上品[4]。隨著人們生活水平的提高，霍山石斛作為一種日常生活中的食品原料，在民間食用范圍越來越廣泛，其食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)的出臺明確了食品原料的身份，霍山石斛作為石斛中最高檔次保健品及食品原料的品牌意識深入人心，享譽(yù)國內(nèi)外市場。

安徽霍山地區(qū)主產(chǎn)霍山石斛（D.huoshanense）、霍山鐵皮石斛（D.candidum）和霍山銅皮石斛（D.moniliforme）這3種石斛，其中，霍山石斛因品質(zhì)上乘，長期過度采挖野生資源以及生態(tài)環(huán)境的惡化等原因，野生種質(zhì)資源瀕臨滅絕[5]，人工栽培規(guī)模還在初步發(fā)展階段，種植工藝復(fù)雜，植株生長周期長，產(chǎn)量低，導(dǎo)致其價格昂貴，被喻為石斛中的“軟黃金”。在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，以價格較低的石斛冒充霍山石斛楓斗事件時有發(fā)生，因霍山鐵皮石斛、霍山銅皮石斛與霍山石斛親緣關(guān)系相近，加工后的楓斗鑒別難度較大，再加上學(xué)者長期對霍山石斛的錯誤認(rèn)知[6]，不良商家常將霍山鐵皮石斛、霍山銅皮石斛統(tǒng)稱為霍山石斛誤導(dǎo)消費(fèi)者，以其作為偽品擾亂霍山石斛市場秩序，損害消費(fèi)者權(quán)益及產(chǎn)品聲譽(yù)。因此，需要一種簡便快速鑒別霍山石斛的方法，以杜絕假冒產(chǎn)品，對規(guī)范霍山石斛產(chǎn)品市場秩序和促進(jìn)霍山石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有現(xiàn)實意義。石斛常見的鑒別方式有性狀、顯微、分子生物學(xué)、理化、薄層鑒別、氣相/液相色譜等[6-9]，但性狀和顯微鑒別有較強(qiáng)的主觀性，鑒別人員須具有豐富的經(jīng)驗，分子生物學(xué)、理化、薄層鑒別、氣相/液相色譜方法要對樣品進(jìn)行預(yù)處理，操作步驟較為復(fù)雜，且成本高。

傅里葉變換紅外光譜分析是一種常用鑒別方法，具有操作簡單、檢測快速、無損、取樣量少、綠色無污染、成本低等優(yōu)點[10]，并有較好的鑒別效果，被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地分析、藥用植物鑒定等[11-14]。紅外光譜在石斛屬植物鑒定的應(yīng)用有相關(guān)報道[15-18]。楊曉歌等[16]研究發(fā)現(xiàn)紅外光譜可將鐵皮石斛與紫皮石斛鑒別出來；劉文杰等[19]通過紅外光譜法測定發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地環(huán)草石斛的譜峰強(qiáng)度有差異；李瑩等[20]研究表明藥典中收錄的7種不同石斛粉末的紅外光譜圖存在較顯著的差異。但已有研究中紅外光譜的鑒別是通過光譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出一階或高階譜圖，直觀分析光譜，篩選光譜特征峰，工作量較大。近年來，紅外光譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法已發(fā)展成為一種用于快速鑒別的有效手段[21-24]。基于此，試驗以霍山產(chǎn)的3種石斛楓斗為研究對象，利用傅里葉變換紅外光譜儀采集紅外光譜圖，使用SIMCA13.0分析軟件，結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）分別對霍山石斛進(jìn)行鑒別分析，旨在為霍山石斛的快速鑒別提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料

試驗所選的霍山石斛、霍山鐵皮石斛、霍山銅皮石斛為人工種植的3年生楓斗，所有樣品均由安徽斛生記生物科技有限公司提供，樣品來源見表1。

表1 石斛樣品信息表

1.2 主要儀器與試劑

IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀（安徽省科學(xué)器材有限責(zé)任公司）。

溴化鉀（KBr，純度為99.9%，化學(xué)試劑研究所）。

1.3 試驗方法

所有石斛樣品于60 ℃下干燥至恒重，粉碎過0.180 mm（80目）篩，取石斛粉末樣品與已磨成細(xì)粉的溴化鉀以1∶50的比例放入瑪瑙研缽中混合研磨均勻并壓片。將供試片裝在樣品架，放入紅外光譜儀的樣品室中，進(jìn)行測量。光譜掃描范圍4 000～400 cm-1，儀器分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)100次。為保證儀器穩(wěn)定，每次掃描光譜前，儀器預(yù)熱30 min。每個樣品在不同位置采集3次光譜，試驗設(shè)5個重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SIMCA13.0軟件對9種樣品的光譜圖進(jìn)行主成分分析和正交偏最小二乘判別分析。使用Origin 9.0軟件，對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并繪制紅外光譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜解析

霍山產(chǎn)的3種石斛樣品在4 000～400 cm-1區(qū)域的紅外光譜圖如圖1所示。石斛紅外光譜主要吸收峰在3 395，2 924，1 738，1 632，1 508，1 246，1 157和1 030 cm-1等位置附近。3 395 cm-1附近為締合羥基O—H的伸縮振動吸收峰；2 924 cm-1附近為亞甲基C—H反對稱伸縮振動吸收峰，暗示脂類成分的存在；1 738 cm-1附近為羰基C＝O伸縮振動吸收峰，表明石斛樣品中多糖的存在；在1 632和1 508 cm-1附近為典型的芳環(huán)伸縮振動吸收峰，這2個峰表明石斛樣品中含有芳香類、黃酮類成分；1 246，1 157和1 030 cm-1等處都存在C—O伸縮振動吸收峰，這些峰的位置與形狀是糖類的紅外光譜典型特征。結(jié)果表明，石斛中主要含有多糖、脂類、黃酮類等化學(xué)成分。

圖1 石斛在4 000～400 cm-1區(qū)域紅外光譜圖

3種石斛的紅外光譜峰型大體相似，說明它們所含化學(xué)成分基本相同?；羯绞? 395和2 924 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度較強(qiáng)，其他兩種石斛吸收峰強(qiáng)度相似。3種石斛差異光譜主要在1 800～800 cm-1波數(shù)段，霍山石斛在1 738，1 632和1 246 cm-1等處的吸收峰明顯較強(qiáng)，而其他2種石斛有相似的吸收峰強(qiáng)度。在1 508 cm-1附近霍山銅皮石斛有一個較強(qiáng)的吸收峰，其他石斛在此處的吸收強(qiáng)度較弱，在1 157和1 030 cm-1這2處，霍山石斛、霍山鐵皮石斛的吸收峰較強(qiáng)，霍山銅皮石斛的吸收峰較弱?？偟膩碚f，霍山3種石斛紅外光譜峰的相對強(qiáng)度不同，這可能與不同石斛樣品所含主要化學(xué)成分含量不同有關(guān)。

2.2 主成分分析

紅外光譜技術(shù)應(yīng)用主成分分析（PCA）結(jié)果圖表明，主成分分析對石斛品種的分類起到一定的聚類和判別作用，可以作為霍山石斛鑒別的一種技術(shù)手段。主成分散點圖中的霍山石斛與霍山鐵皮石斛的距離更近，暗示霍山石斛與霍山鐵皮石斛的相似度更高，親緣關(guān)系更近，與以往的研究結(jié)論相一致[25]。紅外光譜應(yīng)用正交偏最小二乘判別（OPLS-DA）分析可以有效地將霍山石斛區(qū)分開來，不同石斛用SIMCA13.0軟件對霍山產(chǎn)的3種石斛的紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。3種石斛的主成分分析（PCA）散點圖如圖2所示。其中，第1主成分的貢獻(xiàn)率為91.5%，第2主成分的貢獻(xiàn)率為7.1%，表明前2個主成分可以表達(dá)樣品紅外光譜信息的98%以上，主成分1和主成分2將3種石斛樣品分成3個部分，不同石斛品種分布在不同的區(qū)域，說明主成分分析對石斛品種的分類起到一定聚類作用。同時可以看出，相比于霍山銅皮石斛，霍山石斛與霍山鐵皮石斛的距離更近。為進(jìn)一步驗證PCA模型的可靠性，隨機(jī)選擇40個樣品作為驗證集，驗證結(jié)果正確率為70%。

圖2 石斛樣品的PCA得分散點圖

2.3 正交偏最小二乘判別分析

采用SIMCA13.0軟件對霍山產(chǎn)的3種石斛的紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析。圖3是三種石斛的正交偏最小二乘判別（OPLS-DA）結(jié)果圖?；羯绞c霍山鐵皮石斛、霍山銅皮石斛分布在不同的區(qū)域，3種石斛具有一定的區(qū)分趨勢，雖然有樣品數(shù)據(jù)變異較大，導(dǎo)致霍山鐵皮石斛、霍山銅皮石斛的有些樣本出現(xiàn)在圈外，但是同一石斛品種具有一定的聚類趨勢。結(jié)果表明紅外光譜應(yīng)用正交偏最小二乘判別分析能有效地對霍山石斛與其他兩種石斛進(jìn)行判別。隨機(jī)選擇40個樣品作為驗證集對模型進(jìn)行驗證，OPLSDA模型驗證結(jié)果正確率達(dá)到100%。

圖3 石斛樣品的OPLS-DA分析圖

3 結(jié)論

利用傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）對霍山產(chǎn)的3種石斛進(jìn)行研究，研究結(jié)果顯示3種石斛的紅外光譜峰型極為相似，這說明霍山石斛與其他2種石斛的主要化學(xué)成分種類基本相同。在1 800～800 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，霍山石斛、霍山鐵皮石斛、霍山銅皮石斛紅外光譜峰的相對強(qiáng)度稍微不同，這也與早期研究結(jié)論一致[26]，不同石斛的主要化學(xué)成分含量不同，以往研究發(fā)現(xiàn)，相比于霍山鐵皮石斛和霍山銅皮石斛，霍山石斛的多糖、總黃酮、生物堿等主要營養(yǎng)成分含量有差異[27]。因此，用紅外原始圖譜不能對霍山石斛和其他2種石斛進(jìn)行有效區(qū)分，需要結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對不同石斛種類進(jìn)行區(qū)分。

種類具有一定的區(qū)分趨勢，且OPLS-DA模型驗證正確率比PCA模型高，達(dá)到100%，模型預(yù)測指數(shù)Q2=0.922，理論上Q2的數(shù)值越接近1模型越好，這表明正交偏最小二乘判別分析的判別結(jié)果準(zhǔn)確度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的主成分分析方法[28-29]，作為一種霍山石斛快速鑒別的方法可靠性高。因試驗中的其他石斛樣本數(shù)量較少，存在一定的局限性，模型中樣品數(shù)據(jù)變異較大，導(dǎo)致其他石斛的有些樣本出現(xiàn)在圈外，但是不難發(fā)現(xiàn)同一種石斛具有一定的聚類趨勢，為進(jìn)一步完善紅外光譜的鑒別研究，未來應(yīng)考慮選取更多產(chǎn)地的石斛品種開展研究。