林群英，龔光祿，龍良鯤，錢奎憲，鄧春英

1. 中華全國供銷合作總社南京野生植物綜合利用研究所（南京 211100）；2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，貴州省食用菌育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴陽 550006）；3. 南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院制藥工程系（南京 210037）；4. 貴州科學(xué)院（貴陽 550001）

新古尼異蟲草（Metacordyceps neogunnii）是一種隸屬于麥角菌科（Clavicipitaceae）的大型真菌，大量分布于我國的貴州、湖南、云南等地，一直以來被視為古尼蟲草（Cordyceps gunnii），直到2017年，才被證實(shí)為新種，命名為新古尼異蟲草[1]。這一分類學(xué)研究成果為新古尼異蟲草的研究提供更準(zhǔn)確的分類定位，突顯其研究的重要性。

新古尼異蟲草這一資源在我國民間應(yīng)用歷史悠久，在貴州等產(chǎn)地甚至被作為冬蟲夏草的替代品，功效價(jià)值備受肯定[2-3]。生物活性成分研究證實(shí)，新古尼異蟲草含有黃酮、多酚、多糖等多種與抗氧化密切相關(guān)的活性物質(zhì)，被證實(shí)具有抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和免疫調(diào)節(jié)等作用[4]?？寡趸窍x草資源重要的生物活性[5]，但新古尼異蟲草在這方面的研究相對較少，其菌絲體可作為維生素E制備的原料[6]，經(jīng)酶解的胞內(nèi)多糖具有抗氧化活性[7]。張永明等[8]以野生子實(shí)體為材料提取總黃酮，但未見以培養(yǎng)產(chǎn)物為提取材料的研究。

新古尼異蟲草的人工培養(yǎng)可追溯至1985年，通過組織分離方式獲得純培養(yǎng)物[9]。新古尼異蟲草在人工培養(yǎng)方面已取得一定進(jìn)展。曹蕾等[10]篩選得其菌絲體液體培養(yǎng)的最佳碳氮源，分別是甘露糖和尿素；劉曉翠等[11]則認(rèn)為蔗糖和蛋白胨分別為最佳的碳氮源。由于這些研究結(jié)果不一致，有必要對新古尼異蟲草的培養(yǎng)進(jìn)行研究。培養(yǎng)條件對這種蟲草的菌絲體抗氧化活性及活性物質(zhì)含量的影響未見報(bào)道。通過液體培養(yǎng)條件的調(diào)控可獲得特定產(chǎn)物，且易于分離。應(yīng)用這種方式，有針對性地獲得富含黃酮和多酚的菌絲體，是開發(fā)新古尼異蟲草抗氧化產(chǎn)品的有效途徑。試驗(yàn)以自行分離的新古尼異蟲草菌株為材料，系統(tǒng)分析該真菌積累黃酮和多酚等抗氧化活性物質(zhì)的營養(yǎng)條件，利用體外試驗(yàn)評價(jià)產(chǎn)物的抗氧化能力，為抗氧化產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

野生新古尼異蟲草子實(shí)體，采集自貴州省施秉縣。蟲體結(jié)實(shí)飽滿，子座幼嫩未成熟（圖1）。

圖1 野生新古尼異蟲草

1.2 菌種分離及真實(shí)性鑒定

1.2.1 菌種分離

野生新古尼異蟲草帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種分離。清除蟲體表面泥沙等雜物及表面網(wǎng)絲狀物，用75%酒精棉擦拭材料。采用組織分離的方式進(jìn)行菌種分離，用無菌鑷子夾取子實(shí)體和蟲體菌核中的菌肉，接種至PPDA斜面培養(yǎng)基中，在25 ℃下培養(yǎng)14 d。菌種經(jīng)轉(zhuǎn)管純化后用于培養(yǎng)。

1.2.2 分子鑒定

經(jīng)液體培養(yǎng)獲得新古尼異蟲草菌絲體，用無菌水沖洗4次，瀝干水分，用無菌濾紙盡量吸干菌絲體的水分，用于DNA提取。采用CBTA法提取總DNA，利用通用引物進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，由上海生工公司完成測序工作。將序列上傳至GenBank獲得序列號，選取已發(fā)表的相似性高的序列，采用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)樹構(gòu)建，進(jìn)一步明確其分類地位，完成菌種真實(shí)性的分子鑒定。

1.2.3 無性型形態(tài)觀察

將直徑5 mm的菌塊接種至PPDA平板培養(yǎng)基中央，用封口膜封好。置于25 ℃進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)14 d，觀察菌落特征，包括氣生菌絲、色素形成、菌絲致密程度等。采用電子掃描顯微鏡觀察菌絲體和分生孢子形態(tài)特征。

1.3 碳源和氮源對新古尼異蟲草菌絲體生長的影響

將6種碳源分別添加至空白培養(yǎng)基（蛋白胨4 g/L、牛肉浸膏4 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、維生素B10.05 g/L、pH 6.5、CK-C）中，用量20 g/L，配制液體培養(yǎng)基。按5%（V/V）接種量接入一級液體菌種，按25 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，中止培養(yǎng)。用約0.104 mm（150目）孔徑尼龍布收集菌絲體，菌絲體用水沖洗3次以上，于60 ℃烘干至恒重，稱其質(zhì)量。以空白培養(yǎng)基（CK-C）為對照，各組設(shè)置3個(gè)平行。將6種氮源分別添加至空白培養(yǎng)基（葡萄糖20 g/L、KH2PO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、維生素B10.05 g/L、pH 6.5、CK-N）中，用量8 g/L，配制液體培養(yǎng)基。余下步驟同前。以空白培養(yǎng)基（CKN）為對照，各組設(shè)置3個(gè)平行。

1.4 抗氧化活性評價(jià)

1.4.1 提取物的制備

將1.3小節(jié)中各組培養(yǎng)所得的菌絲體研磨成0.85 mm（20目）粒徑大小的粉末，精確稱取0.2 g，按照料液比1∶10 g/mL加入80%乙醇，在80 ℃下水浴加熱提取1 h，按10 000 r/min離心10 min，取上清液，共提取2次，合并上清液，定容至10 mL，即為醇提物。剩余殘?jiān)鼡]盡乙醇，按照料液比1∶10 g/mL加入蒸餾水，沸水浴提取1 h，按10 000 r/min離心10 min，取上清液，共提取2次，合并上清液，定容至10 mL，即為水提物。

1.4.2 總黃酮及總多酚含量測定

總黃酮含量采用AlCl3-NaNO2方法測定[12]；總多酚含量采用酒石酸鐵法測定[13]。

1.4.3 DPPH·清除率測定DPPH·清除率的測定參照葉琦等[14]的方法進(jìn)行，取各提取物100 μL用于測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種真實(shí)性鑒定

2.1.1 分子鑒定

分離獲得一株新古尼異蟲草菌種，編號為Cg7，保存于南京野生植物綜合利用研究所。該菌株ITS序列全長631 bp，序列號為MZ725544。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建結(jié)果，MZ725544與Wen等[1]報(bào)道的新古尼異蟲草的序列KU729718.1和KU729719.1等聚為一個(gè)分支（圖2），證實(shí)試驗(yàn)所分離所得的菌株Cg7是新古尼異蟲草（Metacordyceps neogunnii）。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的新古尼異蟲草系統(tǒng)進(jìn)化樹（鄰接法）

2.1.2 無性型形態(tài)觀察

新古尼異蟲草菌株Cg7生長14 d，菌落直徑5.6 cm，呈致密絨毛狀，具有較明顯的輪層，背面呈墨綠色（圖3 a和b）。通過掃描電子顯微鏡觀察到新古尼異蟲草分生孢子具有明顯的刺狀物（圖3 c）。

圖3 新古尼異蟲草菌落形態(tài)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征

2.2 碳氮源對新古尼異蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響

新古尼異蟲草對部分小分子碳源具有較好的利用能力，對甘油、葡萄糖和蔗糖的利用效果十分接近，無顯著性差異，菌絲體產(chǎn)量分別為11.45，10.67和11.50 g/L，其次是麥芽糖，產(chǎn)量為10.33 g/L，與空白對照組CK-C有顯著性差異（圖4）。乳糖和可溶性淀粉利用能力較差，菌絲體有一定的生長，產(chǎn)量約為2 g/L。所有測試的6種碳源與CK-C均有顯著性差異，不添加碳源的菌絲幾乎不生長?？梢?，菌絲體培養(yǎng)可選用甘油、葡萄糖或蔗糖。

圖4 碳源對新古尼異蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響

6種有機(jī)氮源對菌絲體產(chǎn)量的促進(jìn)作用均十分明顯，其中蛋白胨的效果最好，達(dá)13.11 g/L，而牛肉浸粉的效果相最差，但菌絲體產(chǎn)量在9 g/L以上，遠(yuǎn)高于不添加氮源的空白對照組（CK-N，圖5）。在缺乏氮源的條件下，新古尼異蟲草的菌絲體僅有少量生長，產(chǎn)量只有1.22 g/L。因此，蛋白胨是新古尼異蟲草菌絲體生長的最佳氮源。

圖5 氮源對新古尼異蟲草菌絲體產(chǎn)量的影響

2.3 碳氮源對新古尼異蟲草菌絲體中總黃酮含量的影響

在各碳源培養(yǎng)所得的菌絲體中，醇提物的總黃酮含量均高于水提物?？扇苄缘矸圩鳛樘荚磁囵B(yǎng)獲得的菌絲體中總黃酮含量最高，達(dá)4.9 mg/g，其次是乳糖，為2.8 mg/g（圖6）。而最利于菌絲體生長的蔗糖對總黃酮的生成促進(jìn)作用最小，含量僅為1.2 mg/g。利于菌絲生長的甘油和葡萄糖對總黃酮的積累有較好的促進(jìn)作用，含量均為2.5 mg/g。由于可溶性淀粉為碳源時(shí)菌絲體的產(chǎn)量僅約為葡萄糖或甘油的20%，因此，結(jié)合菌絲體生物量及總黃酮含量，葡萄糖和甘油均可作為富含黃酮菌絲體的碳源。

圖6 碳源對新古尼異蟲草菌絲體中總黃酮含量的影響

6種有機(jī)氮源均能有效地促進(jìn)新古尼異蟲草中總黃酮的形成。酵母浸出粉是新古尼異蟲草菌絲體積累黃酮的最佳氮源，總含量達(dá)3.9 mg/g，其中醇提物和水提物中的含量分別為2.3 mg/g和1.6 mg/g，其次是牛肉浸粉，總含量為3.5 mg/g，黃豆粉次之（圖7）。而土豆浸出粉對總黃酮的形成影響最小，含量為2.6 mg/g，比空白對照組高了近2倍。結(jié)合菌絲體生物量考慮，選擇黃豆粉為新古尼異蟲草形成總黃酮的最佳氮源。

圖7 氮源對新古尼異蟲草菌絲體中總黃酮含量的影響

2.4 碳氮源對新古尼異蟲草菌絲體中總多酚含量的影響

在各碳源培養(yǎng)所得的新古尼異蟲草菌絲體中，醇提取中總多酚的含量均高于水提物。最利于總多酚積累的碳源是蔗糖，總含量為16.8 mg/g，其中醇提物的含量為14.4 mg/g，其次是麥芽糖，總含量為14.5 mg/g（圖8）。而利于菌絲生長的甘油則對總多酚的積累無顯著的促進(jìn)作用，僅為3.4 mg/g，僅比空白對照組高了0.3 mg/g，無顯著性差異。蔗糖對菌絲體的產(chǎn)量和總多酚的積累均為最佳，因而是新古尼異蟲草生產(chǎn)總多酚的最佳碳源。氮源中蛋白胨對新古尼異蟲草菌絲體中總多酚含量影響最顯著，含量為9.7 mg/g，其中醇提物中含量最高，為6.5 mg/g，其次是黃豆粉。而酵母浸出粉為氮源時(shí)，水提物的總多酚含量最高，為4.6 mg/g（圖9）。結(jié)合菌絲體生物量因素，蛋白胨是新古尼異蟲草產(chǎn)生總多酚的最佳氮源。

圖8 碳源對新古尼蟲草菌絲體中總多酚含量的影響

圖9 氮源對新古尼蟲草菌絲體中總多酚含量的影響

2.5 碳氮源對新古尼蟲草菌絲體DPPH·清除能力的影響

葡萄糖為碳源時(shí)，菌絲體的醇提物對DPPH·清除率最高，達(dá)92.74%，其次是可溶性淀粉和麥芽糖，分別為85.18%和84.34%（圖10）。其余3種碳源培養(yǎng)的菌絲體的提取物均低于空白對照組，未能提高菌絲體的抗氧化活性。而水提物方面，只有可溶性淀粉對菌絲體的抗氧化活性具有促進(jìn)作用，而甘油作碳源的菌絲體水提物清除率最低，僅為18.20%。

圖10 碳源對新古尼蟲草菌絲體抗氧化活性的影響

氮源對菌絲體的抗氧化活性有較好的促進(jìn)作用。牛肉浸粉、蛋白胨和蠶蛹粉培養(yǎng)所得的菌絲體的醇提物對DPPH·清除率均高于空白對照組，其中以牛肉浸粉最高，為91.51%（圖11）。僅蠶蛹粉和黃豆粉為氮源獲得的菌絲體水提物的清除率高于空白對照組，且高于其醇提物的清除率。土豆浸出物為氮源獲得的菌絲體水提物對DPPH·的清除率最低，僅為17.11%。

圖11 氮源對新古尼蟲草菌絲體抗氧化活性的影響

3 討論與結(jié)論

新古尼異蟲草是以昆蟲為寄主的真菌，其內(nèi)菌核定殖了其他微生物[15]，加之該蟲草子實(shí)體纖細(xì)，導(dǎo)致所分離菌種純度易受影響，分離難度比一般大型真菌大。從其他蟲草資源的研究歷程來看，菌種的真實(shí)性鑒定是有必要的。因此，試驗(yàn)對所采用的菌株進(jìn)行ITS測序和系統(tǒng)樹構(gòu)建，結(jié)合無性型的形態(tài)特征，明確該菌株的真實(shí)性，為后續(xù)研究提供真實(shí)有效的新古尼異蟲草菌種。

新古尼異蟲草的菌株差異對研究有重要影響。根據(jù)蔣嵐等[16]的研究，新古尼異蟲草菌株可劃分為3個(gè)類型，其中產(chǎn)棕色色素的菌株菌絲體生物量最高，活性成分含量高，適用于規(guī)?；a(chǎn)。而賈學(xué)淵等[17]則認(rèn)為產(chǎn)綠色素的菌株產(chǎn)活性成分能力更強(qiáng)。試驗(yàn)采用的菌株Cg7屬于產(chǎn)綠色素的類型（圖3b）。鑒于菌株類型與活性之間未有確切的相關(guān)性，以自行分離的菌株為材料，對影響菌絲體生長、黃酮和多酚等次生代謝成分的積累及抗氧化活性的碳氮源情況進(jìn)行較系統(tǒng)的分析。菌株Cg7菌絲體生長的最佳碳氮源分別是蔗糖和蛋白胨，與曹蕾等[10]和劉曉翠等[11]的報(bào)道不完全一致。菌株Cg7對可溶性淀粉的利用能力極差，產(chǎn)量僅為3 g/L，遠(yuǎn)低于劉曉翠等[11]報(bào)道的14.7 g/L。因此，對于新獲得的菌株，在進(jìn)行規(guī)?；瘧?yīng)用前有必要對其進(jìn)行系統(tǒng)的生物學(xué)研究。

新古尼異蟲草含有多種活性物質(zhì)，包括黃酮和多酚[3,8]，多糖也被證實(shí)具有較好的抗氧化活性[7]，其抗腫瘤活性受培養(yǎng)基的影響[18]。為了更有針對性地提高培養(yǎng)產(chǎn)物的產(chǎn)量，對新古尼異蟲草菌絲體生長及與抗氧化相關(guān)的黃酮和多酚積累條件進(jìn)行初步篩選。最利于黃酮積累的碳源和氮源分別是可溶性淀粉和酵母浸出物，其含量分別為4.9和3.9 mg/g，遠(yuǎn)高于九州蟲草總黃酮的含量1.89 mg/g[19]。篩選獲得最利于新古尼異蟲草菌絲體多酚積累的碳氮源，即蔗糖和蛋白胨，總含量分別為16.8和9.7 mg/g，高于口蘑等食用菌中的含量[20]。

不少試驗(yàn)證實(shí)，多酚與抗氧化活性存在較明確的相關(guān)性，可有針對性地培養(yǎng)生產(chǎn)。從新古尼異蟲草菌絲生長情況可得知，這個(gè)菌株對碳氮源有著較嚴(yán)格的要求，除了具有明顯的選擇性外，在缺乏碳源或氮源時(shí)，其生長均受到顯著的限制，繼而影響次生代謝產(chǎn)物黃酮和多酚的產(chǎn)量，但菌絲體的生物量與次生代謝產(chǎn)物含量無相關(guān)性，這與多糖發(fā)酵的結(jié)果一致[11]。

利用體外清除DPPH自由基的方法測定新古尼異蟲草不同發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性，并測定與抗氧化密切相關(guān)的黃酮和多酚的含量，研究發(fā)現(xiàn)它們之間無相關(guān)性，這與已有報(bào)道相一致[21]。根據(jù)章能勝等[22]的試驗(yàn)結(jié)果，從古尼擬青霉中分離純化得到2個(gè)高純度的強(qiáng)抗氧化活性成分，可推測菌絲體中可能含有其他可清除DPPH·的物質(zhì)。通過此研究證實(shí)新古尼異蟲草是抗氧化活性研究的潛在大型真菌，為其開發(fā)應(yīng)用提供有力參考依據(jù)。