魏瑞霖，朱晨，賴朋，曾智康，段樹華，陳晟

西華大學 食品與生物工程學院（成都 611730）

川明參（Chuanminshen violaceumSheh et Shan），別名明參、明沙參、土明參，是我國特有的單種屬植物，為傘形科川明參屬植物的干燥根，是四川道地中藥材，在其主產(chǎn)地常被用作滋補佳品食用，具有病后補虛和強筋健骨等功效[1-4]。川明參中含有多糖、香豆素、黃酮、甾醇、蛋白質(zhì)和氨基酸、有機酸、酚類等化學成分[5-10]，其中多糖類化合物是川明參中最主要成分，含量在占80%以上，已有的研究表明川明參多糖具有抗突變、鎮(zhèn)咳、祛痰、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞和抗氧化等功效[11-16]，可作為醫(yī)藥和保健食品而被廣泛運用，如何更加有效地萃取川明參多糖已成為愈加重要的問題。

目前常用的萃取川明參多糖的方法有熱水浸提法和熱回流法[17-18]，但這些方法在萃取過程中具有耗能大、耗時久、萃取溫度高從而降低多糖活性等缺點。而超臨界CO2萃取具有污染低、能耗低、耗時短、得率高、萃取溫度不高、不容易引起多糖物質(zhì)的變性等優(yōu)點[19-21]，近幾年超臨界CO2萃取也被廣泛地運用到植物活性物質(zhì)的萃取之中，但對于川明參多糖物質(zhì)的萃取還未見有其報道。

試驗采用超臨界CO2萃取法進行川明參多糖物質(zhì)的萃取，并采用苯酚-硫酸法[22]測定其多糖含量，詳細地研究了超臨界CO2萃取法萃取川明參多糖的工藝條件，為川明參多糖的開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

新鮮川明參2021年由四川參巴中市購買所得，由西華大學張良副教授鑒定為傘形科川明參屬植物川明參Chuanminshen viloaceumSheh et Shen.的干燥根。葡萄糖、無水乙醇、濃硫酸、苯酚、石油醚（分析純，成都市科龍化工試劑廠）。

ZN-200A高速中藥粉碎機（長沙市岳麓區(qū)中南制藥機械廠）；TB-214型分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；SpectraMax i3x多功能酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；Nicolet iS10近紅外光譜儀（上海斯邁歐分析儀器有限公司）；HA100-50-0.5型超臨界萃取裝置（江蘇華安科研儀器有限公司）；DHG-9035A恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器）；YR-PTB真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 川明參多糖超臨界CO2萃取醇沉工藝流程

新鮮川明參→干燥→粉碎→過篩→脫脂、脫色、除小分子糖→超臨界CO2萃取→旋轉蒸發(fā)有機溶劑→離心→醇沉→干燥→粗多糖

1.2.2 樣品預處理

將新鮮川明參清洗掉表面泥土等污垢后，置于恒溫鼓風干燥箱中，于40 ℃干燥至恒重，隨后運用中藥粉碎器對其進行粉碎，過0.425 mm篩，除去蛋白質(zhì)及小分子物質(zhì)后干燥，密封于4 ℃冰箱中保存。

1.2.3 川明參多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定川明參中粗多糖含量。

1.2.3.1 標準曲線的繪制

精密稱取50.0 mg于105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品于50 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的葡萄糖標準儲備液，密封，于4 ℃冰箱中保存，備用。分別精密移取2，4，6，8，10和12 mL葡萄糖標準儲備液于100 mL容量瓶中定容搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08，0.10和0.12 mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別吸取2 mL標準溶液于10 mL具塞試管中，迅速加入1.0 mL 5%苯酚溶液，搖勻，再小心加入5.0 mL濃硫酸，搖勻。室溫下靜置5 min，再水浴加熱15 min，水浴溫度為90 ℃。取出冷卻至室溫，用酶標儀在490 nm波長處測定吸光度，測量時以蒸餾水作為空白對照。以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[23]。

1.2.3.2 供試品溶液的制備

采用水提醇沉法制備粗多糖，醇沉方法參考張梅等[17]，并有所改動。稱取一定量預先處理的川明參粉末加入萃取罐中，運用夾帶劑罐將一定濃度、料液比的無水乙醇送入萃取罐，在一定萃取壓力、萃取時間、萃取溫度條件下進行萃取，萃取完畢后取出，迅速采用旋轉蒸發(fā)儀器將其中有機溶劑蒸出，干燥后加無水乙醇至體積分數(shù)為90%沉淀多糖，放置過夜，離心，沉淀部分用蒸餾水溶解，稀釋一定倍數(shù)得川明參多糖待測液。

1.2.3.3 多糖萃取率計算

川明參多糖萃取率按式（1）計算。

式中：Y為川明參多糖萃取率，%；c為樣品測定液中葡萄糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；f為稀釋倍數(shù)；m為試驗所取的川明參粉末質(zhì)量，g。

1.2.4 夾帶劑單因素試驗

準確稱取適量預先處理的川明參粉末，選取不同濃度夾帶劑（90%乙醇，70%乙醇，50%乙醇和30%乙醇）和料液比[1∶1，1∶2，1∶3和1∶4（g/mL）]，進行單因素試驗，分別考察不同條件夾帶劑對超臨界CO2萃取川明參多糖萃取率的影響。結果顯示，初始的單因素條件分別為萃取夾帶劑濃度70%乙醇，料液比1∶3（g/mL）。

1.2.5 萃取單因素試驗

在上述夾帶劑單因素試驗結果下進行以下試驗。

1.2.5.1 萃取溫度

固定萃取時間1.5 h、萃取壓力20 MPa，考察不同萃取溫度（35，40，45和50 ℃）對川明參多糖萃取率的影響。

1.2.5.2 萃取時間

固定萃取溫度40 ℃、萃取壓力20 MPa，考察不同萃取時間（1，1.5，2和2.5 h）對川明參多糖萃取率的影響。

1.2.5.3 萃取壓力

固定萃取溫度40 ℃、萃取時間1.5 h，考察不同萃取壓力（15，20，25和30 MPa）對川明參多糖萃取率的影響。

1.2.6 川明參多糖超臨界CO2萃取的正交試驗設計

在前面單因素試驗的基礎上，采用三因素三水平，按L9(33)正交設計進行川明參多糖超臨界CO2萃取正交試驗，各因素及水平設計如表1所示，每組試驗重復3次。

表1 正交試驗因素與水平

1.2.7 超臨界CO2萃取次數(shù)對多糖萃取率的影響

對通過正交試驗所得最佳萃取工藝進行萃取次數(shù)的試驗，考察不同次數(shù)（1，2，3和4次）對川明參多糖萃取率的影響。

1.2.8 川明參多糖超臨界CO2萃取與傳統(tǒng)萃取法的比較

分別對超臨界CO2萃取法、傳統(tǒng)熱浸提法進行川明參多糖的萃取率的測定，比較二者的優(yōu)劣。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

每組單因素試驗平行進行3次，取平均值，數(shù)據(jù)利用Origin 8.0進行繪圖；使用SPSS 24.0數(shù)據(jù)分析軟件對正交試驗結果進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以葡萄糖濃度為橫坐標，相應的吸光度為縱坐標進行線性回歸，得到回歸方程y=9.048 57x+0.156 6，R2=0.998 13。試驗結果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在0.02～0.12 mg/mL之間與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關系。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 夾帶劑單因素試驗結果

2.2.1 夾帶劑對川明參多糖萃取率的影響

表2顯示了在不同夾帶劑濃度的使用下，川明參多糖萃取率的變化情況。圖2反映了不同夾帶劑濃度對川明參多糖萃取率的影響趨勢?？梢?，在夾帶劑為90%乙醇時達到最佳多糖萃取率。夾帶劑的加入能夠與CO2流體相容，大大地提高川明參多糖在CO2流體中的溶解度，因而增加其多糖萃取率，因此，選擇夾帶劑90%乙醇進行后續(xù)試驗考察。

表2 夾帶劑對川明參多糖萃取率的影響

圖2 夾帶劑濃度對川明參多糖萃取率的影響

2.2.2 夾帶劑料液比對川明參多糖萃取率的影響

表3顯示了在不同料液比下，川明參多糖萃取率的變化情況。圖3顯示了料液比對多糖萃取率的影響趨勢。根據(jù)圖3的走勢情況可以看到，隨著料液比變化至1∶3（g/mL），多糖萃取率液呈線性增長，但隨后多糖萃取率呈下降趨勢，這可能是因為過大的液體比反而使得萃取不完全，導致多糖萃取率的降低，因此在料液比1∶3（g/mL）的條件下可取得最大多糖萃取率，所以在接下來單因素試驗中選擇夾帶劑90%乙醇、料液比1∶3（g/mL）進行試驗。

表3 料液比對川明參多糖萃取率的影響

圖3 料液比對川明參多糖萃取率的影響

2.3 萃取單因素試驗

根據(jù)2.2小節(jié)所得結果，在夾帶劑90%乙醇、料液比1∶3（g/mL）的條件下進行如下試驗。

2.3.1 萃取溫度對川明參多糖萃取率的影響

表4顯示了在不同萃取溫度下，川明參多糖萃取率的變化情況。通過圖4走勢可以得到，隨著萃取溫度的升高，川明參多糖萃取率明顯增加，在萃取溫度為50 ℃時達到最大值，此時得率為21.6%。在一定溫度范圍內(nèi)，多糖溶質(zhì)分子溶出速度隨著溫度升高而加快，萃取率上升。當萃取溫度超過45 ℃后，川明參多糖萃取率雖然仍在增加，但增加曲線斜率開始下降，這可能是溫度過高導致部分多糖發(fā)生降解。因此，選擇萃取溫度40，45和50 ℃進行后續(xù)正交試驗考察。

表4 萃取溫度對川明參多糖萃取率的影響

圖4 萃取溫度對多糖萃取率的影響

2.3.2 萃取時間對川明參多糖萃取率的影響

表5顯示了在不同萃取時間下，川明參多糖萃取率的變化情況。通過圖5走勢可以得到，隨著萃取時間的增加，川明參多糖萃取率明顯增加，在萃取時間為2 h時達到最大值，此時得率為19.98%。浸提時間超過2 h之后，多糖萃取率有所下降。這可能是因為：多糖溶解需要一定的時間才能達到平衡，在達到平衡前，隨著時間的增加，多糖溶解更多，萃取率也隨之增大；但在達到平衡后，多糖的溶出量基本穩(wěn)定[23]，萃取率增加幅度變小，浸提時間再延長甚至可能導致多糖不穩(wěn)定而發(fā)生降解，進而導致萃取率下降。因此，選擇萃取時間1.5，2和2.5 h進行后續(xù)正交試驗考察。

表5 萃取時間對川明參多糖萃取率的影響

圖5 萃取時間對川明參多糖萃取率的影響

2.3.3 萃取壓力對川明參多糖萃取率的影響

表6顯示了在不同萃取壓力下，川明參多糖萃取率的變化情況。通過圖6走勢可以得到，在一定壓力范圍內(nèi)，隨著萃取壓力的升高，超臨界CO2流體密度增大，溶解能力增強，從而提高了川明參多糖萃取率，不過當壓力增大到一定的程度后，超臨界CO2流體接近于液態(tài)流體，其密度不再隨壓力變化[24]，對川明參多糖萃取率影響也變小，故在壓力達到30 MPa時，川明參多糖萃取率反而開始下降。另外，考慮到設備操作、生產(chǎn)成本和安全問題，一般也不宜將壓力設置得太高。所以將試驗的較適宜萃取壓力定為25 MPa。因此，選擇萃取壓力15，20和25 MPa進行后續(xù)正交試驗考察。

表6 萃取壓力對川明參多糖萃取率的影響

圖6 萃取壓力對川明參多糖萃取率的影響

2.4 正交試驗結果

正交優(yōu)化試驗結果如表7所示。由結果可知，所考察的3個因素中各因素對多糖萃取率的影響順序是A＞C＞B，即萃取溫度＞萃取壓力＞萃取時間，其水平優(yōu)劣次序分別為A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1。對正交試驗結果進行方差分析，其結果見表8。從方差分析結果可以看出，A因素即萃取溫度對川明參多糖萃取率具有極顯著影響（P＜0.01），C因素即萃取壓力對川明參粗多糖萃取率具有顯著影響（P＜0.05），因素B萃取時間對川明參粗多糖萃取率影響不顯著。因此直觀分析結合方差分析結果確定，川明參多糖最佳萃取工藝條件為A3B2C3，即萃取溫度50℃，萃取時間2 h，萃取壓力25 MPa。

表7 正交試驗結果

表8 方差分析結果

根據(jù)上述優(yōu)化萃取條件，在最佳因素組合A3B2C3（萃取溫度50 ℃，萃取時間2 h，萃取壓力25 MPa）條件下進行3組平行試驗，川明參粗多糖萃取率結果見表9。

表9 在A3B2C3試驗條件下的多糖萃取結果

由表9驗證試驗結果可知，川明參多糖最佳萃取工藝條件為A3B2C3，即萃取溫度50 ℃，萃取時間2 h，萃取壓力25 MPa，此時川明參多糖最佳萃取率為23.81%。

2.5 超臨界CO2法萃取次數(shù)對川明參多糖萃取率的影響

如圖7所示，超臨界CO2萃取次數(shù)達到2次時已達到基本完全萃取，考慮到經(jīng)濟以及時間成本，故將2次萃取定為川明參多糖最佳萃取次數(shù)。

圖7 萃取次數(shù)對川明參多糖萃取率的影響

2.6 超臨界CO2法與常規(guī)傳統(tǒng)熱浸提法的比較

傳統(tǒng)熱浸提法：稱取一定量預處理完畢后的川明參粉末，放入燒杯中并加入1∶35（g/mL）料液比的蒸餾水，攪拌均勻后浸泡30 min后放入100 ℃水浴鍋中浸提8.00 h，萃取2次，測定其川明參多糖的萃取率。將傳統(tǒng)熱浸提法結果與超臨界CO2法結果相比較，結果見表10。

表10 超臨界CO2萃取與傳統(tǒng)熱浸提結果

3 結論

試驗通過單因素試驗和正交試驗，首次將超臨界CO2萃取運用于川明參粗多糖的萃取試驗，主要得到以下結論：

1) 設計超臨界CO2萃取夾帶劑選擇試驗，得到運用夾帶劑90%乙醇，料液比1∶3（g/mL）的乙醇溶液作為萃取夾帶劑可得到最佳川明參粗多糖萃取率。

2) 運用SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元線性回歸分析，結果顯示，在選定的水平范圍內(nèi)所考察的3個因素對川明參粗多糖萃取率的影響分別為萃取溫度＞萃取壓力＞萃取時間。通過正交試驗結果表明最佳萃取工藝為萃取溫度50 ℃，萃取時間2 h，萃取壓力25 MPa，其中萃取溫度對川明參粗多糖萃取率具有極顯著影響（P＜0.01），萃取壓力對川明參粗多糖萃取率具有顯著影響（P＜0.05）。

3) 研究得到的萃取工藝與傳統(tǒng)水提工藝相比，克服了后者由于高溫從而容易破壞多糖分子活性、萃取時間過長等缺點，并且由于萃取系統(tǒng)采用CO2氣體，使得對環(huán)境的污染降低，且更加節(jié)能。通過驗證試驗加以檢驗，按最優(yōu)萃取工藝萃取2次的粗多糖得率為23.81%，從而證明通過研究得到的萃取工藝是穩(wěn)定、可靠的。