王 威，王琳琳，劉 婷，石玉琪，馬 慧，王子見

(1.河北省秦皇島市山海關(guān)人民醫(yī)院，河北 秦皇島 066200；2.西安文理學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院；西安秦嶺天然產(chǎn)物開發(fā)與創(chuàng)新藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；西安文理學(xué)院 基因工程實(shí)驗(yàn)室，西安 710065)

癌癥是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì).食管癌是一種常見的癌癥，發(fā)病率排在第6位，而死亡率排在第4位，超過了發(fā)病率高的結(jié)直腸癌、乳腺癌，2020年全世界大概有54萬人死于這種癌癥[1].食管癌的臨床癥狀表現(xiàn)為不同程度的吞咽困難、梗阻、胸骨后疼痛[2].食道癌是一種臨床上具有挑戰(zhàn)性的疾病，需要多學(xué)科的治療方法.內(nèi)窺鏡手術(shù)越來越多地用于治療癌前和早期食管腫瘤.對(duì)于晚期食管癌，一線治療目前僅限于氟嘧啶加鉑類化療[3].化療或放化療的新輔助治療已作為局部晚期食管癌標(biāo)準(zhǔn)治療的補(bǔ)充手術(shù).最新研究表明，一線治療食管癌的PD-1免疫檢查點(diǎn)抑制劑帕博利珠單抗聯(lián)合含鉑化療能夠治療不可切除或不適合根治性放化療的局部晚期或轉(zhuǎn)移性的食管癌或胃食管交界部癌[4].目前，食管癌的化療聯(lián)合免疫療法已經(jīng)在臨床研究有了突破，但是小分子藥物因其簡單方便仍然具有不可替代的優(yōu)勢(shì).

青蒿素是一種從菊科植物黃花蒿中提取到的倍半萜內(nèi)酯類藥物，它已被評(píng)定為世界上唯一有效治療瘧疾的藥物.它的衍生物主要包括青蒿素甲醚(蒿甲醚)、青蒿素乙醚、雙氫青蒿素以及青蒿琥酯等.青蒿素及衍生物不僅在抗瘧方面有很好的作用，還能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具有抗腫瘤作用.研究顯示，蒿甲醚包含獨(dú)特的內(nèi)過氧橋結(jié)構(gòu)，具有很好的抗腫瘤作用[5].因此，本研究通過CCK-8方法，探討蒿甲醚對(duì)食管癌ECA-109細(xì)胞增殖的影響，探討蒿甲醚的抗癌效果，從而為蒿甲醚在治療癌癥方面的作用機(jī)制以及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及分組

食管癌細(xì)胞株ECA-109由西安秦嶺天然產(chǎn)物開發(fā)與創(chuàng)新藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室成曉霞老師饋贈(zèng)，細(xì)胞分成空白對(duì)照組(未處理組)、DMSO處理組、不同濃度的蒿甲醚處理組(0.1 μM、1 μM、10 μM、100 μM)六個(gè)組，處理時(shí)間分別為2 h、4 h、6 h和24 h.因蒿甲醚為脂溶性，溶解在DMSO試劑里，所以將DMSO單獨(dú)加藥設(shè)為陰性對(duì)照組.蒿甲醚(Artemether；71963-77-4)購自北京百靈威科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液(批號(hào)：SH30809.01)購自Hyclone公司；青霉素/鏈霉素(批號(hào)：SV30010)購自Hyclone公司；胎牛血清(批號(hào)：16060501)購自浙江天杭生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8試劑盒(批號(hào)：C0038)購自碧云天公司；DMSO(批號(hào)：D4540)購自Sigma Life Science公司；PBS(批號(hào)：BF005)購自西安赫特生物公司；0.25%Trypsin(批號(hào)：SH30042.01)購自Hyclone公司.

1.2 主要儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀(型號(hào)：Elx800)廠家為Gene Company Limited公司；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：BD Accri C6)廠家為BD；二氧化碳培養(yǎng)箱(型號(hào)：Shell Lab 3503-02)廠家為Shell Lab；倒置顯微鏡(型號(hào)：Olympus CorporationCKX41)廠家為Olympus；生物安全柜(型號(hào)：SG403A-HE-INT)廠家為Baker Company.

1.3 CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)方法

該方法是一種基于WTS-8的快速高靈敏檢測(cè)試劑盒，廣泛應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性.將食管癌細(xì)胞株ECA-109鋪板至96孔板，每孔接種8 000個(gè)細(xì)胞，加RPMI 1640培養(yǎng)液200 μL，放置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁生長至每孔孔底的80%以上.加藥處理，設(shè)置空白對(duì)照組(不加藥)，陰性對(duì)照組(DMSO)以及藥物處理照組(四組：不同濃度蒿甲醚溶液0.1 μM,1 μM,10 μM,100 μM)，每個(gè)組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔.加藥2 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5h，用酶標(biāo)儀在450nm處檢測(cè)OD值，以及持續(xù)檢測(cè)加藥4h、6h以及24h的OD值.

1.4 數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以空白對(duì)照組(Untreated)、DMSO對(duì)照組與不同濃度的蒿甲醚藥物處理組為橫坐標(biāo)，相對(duì)于DMSO組的OD值為縱坐標(biāo).黑色實(shí)心圓為空白對(duì)照組數(shù)據(jù)，灰色空心圓為DMSO組數(shù)據(jù)，黑色實(shí)心方塊為蒿甲醚在0.1 μM濃度時(shí)數(shù)據(jù)，黑色實(shí)心上三角為蒿甲醚在1 μM濃度時(shí)數(shù)據(jù)，黑色實(shí)心下三角為蒿甲醚在10 μM濃度時(shí)數(shù)據(jù)，黑色實(shí)心菱形為蒿甲醚在100 μM濃度時(shí)數(shù)據(jù).CCK-8獨(dú)立性實(shí)驗(yàn)次數(shù)n=4，每次5個(gè)重復(fù)孔；采用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較采用T-test.*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 蒿甲醚處理2 h能夠抑制食管癌細(xì)胞株ECA-109增殖

將處于對(duì)數(shù)生長期的食管癌ECA-109細(xì)胞鋪板到96孔板，設(shè)置不加藥的空白對(duì)照組、DMSO陰性對(duì)照組以及不同濃度的蒿甲醚實(shí)驗(yàn)組(0.1 μM,1 μM,10 μM,100 μM)，處理2 h后，加入20 μL CCK-8試劑，反應(yīng)0.5 h后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的光吸收值(OD值).結(jié)果表明(圖1)，濃度為100 μM的蒿甲醚對(duì)食管癌ECA-109細(xì)胞處理2 h后，對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用，且相對(duì)于DMSO對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

圖1 不同濃度的蒿甲醚處理2 h對(duì)食道癌細(xì)胞株ECA-109增殖的影響

2.2 蒿甲醚處理4 h能夠抑制食管癌細(xì)胞株ECA-109增殖

將處于對(duì)數(shù)生長期的食管癌ECA-109細(xì)胞鋪板到96孔板，設(shè)置不加藥的空白對(duì)照組、DMSO陰性對(duì)照組以及不同濃度的蒿甲醚實(shí)驗(yàn)組(0.1 μM,1 μM,10 μM,100 μM)，處理4 h后，加入20 μL CCK-8試劑，反應(yīng)0.5 h后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的光吸收值(OD值).結(jié)果表明(圖2)濃度為100 μM的蒿甲醚對(duì)食管癌ECA-109細(xì)胞處理4 h后，對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用，且相對(duì)于DMSO對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).

圖2 不同濃度的蒿甲醚處理4 h對(duì)食管癌細(xì)胞株ECA-109增殖的影響

2.3 蒿甲醚處理6 h顯示出抑制食管癌細(xì)胞株ECA-109增殖的趨勢(shì)

將處于對(duì)數(shù)生長期的食管癌ECA-109細(xì)胞鋪板到96孔板，設(shè)置不加藥的空白對(duì)照組、DMSO陰性對(duì)照組以及不同濃度的蒿甲醚實(shí)驗(yàn)組(0.1 μM,1 μM,10 μM,100 μM)，處理6 h后，加入20 μL CCK-8試劑，反應(yīng)0.5 h后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的光吸收值(OD值).結(jié)果表明(圖3)，濃度為100 μM的蒿甲醚對(duì)食管癌ECA-109細(xì)胞處理6 h后，對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用的趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.07).

圖3 不同濃度的蒿甲醚處理6 h對(duì)食管癌細(xì)胞株ECA-109增殖的影響

2.4 蒿甲醚處理24 h抑制食管癌細(xì)胞株ECA-109增殖的效果減弱

將處于對(duì)數(shù)生長期的食管癌ECA-109細(xì)胞鋪板到96孔板，設(shè)置不加藥的空白對(duì)照組、DMSO陰性對(duì)照組以及不同濃度的蒿甲醚實(shí)驗(yàn)組(0.1 μM,1 μM,10 μM,100 μM)，處理24 h后，加入20 μL CCK-8試劑，反應(yīng)0.5 h后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的光吸收值(OD值).結(jié)果表明(圖4)，濃度為100 μM的蒿甲醚對(duì)食管癌ECA-109細(xì)胞處理24 h后，對(duì)細(xì)胞增殖沒有顯著抑制作用.

圖4 不同濃度的蒿甲醚處理24 h對(duì)食管癌細(xì)胞株ECA-109增殖的影響

3 結(jié)論

食管癌是消化道腫瘤最常見的惡性腫瘤之一，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，在臨床治療取得很大進(jìn)展.目前治療腫瘤的主要方法有手術(shù)治療以及化學(xué)治療，但這些治療手段只能抑制病情的發(fā)展速度，不能徹底治愈，而且這些方法對(duì)患者的身體也會(huì)造成傷害[1].因此，尋找一種對(duì)身體毒性低，副作用小的小分子化合物尤為重要.青蒿素是從植物黃花蒿莖葉中提取出來的一種無色晶體，主要用來進(jìn)行抗瘧治療.通過對(duì)青蒿素修飾改造產(chǎn)生的衍生物也應(yīng)用于抗瘧治療中.研究表明，青蒿素及其衍生物可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，具有抑制腫瘤生長的作用[6].而且，青蒿素類藥物副作用低，毒性小，聯(lián)合其他化療藥物治療腫瘤的效果加倍，據(jù)此我們檢測(cè)蒿甲醚對(duì)食管癌細(xì)胞株ECA-109增殖的抑制作用.

在本研究中，我們通過CCK-8法測(cè)定不同濃度梯度及不同時(shí)間梯度的蒿甲醚對(duì)食管癌ECA-109細(xì)胞增殖的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與DMSO陰性對(duì)照組相比，在蒿甲醚濃度為100 μM，處理2 h以及4 h后對(duì)ECA-109細(xì)胞的增殖有抑制作用，且數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).在濃度為100 μM的蒿甲醚對(duì)食管癌ECA-109細(xì)胞處理4 h后增殖抑制作用效果最為明顯.這表明加入蒿甲醚進(jìn)行藥物處理后，細(xì)胞增殖受到抑制，隨著作用濃度的增加，顯示抑制作用增強(qiáng)，但處理24 h后，抑制效果消失，可能是時(shí)間較長藥物效果消失.

青蒿素及其衍生物不管是在抗瘧疾還是抗腫瘤的治療中，都是最近研究的熱點(diǎn)[7].近年來，食管癌的發(fā)病率及其死亡率越來越高，但治療手段依然沒有較大突破，而蒿甲醚對(duì)食管癌ECA-109細(xì)胞增殖抑制作用的發(fā)現(xiàn)，不僅在臨床前研究方面提供了科學(xué)依據(jù)，而且為食管癌的臨床治療提供了新思路.