李佳蕓, 王欣之, 韋源青, 林彬燕, 劉睿,3*, 吳皓*

1(江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京，210023)2(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京，210023) 3(南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京，210023)

馬氏珍珠貝(PinctadamartensiiDunker)為軟體動物門雙殼綱珍珠貝目珍珠貝科珠母貝屬動物，主產(chǎn)于廣西北海，是海水珍珠的母貝，具有重要的藥用價值及經(jīng)濟(jì)價值。在馬氏珍珠貝生產(chǎn)珍珠過程中，其軟體部分被丟棄，未得到充分利用。傳統(tǒng)本草記載海洋貝類軟體具有多種功效，如《本草綱目》記載蛤蜊肉潤五臟，止消渴；《中華本草》記載干貝味甘，咸，性微溫，主消渴；《食療本草》記載蚌肉味甘，咸，性寒，主煩熱，消渴；蟶肉甘、咸、寒，主治煩熱口渴；《本草綱目》記載牡蠣肉甘、溫、無毒，治酒后煩熱，止渴?，F(xiàn)代研究表明貝類軟體中主要為蛋白質(zhì)類成分，其經(jīng)酶解后可釋放出多種生物活性肽，如抗氧化肽、降糖肽、降壓肽等，其中降糖活性肽尤其受到關(guān)注。雜色蛤酶解物中的肽類成分可通過抑制二肽基肽酶-IV(dipeptidylpeptidase-IV，DPP-IV)的活性及減少胰島素抵抗發(fā)揮降糖作用[1]；扇貝裙邊可改善正常小鼠對糖的耐受能力[2]，華貴櫛孔扇貝的閉殼肌酶解產(chǎn)物具有抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和脂肪酶的活性[3]；風(fēng)味蛋白酶酶解牡蠣得到的多肽對α-淀粉酶的半數(shù)抑制率IC50為3.806 mg/mL[4]。

近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)被廣泛應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點(diǎn)和分子機(jī)制。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，董又滋等[5]對黃芪-當(dāng)歸藥的成分進(jìn)行了分析，結(jié)果表明其中的22個生物活性成分可能通過作用于白細(xì)胞介素-6(interlukin-6, IL-6)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor , VEGF) A、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、TP53基因、核轉(zhuǎn)錄因子等多個靶點(diǎn)治療擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)，其主要途徑為調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、改善氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)糖脂代謝；孫元芳等[6]對桑葉的研究表明桑葉中的槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等19個關(guān)鍵藥效成分以前列腺素內(nèi)過氧化物合酶-2(prostaglandin-endoperoxide synthase-2, PTGS2)、IL-6、TNF、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3 beta, GSK3B)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3, CASP3)、血清白蛋白(albumin, ALB)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、雄激素受體(androgen receptor, AR)為關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)胰島素抵抗、IL-17、TNF信號通路和糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路，起到降糖作用。通過分子對接技術(shù)，吳娟等[7]對黃連-肉桂治療糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明黃連中各生物堿成分與糖尿病各蛋白靶點(diǎn)均有較強(qiáng)結(jié)合，肉桂藥效成分與靶點(diǎn)過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors γ, PPAR-γ)、AR、胰島素樣生長因子受體(insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R)、血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptors, PDGFR)結(jié)合活性較好。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合分子對接技術(shù)可用于復(fù)雜體系中降糖活性成分的發(fā)現(xiàn)，具有快速高效、整體性、系統(tǒng)性等優(yōu)勢與特點(diǎn)[8]。

基于此，本文以馬氏珍珠貝軟體為對象，通過模擬酶切獲得其肽類成分信息，將分子對接技術(shù)篩選與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)合，篩選馬氏珍珠貝中潛在活性肽類成分，最終通過體外活性評價實(shí)驗(yàn)確證獲得的肽類成分的DPP-IV抑制活性，從而快速尋找發(fā)現(xiàn)馬氏珍珠貝軟體的潛在降糖活性肽。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

Chem Draw 7.0;Peptide Cutter(https://web.expasy.org/peptide cutter/);SYBYL-X2.0;GeneCards(https://www.genecards.org/);OMIM-GENE-MAP(https://omim.org/search/advanced/geneMap)Cytoscape 3.7.0;Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1);Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/);RCSB PDB(http:/www.rcsb.org/pdb);String 11.0數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org)。

1.2 材料與儀器

新鮮馬氏珍珠貝軟體，采自廣西北海；DPP-IV，美國BioLegend公司；IIe-Pro-IIe(純度>98.0%)，南京金斯瑞生物科技有限公司；胰蛋白酶(Promega質(zhì)譜測序級)、乙腈、甲醇、甲酸等質(zhì)譜用試劑均為質(zhì)譜級，德國Merck公司；二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，翼飛雪生物科技有限公司；碘乙酰胺(iodoacetamide，IAA)，合肥博美生物科技有限公司；Sep-pack C18固相萃取小柱，Waters公司；多肽測定試劑盒，美國Thermo公司。

BT125D電子分析天平，德國Sartorious有限公司；FA2004電子分析天平，上海上平儀器設(shè)備有限公司；真空濃縮蒸發(fā)儀，美國Labconco公司；戴安U3000 Nano RSLC納升液相系統(tǒng)，美國DIONEX公司；Thermo Q Exactive Plus Orbitrap質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 馬氏珍珠貝軟體蛋白質(zhì)的鑒定

樣品處理：將馬氏珍珠貝軟體反復(fù)沖洗后勻漿，取部分進(jìn)行凍干，備用。取10 mg凍干粉加入1 mL 4% SDS裂解液提取蛋白。蛋白質(zhì)用0.1 mol/L DTT還原，8 mol/L尿素溶液變性，0.2 mol/L IAA烷基化。2 μg胰蛋白酶于37 ℃酶解過夜，加入60 μL 10%三氟乙酸溶液終止反應(yīng)，Sep-pak C18固相萃取小柱脫鹽處理，離心濃縮儀干燥，得馬氏珍珠貝軟體酶解物，采用多肽試劑盒測定多肽含量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

色譜條件：色譜柱：Reprosil C18 AQ(75 μm×150 mm, 5 μm)，Thermo Scientific Q Exactive Plus Orbitrap LC-MS/MS系統(tǒng)分析馬氏珍珠貝樣品；進(jìn)樣量1 μL，流速400 nL/min；流動相AV(乙腈)∶V(甲酸)∶V(水)= 2∶0.2∶98，流動相BV(乙腈)∶V(甲酸)∶V(水)=80∶0.2∶20,2%～30% B線性梯度洗脫120 min。

質(zhì)譜條件：電子能量2.5 kV；離子傳輸毛細(xì)管溫度200 ℃；質(zhì)譜一級全掃描范圍300～2 000m/z；分離寬度3。串聯(lián)質(zhì)譜分析獲得總離子色譜圖，通過碰撞誘導(dǎo)解離，產(chǎn)生一系列MS/MS圖。二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用PEAKS 8.5軟件進(jìn)行搜庫鑒定分析，選擇軟體動物門數(shù)據(jù)庫(Mollusca，2021年1月下載于www.uniprot.org)。

檢索參數(shù)：前體離子誤差10 ppm；子離子誤差1 Da。允許2個位點(diǎn)誤切，假陽性率≤1%，樣品搜庫選擇胰蛋白酶酶切(Trypsin)方式；其他參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)，在上述檢索條件下所得分值有顯著性意義(P<0.05)，被認(rèn)定為鑒定結(jié)果有效。

1.3.2 主要蛋白質(zhì)的模擬酶切

蛋白質(zhì)的模擬酶切通過Peptide Cutter在線工具。將鑒定得到的3種主要蛋白質(zhì)(肌動蛋白、肌球蛋白、微管蛋白)的Uniprot ID輸入到Peptide Cutter的對話框，分別選擇胃蛋白酶(pH>2)、胃蛋白酶(pH=1.3)、胰蛋白酶、胰蛋白酶+胃蛋白酶(pH>2)、胰蛋白酶+胃蛋白酶(pH=1.3)進(jìn)行酶切。

1.3.3 潛在活性肽段的篩選

Chem Draw軟件畫出模擬酶切的849條肽段，保存為mol 2格式，作為分子對接的配體庫；PDB數(shù)據(jù)庫中下載3C59(高血糖素樣肽-1受體)、5IFW(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4受體)、6B1E(二肽基肽酶-4受體)的晶體三維結(jié)構(gòu)，作為受體庫。利用SYBYL-X 2.0軟件進(jìn)行分子對接：對配體化合物進(jìn)行去水加氫，加電荷，力學(xué)優(yōu)化；受體蛋白刪除對接不需要的分子，抽取其中的配體來創(chuàng)建結(jié)合口袋的原型分子，并暴露活性口袋，其余參數(shù)選擇默認(rèn)。

1.3.4 潛在活性肽段及2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)靶點(diǎn)的篩選

通過Swiss Target Prediction平臺，對篩選出的潛在活性肽段進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，種屬選擇“人源”，其他參數(shù)默認(rèn)，篩選結(jié)果包括蛋白質(zhì)名稱、Uniprot ID等信息?；贕eneCards和OMIM-GENE-MAP數(shù)據(jù)庫篩選T2DM靶點(diǎn)，以“Type 2 diabetes mellitus”為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選，將GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM-GENE-MAP數(shù)據(jù)庫收集的與T2DM相關(guān)的靶點(diǎn)取并集。匯總藥物和疾病基因靶點(diǎn)，通過Venny.2.1.0獲取潛在活性肽段與T2DM的共同靶點(diǎn)，繪制韋恩圖。

1.3.5 藥物靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.7.0導(dǎo)入network文件和type文件，利用“Network Analyzer”功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，計算網(wǎng)絡(luò)整體的“節(jié)點(diǎn)度值分布”，篩選出degree(Node Degree Distribution)大于二倍中位數(shù)的藥物靶點(diǎn)繪制PPI。

1.3.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將疾病和藥物的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String 11.0數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org)，設(shè)置蛋白種類為“homo sapiens”，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。將獲得的網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)出到Cytoscape 3.7.0，利用“Network Analyzer”功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，選擇degree大于二倍中位數(shù)的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)。degree反映了網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)目，degree是衡量一個節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要性的主要拓?fù)鋮?shù)，也是判斷一個靶蛋白是否為“關(guān)鍵靶點(diǎn)”的重要依據(jù)。

1.3.7 GO功能及KEGG通路富集分析

利用Omicshare數(shù)據(jù)庫(https://www.omicshare.com)將馬氏珍珠貝軟體關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，設(shè)置物種與背景均為“homo sapiens”(智人)、P<0.05進(jìn)行操作，研究關(guān)鍵靶點(diǎn)投射的GO功能及KEGG信號通路與疾病之間的相互關(guān)系，明確馬氏珍珠貝軟體可能的藥理機(jī)制和在體內(nèi)可能的生物過程。

1.3.8 DPP-IV抑制率驗(yàn)證

參照課題組前期研究測定DPP-IV抑制率[1]。在405 nm下測定吸光度，DPP-IV抑制率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：OD樣品、OD樣品空白、OD陰性、OD空白分別為樣品、樣品空白、陰性及空白在405 nm下的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)設(shè)3組平行，數(shù)據(jù)采用x±SD表示，用Excel、GraphPad 6.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理和圖標(biāo)的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬氏珍珠貝軟體中主要蛋白質(zhì)的鑒定及模擬酶解

通過nano LC-MS/MS鑒別研究，從馬氏珍珠貝軟體中鑒定得到36種蛋白質(zhì)，其中肌動蛋白、肌球蛋白、微管蛋白為其主要蛋白質(zhì)類成分。通過Peptide Cutter在線酶切，肽段去重后得到馬氏珍珠貝軟體酶解肽段849條。

2.2 潛在活性肽段的篩選

849條肽段分別與3C59、5IFW、6B1E進(jìn)行分子對接，與各受體分子對接評分最高的10條肽段如表1所示，去重后得到馬氏珍珠貝軟體治療T2DM的潛在活性肽段28條，如表2所示。

2.3 潛在活性肽段靶點(diǎn)的篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

Swiss Target Prediction平臺的分析結(jié)果表明，28條潛在活性肽段對應(yīng)的潛在靶點(diǎn)有377個。如圖1所示，呈圓形排列的28個節(jié)點(diǎn)為馬氏珍珠貝軟體中的潛在活性成分，呈矩形排列的122個節(jié)點(diǎn)代表馬氏珍珠貝軟體的潛在靶點(diǎn)，2 261條邊代表靶點(diǎn)和化學(xué)成分之間的相互作用，充分體現(xiàn)了馬氏珍珠貝軟體多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

表1 分子對接評分最高的10條肽段Table 1 Top 10 peptides with the highest scores for molecular docking

表2 28條潛在活性肽段Table 2 28 potential active peptides

圖1 潛在活性肽段PPIFig.1 PPI of potentially active peptides

2.4 T2DM靶點(diǎn)的篩選

從GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選出T2DM相關(guān)靶點(diǎn)4 977個，OMIM-GENE-MAP數(shù)據(jù)庫中篩選出T2DM相關(guān)靶點(diǎn)499個，合并后刪除重復(fù)值，最終得到1 705個T2DM相關(guān)靶點(diǎn)。

2.5 蛋白互助網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

馬氏珍珠貝軟體潛在活性肽段與T2DM的共同靶點(diǎn)共104個，如圖2所示。

圖2 藥物-疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Venn diagram of drug-disease common targets

將104個交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖3-a。選取交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)連接度的2倍中位數(shù)值為最低閾值進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，共得到關(guān)鍵靶點(diǎn)25個(見表3)，對25個關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，結(jié)果見圖3-b。馬氏珍珠貝軟體酶解肽治療T2DM的25個關(guān)鍵靶點(diǎn)中，RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase-1, AKT1)連接度最高。AKT1被稱為AKT激酶的3種緊密相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT1，AKT2和AKT3)之一，是胰島素信號通路和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)信號通路的重要節(jié)點(diǎn)蛋白，在胰島素抵抗中起關(guān)鍵作用[9]。研究表明，AKT1與代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長和血管生成等過程相關(guān)。AKT是胰島素信號傳導(dǎo)中重要的下游分子，以磷酸化形式被活化，活化的AKT可促進(jìn)機(jī)體糖原合成和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，增加機(jī)體對胰島素的敏感性，降低血糖水平，是使胰島素最終發(fā)揮效應(yīng)的關(guān)鍵分子[10-11]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的一員，主要調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的合成和分泌，參與血管的再生及炎癥反應(yīng)等生理病理過程，可破壞細(xì)胞組織、產(chǎn)生炎癥反應(yīng)而發(fā)揮促炎作用。T2DM微血管病變患者的血糖水平升高能夠使MMP-9過度表達(dá)[12]。MMP被認(rèn)為參與了多種糖尿病并發(fā)癥，糖尿病引起的視網(wǎng)膜及細(xì)胞中MMP9的激活被認(rèn)為在糖尿病視網(wǎng)膜病的發(fā)病機(jī)理中起重要作用[13]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是受體酪氨酸蛋白激酶erbB(erythroblastic oncogene B, ErbB)家族的成員，該家族由屬于受體酪氨酸激酶超家族的4個跨膜受體組成。研究表明，抑制EGFR酪氨酸腎活性可以改善胰島素抵抗[14]。原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src是一種非受體酪氨酸激酶，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，其過度活躍與胰腺β細(xì)胞的葡萄糖代謝受損有關(guān)[15]。絲裂原激活的蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8, MAPK8)參與細(xì)胞凋亡的復(fù)雜調(diào)節(jié)[16]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)在將細(xì)胞外信號從質(zhì)膜傳遞到細(xì)胞核和線粒體中起著核心作用，影響轉(zhuǎn)錄和線粒體功能，從而調(diào)節(jié)多種生物過程[17]。

a-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(104個);b-核心網(wǎng)絡(luò)(25個)圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及核心網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network and core network

表3 25個關(guān)系靶點(diǎn)信息Table 3 Information of 25 key targets

2.6 KEGG及GO通路富集分析

KEGG分析共獲得124條通路(P<0.05)，按照P值從小到大篩選出前20條通路，如圖4所示。

圖4 KEGG通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis

主要通路有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、癌癥通路(pathways in cancer)、內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance)、TNF信號通路(tumor necrosis factor signaling pathway)、松弛素信號通路(relaxin signaling pathway)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、FoxO信號通路(forkhead box protein O signaling pathway)、ErbB信號通路(receptor tyrosine-protein kinase erbB ErbB signaling pathway)等。AGE-RAGE信號通路是糖尿病腎病的形成和進(jìn)展中非常重要的一環(huán)，在調(diào)節(jié)T2DM TNF-α的產(chǎn)生和表達(dá)、氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能中起重要作用。在衰老的過程中，以及腎衰竭、炎癥，特別是糖尿病情況下，晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)的形成和沉積都會加速。BURR等[18]的研究表明與糖尿病相關(guān)的高血糖癥將增加AGE水平和活躍的RAGE信號傳導(dǎo)，加速細(xì)胞遷移，導(dǎo)致左心室硬化而患心血管疾病。針對RAGE信號通路調(diào)節(jié)劑的治療，可能具有減輕糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的作用。TNF-α信號傳導(dǎo)途徑通過活化的內(nèi)皮介導(dǎo)炎性細(xì)胞黏附的遷移參與T2DM腎病患者慢性腎臟疾病的發(fā)展[19]。松弛素介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1-α的刺激，以及金屬蛋白酶的調(diào)控表達(dá)，可改善糖尿病小鼠的心血管纖維化[20]。視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Müller中IL-17A的產(chǎn)生和Act1信號的激活可通過炎癥反應(yīng)加速糖尿病性視網(wǎng)膜病[21]。FoxO信號通路是胰島素調(diào)節(jié)肝臟糖原異生及肝糖輸出的信號通路之一。當(dāng)胰島素與肝細(xì)胞表面的胰島素受體特異性結(jié)合，激活胰島素受體底物(insulin receptors,IRs)，使下游PI3K/AKT信號通路活化，下游轉(zhuǎn)錄因子FoxO1磷酸化而致其由細(xì)胞核排斥至細(xì)胞質(zhì)，從而阻斷下游糖異生基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，致肝臟糖異生及肝糖輸出減少[22]。

GO分析包括生物過程(biological process, BP)、細(xì)胞組分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)3個部分。通過Omicshare在線云平臺對馬氏珍珠貝軟體肽段治療T2DM的25個潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，設(shè)定P<0.05，共獲得2 183條生物過程或通路，其中1 943個與BP相關(guān)，98個與CC相關(guān)，142個與MF相關(guān)。根據(jù)P值從小到大排序，選取前20條GO條目，繪制柱狀圖，如圖5所示。BP主要涉及對有機(jī)氮化合物的響應(yīng)(response to organonitrogen compound)、含氮化合物反應(yīng)(response to nitrogen compound)、含氧化合物反應(yīng)(response to oxygen-containing compound)、對無機(jī)物的反應(yīng)(response to inorganic substance)、蛋白質(zhì)代謝過程的正調(diào)控(positive regulation of protein metabolic process)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖(regulation of cell proliferation)等生物過程。CC主要涉及膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix)等細(xì)胞組分。MF主要涉及作用于蛋白質(zhì)的催化活性(catalytic activity, acting on a protein)、內(nèi)肽酶活性(endopeptidase activity)、酶結(jié)合(enzyme binding)、作用于L-氨基酸肽的肽酶活性(peptidase activity, acting onL-amino acid peptides)等功能。關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1對GSK3同種型的磷酸化是驅(qū)動細(xì)胞增殖的一種機(jī)制[23]，AKT還通過MAP3K5(凋亡信號相關(guān)激酶)的磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞存活[24]。

2.7 體外DPP-IV抑制率驗(yàn)證

根據(jù)前述工作，對篩選的28條肽段進(jìn)行DPP-IV抑制活性驗(yàn)證。如圖6所示，在肽段濃度為2.5 mg/mL時，26號肽段的DPP-IV抑制率最高，為(83.45±2.54)%。其他肽段的DPP-IV抑制率小于0或低于50%可能是由于在肽段質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，肽段濃度過低，活性較弱未能與DPP-IV結(jié)合；也可能是由于肽段與DPP-IV的口袋結(jié)合作用較強(qiáng)，但該結(jié)合未產(chǎn)生活性。如圖7所示，26號肽段的IC50為395 μmol/L。

a-BP富集分析;b-CC富集分析;c-MF富集分析圖5 GO富集分析Fig.5 GO enrichment analysis

圖6 潛在活性肽段體外DPP-IV抑制活性驗(yàn)證Fig.6 In vitro DPP-IV inhibitory activity verification of potentially active peptides

圖7 26號肽在不同濃度下的DPP-IV抑制率Fig.7 DPP-IV inhibition rate of peptide 26 at different concentrations

3 結(jié)論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，篩選了馬氏珍珠貝軟體來源的潛在降糖活性肽。研究從849條模擬酶切肽段中發(fā)現(xiàn)了28條潛在降糖活性肽段，這些肽段通過參與細(xì)胞增殖與凋亡、蛋白質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)等過程發(fā)揮降糖作用?；钚则?yàn)證研究進(jìn)一步驗(yàn)證19條肽段具有體外DPP-IV抑制活性，其中26號肽段活性最佳，體外DPP-IV抑制率的IC50為395 μmol/L。綜上，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)結(jié)合的方法可快速篩選馬氏珍珠貝軟體來源的降糖活性肽，探討其發(fā)揮降糖作用的可能途徑，本文的研究思路對馬氏珍珠貝活性肽類成分的發(fā)現(xiàn)提供數(shù)據(jù)與方法支撐，對馬氏珍珠貝乃至海洋貝類等食品的開發(fā)與應(yīng)用具有一定指導(dǎo)意義。