高蘇敏，吳丹璇，高子武，劉宗振，吳鵬,2,3，姜松松,2,3，王恒鵬,2,3*，孟祥忍,2,3*

1(揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225127)2(中餐非遺技藝傳承文化和旅游部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州，225127) 3(江蘇省淮揚(yáng)菜工程中心，江蘇 揚(yáng)州，225127)

作為一種古老且應(yīng)用廣泛的加工技術(shù)，發(fā)酵工藝在新鮮蔬菜的加工、保鮮和貯存過(guò)程中具有重要意義。發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的獨(dú)特風(fēng)味物質(zhì)，有助于蔬菜口味、香氣和質(zhì)地的發(fā)展[1]。在中國(guó)，發(fā)酵泡菜歷史悠久，可以追溯到3 000年前[2]。如今，泡菜因其豐富的維生素、益生菌、礦物質(zhì)和有機(jī)酸含量而受到越來(lái)越多的關(guān)注[3]。在傳統(tǒng)的發(fā)酵過(guò)程中，蔬菜經(jīng)過(guò)預(yù)處理，浸泡在泡菜鹵水中，然后在室溫下自然發(fā)酵。泡菜鹵水通過(guò)連續(xù)繁殖的方式含有穩(wěn)定的乳酸菌，以及豐富的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)代謝物，可以長(zhǎng)時(shí)間使用。然而，傳統(tǒng)發(fā)酵制作的泡菜通常在高鹽條件下進(jìn)行，前期使用含鹽量高達(dá)15%～20%的鹽水進(jìn)行腌漬，后期脫鹽工藝產(chǎn)生大量鹽漬廢水，易造成環(huán)境污染[4]，而長(zhǎng)期高鹽飲食則會(huì)引起高血壓、動(dòng)脈硬化等疾病，嚴(yán)重危害人體健康。HARRIS等[5]用能生產(chǎn)Nisin的乳酸球菌和有Nisin抗性的腸膜狀明串珠菌產(chǎn)酸發(fā)酵來(lái)降低腌菜的含鹽量，利用有益菌對(duì)微生物的抑制作用可減少泡菜含鹽量。曾希珂等[6]總結(jié)辣椒發(fā)酵中的有益菌，使用防腐劑、低溫管理等也可改進(jìn)低鹽腌制工藝。因此，為符合當(dāng)前的低鹽飲食標(biāo)準(zhǔn)，有必要改變傳統(tǒng)腌漬工藝，開(kāi)發(fā)新型低鹽腌漬工藝，減少高鹽腌漬對(duì)人體健康的危害。

泡菜發(fā)酵體系是一個(gè)動(dòng)態(tài)的微生態(tài)環(huán)境，各種微生物在發(fā)酵過(guò)程中不斷變化。CAO等[7]認(rèn)為發(fā)酵由乳酸菌輔助，而變質(zhì)更可能與真菌相關(guān)。當(dāng)產(chǎn)生乳酸菌時(shí)，發(fā)酵過(guò)程開(kāi)始，蔬菜原料中植物糖轉(zhuǎn)化為乳酸或醋酸。此過(guò)程會(huì)導(dǎo)致酸度達(dá)到一個(gè)較高水平，并維持?jǐn)?shù)天時(shí)間。在這一時(shí)期，微生物群落不斷生產(chǎn)、降解，并轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸、游離氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味化合物等滋味和氣味成分。當(dāng)泡菜出現(xiàn)酸度下降，風(fēng)味劣變等現(xiàn)象時(shí)，表明泡菜已變質(zhì)。此外，發(fā)酵過(guò)程中泡菜體系中亞硝酸鹽的形成和積累，會(huì)在一定程度上導(dǎo)致食品安全問(wèn)題。

研究表明，泡菜的微生物群落和風(fēng)味品質(zhì)取決于多種因素，尤其是原材料[8]。蘿卜是最為常見(jiàn)的用于泡菜制作的蔬菜原料，屬十字花科，可食性強(qiáng)，也是我國(guó)四川盆地種植的主要作物之一，用于發(fā)酵已有1 500多年的歷史。蘿卜泡菜是一類(lèi)廣受?chē)?guó)內(nèi)外消費(fèi)者歡迎的發(fā)酵產(chǎn)品，其色澤光亮，質(zhì)地脆嫩，且具備較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

超聲波浸漬技術(shù)是一種新型食品加工技術(shù)，能快速提高產(chǎn)品的浸漬速率。超聲輔助微生物發(fā)酵，可以有效提高發(fā)酵效率，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)與代謝[9]；適當(dāng)?shù)某暡ㄌ幚砜娠@著加速和改善液態(tài)發(fā)酵食品風(fēng)味物質(zhì)的形成[10]。目前該技術(shù)較多應(yīng)用于肉類(lèi)腌制過(guò)程中，在發(fā)酵類(lèi)蔬菜產(chǎn)品中的應(yīng)用較少。因此，為改善傳統(tǒng)泡菜含鹽量過(guò)高、發(fā)酵周期長(zhǎng)的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)選擇白蘿卜作為制作泡菜的主要原料，將超聲波浸漬技術(shù)與低鹽腌制相結(jié)合，分析不同鹽含量的泡菜水在超聲波輔助浸漬和傳統(tǒng)浸漬條件下理化性質(zhì)、揮發(fā)性風(fēng)味化合物和微生物多樣性，探究新型低鹽加工技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)四川泡菜品質(zhì)的影響，明確制作高品質(zhì)、低風(fēng)險(xiǎn)泡菜的新型工藝條件，對(duì)提升泡菜產(chǎn)品的加工品質(zhì)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白蘿卜、新鮮小米椒、大蒜頭、青蒜、生姜、白酒、小米泡椒等，揚(yáng)州大潤(rùn)發(fā)超市，品質(zhì)為優(yōu)級(jí)。

NaOH、鄰苯二甲酸氫鉀、鉻酸鉀、硝酸銀、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、NaCl、NaNO2、三氯乙酸、色氨酸等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Ag 1100型安捷倫液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；H2050R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；721N型可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；Trace ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，天津三方環(huán)科檢測(cè)科技有限公司；Waters 2695型高效液相色譜儀，譜質(zhì)分析檢測(cè)技術(shù)(上海)有限公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一儀器廠(chǎng)；Supelco 75 μm固相微萃取頭，上海楚定分析儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

配方(以40 g/L鹽為例)：白蘿卜450 g，泡菜鹽32 g，冰糖16 g，水800 mL，青花椒2 g，紅花椒2 g，生姜32 g，大蒜32 g，新鮮小米椒3個(gè)，小米泡椒3個(gè)，青蒜1根，白酒15 mL。其中冰糖和泡菜鹽的質(zhì)量比控制在1∶2(g∶g)，其余保持不變。

工藝流程：

分組：CK4、CK6為傳統(tǒng)浸漬組，鹽質(zhì)量濃度分別為40和60 g/L；U2、U3、U4為超聲波輔助浸漬組，鹽質(zhì)量濃度分別為20、30和40 g/L。

取樣：發(fā)酵過(guò)程中，每隔2 d取泡菜水樣品1次，冷凍離心(4 ℃, 12 000 r/min, 10 min)后，取上清液分別存放于-80 ℃條件，分析時(shí)取樣測(cè)定。

1.3.2 酸度的測(cè)定

參照GB 12456—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總酸的測(cè)定》，采用酸堿滴定法進(jìn)行泡菜水酸度的測(cè)定。

1.3.3 亞硝酸鹽含量的測(cè)定

參照GB 5009.33—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中的亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》，采用鹽酸萘乙二胺法進(jìn)行泡菜水中亞硝酸鹽含量的測(cè)定。

1.3.4 有機(jī)酸的測(cè)定

參照GB 5009.157—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中有機(jī)酸的測(cè)定》，采用Waters 2695 高效液相色譜儀，配備Diamonsil C184.6 mm×250 mm色譜柱，流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)：UV210 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3.5 游離氨基酸的測(cè)定

參照GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》，采用Ag1100型安捷倫液相色譜儀，配備(250 mm×4.6 mm,5 μm)ODS HYPERSIL色譜柱，OPA FMOC柱前衍生化分析，流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃，紫外檢測(cè)器：338和262 nm(Pro,Hypro)，使用外標(biāo)法定量。

1.3.6 揮發(fā)性風(fēng)味化合物的測(cè)定

參考RAO等[11]的方法，略作修改。將5.0 mL泡菜水樣品置于20 mL頂空瓶中，以10 μL 2-甲基-3-庚酮(200 μg/mL)為內(nèi)標(biāo)，在45 ℃下平衡15 min后，將萃取頭在45 ℃下頂空暴露30 min。解吸在250 ℃的非劈裂模式下，5 min內(nèi)完成。色譜柱為DB-Wax，載氣為He，流速為1.0 mL/min，不分流，掃描范圍：m/z30～500，掃描方式：全掃描，離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：180 ℃；開(kāi)溫程序：起始溫度50 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至210 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃保持10 min。利用NIST 2014標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)保留時(shí)間和質(zhì)譜相似性(>85%)對(duì)揮發(fā)性有機(jī)化合物進(jìn)行鑒定。定量方法:根據(jù)2-甲基-3-庚酮內(nèi)標(biāo)峰面積，計(jì)算待測(cè)樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量，計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.3.7 高通量測(cè)序

采用DNA試劑盒提取泡菜水中細(xì)菌和真菌基因組DNA，以338 F-806R為引物擴(kuò)增細(xì)菌16S DNA V3-V4區(qū)序列，擴(kuò)增片段大小500 bp，采用547 F-V4 R為引物擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)真核18S V4區(qū)序列，擴(kuò)增片段大小420 bp，測(cè)序策略為NovaSeq-PE250。對(duì)高通量測(cè)序的原始下機(jī)數(shù)據(jù)根據(jù)序列質(zhì)量進(jìn)行初步篩查；對(duì)問(wèn)題樣本進(jìn)行重測(cè)、補(bǔ)測(cè)。通過(guò)質(zhì)量初篩的原始序列按照index和Barcode信息，進(jìn)行文庫(kù)和樣本劃分，并去除Barcode序列。按照QIIME2 dada2分析流程或Vsearch軟件的分析流程進(jìn)行序列去噪或OTU聚類(lèi)。對(duì)各樣本(組)在不同物種分類(lèi)學(xué)水平的具體組成進(jìn)行展示，了解整體概況。根據(jù)ASV/OTU在不同樣本中的分布，評(píng)估每個(gè)樣本的α-多樣性水平，并通過(guò)稀疏曲線(xiàn)反映測(cè)序深度是否合適。在物種分類(lèi)學(xué)組成層面，通過(guò)各種非監(jiān)督、監(jiān)督的排序、聚類(lèi)和建模手段，結(jié)合相應(yīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法，進(jìn)一步衡量不同樣本(組)間的物種豐度組成差異，并嘗試尋找標(biāo)志物種。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2019、Excel及SPSS19.0軟件構(gòu)建群落分布柱狀圖、數(shù)據(jù)分析表，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和顯著性分析等。利用QIIME軟件計(jì)算樣品的各種多樣性指數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲協(xié)同低鹽處理對(duì)泡菜水酸度、亞硝酸鹽的影響

酸度是衡量泡菜是否發(fā)酵完全的重要指標(biāo)之一。由圖1-a可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，不同處理組的泡菜水酸度在發(fā)酵0～6 d快速上升，6～12 d趨于穩(wěn)定，這可能與發(fā)酵后期，泡菜體系酸度升高，微生物的代謝受到抑制，產(chǎn)酸能力下降，酸度逐漸處于平衡狀態(tài)有關(guān)[12]。

通常將酸度達(dá)0.5%(酸度5 g/kg)作為泡菜發(fā)酵成熟的判斷依據(jù)。結(jié)果表明，發(fā)酵至第6天，所有處理組泡菜均發(fā)酵成熟。其中CK4、U2、U3處理組泡菜水酸度在6～8 g/kg，口感最佳。對(duì)比傳統(tǒng)和超聲波輔助處理組，發(fā)現(xiàn)酸度與鹽含量呈負(fù)相關(guān)，初始鹽含量越高，泡菜水的酸度越低，超聲波輔助浸漬后的泡菜水酸度均顯著高于傳統(tǒng)處理組(P<0.05)。

由圖1-b可知，在發(fā)酵過(guò)程中，不同處理組泡菜水的亞硝酸鹽含量呈先上升后下降趨勢(shì)，與RAO等[13]的研究結(jié)果較為一致。在發(fā)酵至第2天，各處理組泡菜水的亞硝酸鹽含量均達(dá)到峰值，其中U2處理組的泡菜水中的亞硝酸鹽含量高達(dá)54.122 mg/kg，U3處理組則達(dá)到35.524 mg/kg，遠(yuǎn)超食品安全國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)，其余處理組未超標(biāo)。U2、U3處理組泡菜水雖在發(fā)酵第2天達(dá)到“亞硝峰”，但發(fā)酵成熟后并不存在亞硝酸鹽風(fēng)險(xiǎn)，建議發(fā)酵4 d后食用，確保食用安全。

a-酸度；b-亞硝酸鹽圖1 不同處理組泡菜水的酸度和亞硝酸鹽含量Fig.1 Acidity and nitrite content of pickle water in different treatment groups

分析發(fā)現(xiàn),初始鹽含量越低，泡菜水中的亞硝酸鹽含量則相對(duì)越高，比較同一鹽含量處理組，經(jīng)超聲波輔助浸漬后的樣品中亞硝酸鹽含量比傳統(tǒng)處理組顯著降低(P<0.05)，表明超聲波輔助浸漬對(duì)抑制泡菜在發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽的生成具有一定作用。

2.2 超聲波協(xié)同低鹽處理對(duì)泡菜水有機(jī)酸的影響

在發(fā)酵過(guò)程中，有機(jī)酸對(duì)泡菜體系的酸味和整體風(fēng)味的形成有著重要影響。由圖2可知，共檢測(cè)出乳酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、草酸、琥珀酸6種有機(jī)酸，這與陳卓等[14]的結(jié)果一致。乳酸菌是泡菜發(fā)酵的主要菌種，其代謝產(chǎn)物主要為乳酸和乙酸，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，有機(jī)酸總量增加，乳酸含量最高，其次為乙酸、檸檬酸和琥珀酸。U4處理組泡菜水有機(jī)酸含量高于CK4處理組，可見(jiàn)相同鹽含量下，經(jīng)超聲波輔助浸漬的泡菜水有機(jī)酸含量高于傳統(tǒng)發(fā)酵組。超聲波輔助浸漬后，鹽含量越高，有機(jī)酸總量越低，乳酸、乙酸和檸檬酸含量也越低。結(jié)果表明，高鹽環(huán)境會(huì)抑制有機(jī)酸的產(chǎn)生，而超聲波輔助浸漬有利于提高泡菜水的乳酸和有機(jī)酸總量，促進(jìn)泡菜發(fā)酵成熟，與酸度的結(jié)果一致。

圖2 不同處理組泡菜水6種有機(jī)酸含量Fig.2 Contents of 6 organic acids in pickle water of different treatment groups

2.3 超聲波協(xié)同低鹽處理對(duì)泡菜水游離氨基酸的影響

游離氨基酸的種類(lèi)和含量對(duì)產(chǎn)品的滋味與風(fēng)味形成具有重要影響。XIAO等[15]發(fā)現(xiàn)江西鹽菜、四川泡菜和東北酸菜中都富含氨基酸，包括天冬氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸等。泡菜中的氨基酸在乳酸菌作用下可以生成苯乳酸、苯乙酸等風(fēng)味物質(zhì)[16]。圖3-a顯示了不同處理組泡菜水發(fā)酵第6天和第12天的游離氨基酸水平的變化，結(jié)果共檢測(cè)出20種游離氨基酸。在各處理組中，谷氨酰胺含量最多。發(fā)酵第6天時(shí)，CK4和U3處理組前5位氨基酸分別為谷氨酰胺、組氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和天冬氨酸，其余處理組在發(fā)酵第6天和第12天前5位氨基酸分別為谷氨酰胺、組氨酸、天冬酰胺、精氨酸和谷氨酸。

不同種類(lèi)的氨基酸具有不同的呈味特點(diǎn)，根據(jù)SCHOENBERGER等[17]對(duì)呈味氨基酸的分類(lèi)，可將氨基酸種類(lèi)分為甜味氨基酸、鮮味氨基酸和苦味氨基酸，這些呈味氨基酸共同構(gòu)成了泡菜獨(dú)特的風(fēng)味，并作為前體物質(zhì)參與泡菜發(fā)酵過(guò)程的各種代謝反應(yīng)，影響泡菜色、香、味的形成[18]。如圖3-b所示，不同處理組樣品在發(fā)酵第6天和第12天時(shí)均檢出17種呈味游離氨基酸，其中谷氨酸和天冬氨酸含量較高，是泡菜鮮味的主要來(lái)源[19]。發(fā)酵第6天時(shí)，泡菜成熟，此時(shí)甜味氨基酸主要以絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸為主，有研究顯示谷氨酸和氯化鈉的結(jié)合會(huì)使鮮味增強(qiáng)，因此可推測(cè)咸味和鮮味物質(zhì)共同主導(dǎo)了泡菜的滋味。由圖3-b可知，泡菜水中的苦味氨基酸含量較高，受閾值的影響，其對(duì)泡菜滋味的形成貢獻(xiàn)較小，苦味的呈味效果也會(huì)受NaCl和酸的抑制。已有研究表明，經(jīng)多輪發(fā)酵的泡菜水中的苦味氨基酸含量相對(duì)較低[20]，而本結(jié)果中苦味氨基酸含量較高的原因也可能與采用新鹽水發(fā)酵有關(guān)。

a-游離氨基酸熱圖；b-鮮味、甜味和苦味氨基酸含量圖3 不同處理組泡菜水的游離氨基酸和呈味氨基酸含量Fig.3 Free amino acid and flavor amino acid content of pickle water in different treatment groups

對(duì)比不同處理組泡菜水發(fā)酵第6天和第12天的氨基酸含量，鮮味氨基酸，甜味氨基酸和苦味氨基酸大都呈上升趨勢(shì)?？偟膩?lái)說(shuō)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各呈味氨基酸含量增多，且經(jīng)過(guò)超聲波輔助浸漬的處理組氨基酸含量較傳統(tǒng)浸漬增加更明顯，說(shuō)明超聲波輔助浸漬有助于呈味氨基酸的形成。

2.4 超聲波協(xié)同低鹽處理對(duì)泡菜水揮發(fā)性風(fēng)味的影響

由電子版增強(qiáng)出版附表1可知，對(duì)不同處理組泡菜水發(fā)酵第6天和第12天的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行SPME-GC-MS分析，共鑒定出89種揮發(fā)性風(fēng)味化合物。各處理組泡菜水共有成分為芳樟醇、(-)-4-萜品醇、香葉醇、橙花醇、香芹醇、月桂烯、γ-松油烯、二烯丙基二硫、烯丙基甲基二硫、二烯丙基硫醚、乙酸芳樟酯、乙酸香葉酯、乙酸松油脂等。

傳統(tǒng)發(fā)酵蘿卜泡菜水與超聲波輔助浸漬的蘿卜泡菜水在揮發(fā)性成分上存在差異。自然發(fā)酵的泡菜主體風(fēng)味成分以二甲基硫化物、月桂烯、酯類(lèi)等為主，蔬菜原料或香辛料自帶的氣味成分會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸消失[21]，在發(fā)酵過(guò)程中，醇類(lèi)、烯烴類(lèi)、含硫化合物類(lèi)含量較高，占總量的85%以上，醇類(lèi)的含量較多，但閾值較大，對(duì)主體風(fēng)味的影響較小，其中含量較高的醇類(lèi)物質(zhì)為芳樟醇、(-)-4-萜品醇、α-松油醇等，芳樟醇是泡菜中重要的香氣活性物質(zhì)，具有綠茶清香與玫瑰花香，α-松油醇具有樟腦氣味、辛辣味[22]。

酯類(lèi)一般以含硫酯類(lèi)為主，如三芥子酸甘油酯、3-(甲硫基)丙基異硫氰酸酯等，異硫氰酸酯具有芥末的辛辣氣味，是蘿卜泡菜的特征風(fēng)味物質(zhì)。另外，乙酸和酯類(lèi)反應(yīng)會(huì)生成乙酸酯類(lèi)，如乙酸香葉酯具有玫瑰和熏衣草香氣，乙酸芳樟酯具有類(lèi)似鈴蘭、薰衣草等精油的幽雅香氣等。

二甲基硫化物含量較小，閾值也較小，對(duì)主體風(fēng)味的影響較大，已有研究表明，二甲基三硫香氣閾值低，香味濃郁，具有肉樣和洋蔥蔬菜味香氣[23]，由附件表1所示，二甲基三硫僅存在于經(jīng)超聲輔助浸漬的蘿卜泡菜水中，且在U3處理組泡菜水的含量最高，是泡菜的重要風(fēng)味物質(zhì)，表明超聲波輔助浸漬有利于突出泡菜的整體風(fēng)味。其他香氣物質(zhì)如酸類(lèi)、醚類(lèi)等，由于含量過(guò)低，閾值過(guò)高，對(duì)蘿卜泡菜整體風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)很小。

2.5 超聲波協(xié)同低鹽處理對(duì)泡菜水微生物多樣性的影響

2.5.1 物種組成分析

分別對(duì)不同處理組泡菜水細(xì)菌在門(mén)水平、屬水平上的群落組成進(jìn)行分析。由圖4-a和圖4-c可知，細(xì)菌在門(mén)水平上，樣品中檢測(cè)出前5位為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、藍(lán)藻菌門(mén)(Cyanobacteria)和放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)。真菌在門(mén)水平上，樣品中檢測(cè)出前五位為輪藻門(mén)(Streptophyta)、子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、卵菌門(mén)(Oomycetes)和綠藻門(mén)(Chlorophyta)。其中厚壁菌門(mén)、輪藻門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，變形菌門(mén)、子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)為第二優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。由圖4-b和4-d可知，在屬水平上，細(xì)菌相對(duì)豐度前3位的屬為乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、假單胞菌屬(Pseudomonas)，真菌可檢測(cè)出真菌屬相對(duì)豐度低，前5位為耶氏酵母屬(Yarrowia)、土生假絲酵母屬(Cutaneotrichosporon)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅酵母屬(Rhodotorula)和路德酵母屬(Lodderomyces)，但在U4處理組樣品中未檢出，這可能是超聲和高鹽濃度共同作用的結(jié)果。

a-細(xì)菌在門(mén)水平上的相對(duì)豐度；b-細(xì)菌在屬水平上的相對(duì)豐度；c-真菌在門(mén)水平上的相對(duì)豐度；d-真菌在屬水平上的相對(duì)豐度圖4 不同處理組泡菜水細(xì)菌、真菌在門(mén)水平和屬水平上的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria and fungi in pickle water of different treatment groups at phylum level and genus level

腐敗菌是能引起食品腐敗變質(zhì)的各種微生物的總稱(chēng)，往往引起色、香、味等感官性狀的異常，其代謝過(guò)程還會(huì)破壞食物的營(yíng)養(yǎng)組分，產(chǎn)生毒性。如圖4-b所示，CK處理組中存在較多的腐敗菌屬，如假單胞菌屬、拉烏爾菌屬、腸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬等[24]，在發(fā)酵第6天時(shí)，CK4處理組中腐敗菌的相對(duì)豐度最高，超聲處理組中腐敗菌相對(duì)豐度明顯降低，表明采用超聲輔助浸漬處理有利于減少腐敗菌的生成，提高泡菜品質(zhì)，降低食用風(fēng)險(xiǎn)，提升貯藏穩(wěn)定性。

2.5.2 多樣性分析

分析不同處理組泡菜水細(xì)菌和真菌微生物多樣性，其α-多樣性指數(shù)分析如表1所示。Chao1指數(shù)可以衡量物種的豐富度，Goods-coverage指數(shù)可以衡量文庫(kù)中序列的覆蓋度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以衡量物種的多樣性。所有樣品的Goods-coverage指數(shù)均為0.99或1.00，說(shuō)明樣品文庫(kù)中的序列覆蓋率高。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均減小，物種豐富度降低，多樣性降低，優(yōu)勢(shì)菌群含量上升。對(duì)比細(xì)菌和真菌的α-多樣性指數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的多樣性明顯比真菌多樣性豐富，這與朱琳等[25]的研究結(jié)果一致。

表1 不同處理組泡菜水細(xì)菌α-多樣性指數(shù)分析Table 1 Analysis of α-diversity index of bacteria in pickle water of different treatment groups

總體看來(lái)，在細(xì)菌和真菌α-多樣性指數(shù)分析中，發(fā)酵第6天時(shí)，傳統(tǒng)處理組泡菜水的物種豐富度和多樣性比超聲輔助處理組泡菜水高，且鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，泡菜水的物種豐富度和多樣性降低。因此，可以推測(cè)，超聲處理會(huì)在一定程度上，減弱細(xì)菌和真菌多樣性，低鹽會(huì)增強(qiáng)細(xì)菌和真菌的多樣性。

2.5.3 物種差異分析

為進(jìn)一步比較樣品間的物種組成差異，對(duì)平均豐度為前20位的屬進(jìn)行聚類(lèi)分析，如圖5所示。

圖5 不同處理組泡菜水細(xì)菌(a)、真菌(b)在屬水平上的物種聚類(lèi)熱圖Fig.5 Heat maps of species composition of bacteria(a)and fungi(b) in pickle water of different treatment groups at genus level

根據(jù)圖5-a可進(jìn)行如下分組：CK4_6構(gòu)成集群I，U4_6構(gòu)成集群α，U2_6、U2_12構(gòu)成集群β，CK4_12、U3_6、U3_12構(gòu)成集群χ，U4_12、CK6_6、CK6_12構(gòu)成集群δ；根據(jù)圖5-b可進(jìn)行如下分組：CK4_6構(gòu)成集群I，U4_12構(gòu)成集群α，CK4_12構(gòu)成集群β，U2_12、CK6_6、U2_6構(gòu)成集群χ，CK6_12、U3_12、U3_6、U4_6構(gòu)成集群δ，同集群之間物種差異較小，相隔越遠(yuǎn)物種差異越大。其中，U3_6、U3_12和U2_6、U2_12在細(xì)菌屬和真菌屬聚類(lèi)中分別屬于同一集群，表明U2和U3處理組發(fā)酵第6 d成熟(酸度達(dá)0.5%)后，微生物新陳代謝產(chǎn)物差異不大，物種組成變化小，表明采用超聲輔助浸漬處理可有效使泡菜體系在發(fā)酵期間的品質(zhì)保持穩(wěn)定。

3 結(jié)論

對(duì)蘿卜泡菜進(jìn)行不同處理發(fā)酵，各組亞硝酸鹽含量未見(jiàn)超標(biāo)。相同鹽含量下，超聲波處理組發(fā)酵成熟后酸度更高、更快，達(dá)到0.05%，說(shuō)明超聲波浸漬有利于加速泡菜酸化，縮短泡菜的成熟時(shí)間。超聲波輔助浸漬還能提高有機(jī)酸和游離氨基酸含量。

揮發(fā)性風(fēng)味分析顯示，芳樟醇、乙酸香葉酯、二甲基硫化物等對(duì)主體風(fēng)味影響較大，僅存于超聲波浸漬組中的二甲基三硫在U3組泡菜水中含量最高，說(shuō)明超聲波可促進(jìn)生成新的揮發(fā)性物質(zhì)，有效增強(qiáng)泡菜的風(fēng)味。

超聲波輔助浸漬可有效降低腐敗菌的種類(lèi)和含量，達(dá)到滅菌保藏效果。α-多樣性分析數(shù)據(jù)顯示細(xì)菌多樣性較真菌更為豐富，且物種數(shù)量更多，其中U3組多樣性更為豐富。聚類(lèi)分析結(jié)果表明U3、U4組在細(xì)菌與真菌多樣性中關(guān)系更近。

綜上，鹽的質(zhì)量濃度為30 g/L并輔助超聲波浸漬的蘿卜泡菜水體系更有助于提高泡菜發(fā)酵品質(zhì)，表明低鹽條件下超聲波輔助浸漬對(duì)蘿卜泡菜的發(fā)酵有較大影響，有利于突出泡菜主體特征風(fēng)味，減少有害微生物的產(chǎn)生。該研究可為未來(lái)健康安全型“低鹽四川泡菜”產(chǎn)品的加工與生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。