劉雯雯，馮瑞章，魏琴，周萬海*，王虹，杜永華

1(宜賓學(xué)院 四川省油樟工程技術(shù)研究中心，四川 宜賓，644007)2(宜賓學(xué)院 農(nóng)林與食品工程學(xué)部，四川 宜賓，644007)

內(nèi)生真菌是一類定殖于植物組織細(xì)胞間隙且對(duì)宿主無不利影響的一類微生物，特別是一些富含次生代謝物質(zhì)的植物組織[1]。研究表明，一些內(nèi)生真菌能產(chǎn)生種類多樣、活性強(qiáng)且結(jié)構(gòu)新穎的活性功能物質(zhì)[2]，作用于植物生長(zhǎng)、品質(zhì)形成和環(huán)境適應(yīng)等方面[3]，甚至直接或間接的參與植物的次生代謝，影響次生代謝產(chǎn)物的合成和積累[4]。植物內(nèi)生真菌是挖掘新型活性成分以及化合物的重要潛在資源，篩選功能性內(nèi)生真菌、研究作用品質(zhì)影響、與宿主的互作關(guān)系等是當(dāng)前植物學(xué)、藥學(xué)的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[5-6]。

明日葉(Angelicakeiskei)為傘形科當(dāng)歸屬藥食兼用型的稀有植物，因具有強(qiáng)盛生命力，“今天摘葉明天長(zhǎng)新芽”而得名[7]，其莖葉富含黃酮、泛酸、維生素B12、膽堿等物質(zhì)，特別是以查爾酮為代表的黃酮類活性物質(zhì)含量較高，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、改善炎癥等作用[8-9]，在保健品、飲料、日化品中應(yīng)用較多。根據(jù)共生理論[10]，明日葉不同器官內(nèi)生真菌的種類和功能可能較為豐富，目前還未見關(guān)于明日葉內(nèi)生真菌相關(guān)報(bào)道，基于此，本研究以明日葉為材料，研究不同器官中可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的多樣性和分布情況，篩選具有產(chǎn)黃酮和抑菌功能的菌株，為明日葉各器官內(nèi)生真菌多樣性及提供可應(yīng)用的功能菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

明日葉采自宜賓學(xué)院農(nóng)場(chǎng)基地，采用隨機(jī)取樣法收集健康新鮮的莖、葉、花、果實(shí)于無菌取樣袋中，24 h內(nèi)分離各組織的內(nèi)生真菌。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；鎂粉、HCl、NaOH、FeCl3、乙醇、Al(NO3)3、NaClO，均為分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒，生工生物工程(上海)有限公司。

AR2130電子分析天平，德國賽多利斯集團(tuán)；LDZX-75KBS高溫蒸汽滅菌鍋，中國上海申安醫(yī)療器械廠；JJ060387超凈工作臺(tái)，中國吳江市凈化設(shè)備總廠；Pico-21臺(tái)式離心機(jī)，Thermo Fisher；DHG-9620A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；DHP-9082生化培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HH-S數(shù)控恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 明日葉內(nèi)生真菌的分離

采用經(jīng)典三步消毒法(乙醇-NaClO-乙醇)對(duì)明日葉各器官消毒，即分別用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒40 s和30 g/L NaClO消毒3 min，期間無菌水沖洗多次。空白對(duì)照：最后一次沖洗的無菌水涂布在分離培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)并觀察，未見任何菌長(zhǎng)出則說明表面消毒徹底。將消毒后組織放在無菌濾紙上，吸干水分，利用解剖刀切取植物組織，葉片和花切成0.5 cm×0.5 cm小片，莖和果實(shí)切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm小塊，接種到PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后，挑取不同形態(tài)菌落的菌絲接種到新的平板上。經(jīng)多次純化，得到明日葉內(nèi)生真菌[11]。

1.2.2 內(nèi)生真菌屬種分子鑒定

參考耿直等[12]的方法并加以改進(jìn)，利用無菌接種環(huán)挑取真菌純培養(yǎng)物少許，混懸于PCR裂解液中，80 ℃裂解15 min，裂解產(chǎn)物作為PCR擴(kuò)增模板。采用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行擴(kuò)增，最后擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，合格后送上海生工測(cè)定序列。利用NCBI網(wǎng)站BLAST程序在線進(jìn)行序列的同源性比對(duì)。

1.2.3 內(nèi)生真菌功能菌株篩選

產(chǎn)黃酮功能篩選參考楊夢(mèng)莉等[13]的方法，選擇NaOH溶液、FeCl3乙醇溶液、濃鹽酸-鎂粉溶液初步篩選產(chǎn)黃酮菌株，利用硝酸鋁顯色法測(cè)定菌株黃酮含量。抑菌功能初步篩選采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，將分離純化的明日葉菌株分別接種于PDA平板中心位置，再以內(nèi)生真菌為中心將病原菌(細(xì)菌：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌；真菌：黃曲霉、赭曲霉、禾谷鐮刀霉)接種于平板四周，以僅接病原菌的平板作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)和對(duì)照均設(shè)3次重復(fù)，27 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察待測(cè)菌對(duì)病原菌的拮抗作用[14]。將初篩后菌株采用濾紙片法進(jìn)行復(fù)篩，將3種真菌指示菌菌液和4種細(xì)菌指示菌菌液各0.2 mL分別均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，把直徑1 cm的無菌濾紙片浸泡在明日葉內(nèi)生真菌菌液中1 min，無菌鑷子取出，分別貼在涂布有不同病原指示菌的平板上，每個(gè)平板貼3張濾紙片呈等邊三角形排列，37 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察內(nèi)生真菌對(duì)各種病原菌的抑制作用[15]，確定菌株的抑菌性能。

1.2.4 最佳菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

參考柏倩等[16]的方法對(duì)篩選的菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。以黃酮產(chǎn)量為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置單因素和正交試驗(yàn)。單因素試驗(yàn)：設(shè)置基本發(fā)酵條件為起始pH自然，將目的菌株接入到裝液量為60 mL/150 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d。以此為基礎(chǔ)，調(diào)整各因素水平，研究不同發(fā)酵時(shí)間(d)、發(fā)酵溫度(℃)、轉(zhuǎn)速(r/min)、裝液量(mL/150 mL)、起始pH對(duì)黃酮含量的影響，因素與水平見表1。正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表1單因素試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of single factor tests

2 結(jié)果與分析

2.1 明日葉內(nèi)生真菌分離

明日葉的不同器官共分離可培養(yǎng)內(nèi)生真菌34株，對(duì)其進(jìn)行分子鑒定，發(fā)現(xiàn)25株內(nèi)生真菌的ITS基因序列與數(shù)據(jù)庫中的模式菌株的相似性介于99%～100%。根據(jù)設(shè)定的ITS基因序列同源性>97%作為同一分類單元，由表2可知，34株內(nèi)生真菌劃分屬于1門、4綱、8目、10科、10屬、22種，優(yōu)勢(shì)綱為Dothideomycetes(64.7%)，優(yōu)勢(shì)目Cladosporiales(32.4%)，優(yōu)勢(shì)科Cladosporiaceae(32.4%)，優(yōu)勢(shì)屬Cladosporium(32.4%)，優(yōu)勢(shì)種為Alternariaalternata(11.8%)，其中，果實(shí)的12株菌鑒定為5屬8種，分別為Alternariaalternata、Alternariabrassicae、Aspergillusfumigatus、Aspergillusjaponicus、Cladosporiumcladosporioides、Cladosporiumanthropophilum、Epicoccumnigrum、Pyronemadomesticum，優(yōu)勢(shì)種屬為Alternariaalternata；莖的11株菌鑒定為5屬10種，分別為Cladosporiumsp.、Cladosporiumtenuissimum、Cladosporiumperangustum、Cladosporiumanthropophilum、Cladosporiumcladosporioides、Cladosporiumcolocasiae、Epicoccumnigrum、Colletotrichumboninense、Myxosporacrassiseta、Cercosporacanescens，優(yōu)勢(shì)種屬為Cladosporiumtenuissimum；葉的9株菌鑒定為5屬8種，分別為Cladosporiumtenuissimum、Colletotrichumkarsti、Fusariumgraminearum、Fusariumasiaticum、Fusariumsp.、Phyllostictacf.capitalensis、Cercosporaapii、Cercosporacanescens，優(yōu)勢(shì)種屬為Colletotrichumkarsti；花的2株鑒定為1屬2種，分別為Aspergillusuvarum、Aspergillusjaponicus。果實(shí)和莖的共有屬為Epicoccum，莖和葉的共有屬為Cercospora、Colletotrichum，果實(shí)、莖和葉共有屬為Cladosporium，果實(shí)和花共有屬為Aspergillus，果實(shí)、莖、葉和花未見共有屬(圖1)。

表2 明日葉不同器官內(nèi)生真菌分布及ITS序列 BLAST 比對(duì)結(jié)果Table 2 Distribution of endophytic fungi in different organs of A.keiskei and the results of ITS sequence BLAST comparison

圖1 明日葉內(nèi)生真菌的Venn 圖Fig.1 The venn diagram of endophytic fungi strains in A.keiskei

2.2 明日葉可培養(yǎng)內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育分析

采用BioEdit軟件全序列比對(duì)，MEGA X軟件聚類分析，以鄰接法構(gòu)建明日葉果實(shí)(圖2-a)、莖(圖2-b)和葉(圖2-c)、花(圖2-d)器官分離的可培養(yǎng)內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，其中bootstrap檢驗(yàn)值≥50%，重復(fù)1 000次。以綱為類群?jiǎn)挝?，系統(tǒng)發(fā)育樹將果實(shí)器官中分離的5個(gè)屬分為4個(gè)不同的類群，將莖器官中分離的5個(gè)屬分為3個(gè)不同的類群，將葉器官中分離的4個(gè)屬分為2個(gè)不同的類群，將花器官中分離的1個(gè)屬分為1個(gè)不同的類群，說明明日葉不同器官分離的可培養(yǎng)內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育存在一定多樣性。

a-果實(shí)；b-莖；c-葉；d-花圖2 明日葉果實(shí)、莖、葉、花器官內(nèi)生真菌群進(jìn)化樹Fig.2 Endophytic fungi phylogenetic tree in organs of fruit, stem, leaf and flower in A.keiskei

2.3 明日葉內(nèi)生真菌功能菌篩選分析

由表2可知，34株內(nèi)生真菌中9株能產(chǎn)黃酮，1株分離自莖、3株分離自葉、1株分離自花、4株分離自果實(shí)，共歸類于6屬，分別是Alternaria、Aspergillus、Cladosporium、Colletotrichum、Cercospora和Epicoccum。菌株產(chǎn)黃酮強(qiáng)弱依次為MRY-1、MRY-9、MRY-34、MRY-12、MRY-32、MRY-18、MRY-30、MRY-6和MRY-4，其中MRY-1黃酮產(chǎn)量為1.194 mg/g。根據(jù)病原細(xì)菌抑菌性能檢測(cè)，34株可培養(yǎng)內(nèi)生真菌中8株抑制大腸桿菌、5株抑制金黃色葡萄球菌、5株抑制志賀菌、5株抑制沙門氏菌。對(duì)至少1種病原細(xì)菌顯示抑制效果的有15株(44.1%)，其中對(duì)2種及以上病原細(xì)菌有抑制作用的菌株8株，占總菌株23.5%。根據(jù)病原真菌抑菌性能測(cè)定結(jié)果顯示，20株抑制黃曲霉、19株抑制赭曲霉、3株抑制鐮刀霉。26株內(nèi)生真菌(76.5%)對(duì)至少1種真菌指示菌有抑制效果，對(duì)2種及以上病原真菌顯示抑制作用有13株，占總菌株38.2%。某些菌株抑菌效果較好，同時(shí)對(duì)病原真菌和病原細(xì)菌表現(xiàn)出抑菌效果的有12株(35.3%)。利用濾紙片法復(fù)篩，整體表現(xiàn)較強(qiáng)抑菌作用的菌株分別是MRY-1、MRY-13、MRY-28、MRY-34、MRY-26，包括5屬：Alternaria、Cladosporium、Myxospora、Aspergillus、Fusarium。可知MRY-1具有較好的產(chǎn)黃酮和抑菌能力，其形態(tài)圖見電子增強(qiáng)出版附件(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.029994)。

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

由圖3可知，MRY-1黃酮產(chǎn)量在第7天時(shí)達(dá)最高，原因可能是菌株新陳代謝與黃酮類物質(zhì)呈正相關(guān)，發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，菌株繁殖越快，黃酮產(chǎn)量越多。但時(shí)間過長(zhǎng)，營養(yǎng)物質(zhì)無法滿足菌株生長(zhǎng)代謝，黃酮變少，基于此，后期正交試驗(yàn)選擇培養(yǎng)時(shí)間分別為5、7、9 d。當(dāng)溫度低于26 ℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)被限制，溫度28 ℃時(shí)菌株產(chǎn)黃酮量最佳，溫度過高，黃酮產(chǎn)量緩慢下降?；诖耍笃谡辉囼?yàn)選擇培養(yǎng)溫度分別為26、28、30 ℃。轉(zhuǎn)速方面，黃酮產(chǎn)量在120 r/min時(shí)最高，轉(zhuǎn)速的增加黃酮產(chǎn)量逐漸降低，基于此，選擇90、120、150 r/min較合適。裝液量在75 mL時(shí)菌株產(chǎn)黃酮最多，超過后總黃酮量有明顯下降趨勢(shì)。因此正交試驗(yàn)選擇裝液量為45、60、75 mL(150 mL錐形瓶)較為合適。內(nèi)生真菌在pH為7時(shí)黃酮產(chǎn)量達(dá)到最高，pH過酸和過堿都會(huì)降低菌株黃酮產(chǎn)量，因此確定正交試驗(yàn)培養(yǎng)基起始pH值為7。

圖3 MRY-1菌株發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Single factor test results of fermentation conditions of MRY-1 strain

2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了關(guān)于發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、裝料量4個(gè)因素的L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3?？芍绊懢闙RY-1黃酮產(chǎn)量的主次因素順序分別為發(fā)酵時(shí)間>轉(zhuǎn)速>發(fā)酵溫度>裝液量，以菌株黃酮產(chǎn)量為指標(biāo)，得出MRY-1最優(yōu)培養(yǎng)基條件為A2B1C2D2，即時(shí)間7 d、溫度26 ℃、轉(zhuǎn)速120 r/min、裝液量60 mL/150 mL，MRY-1黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.598 mg/g。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生真菌資源十分豐富，大部分植物體內(nèi)含有1種或以上的內(nèi)生真菌。目前菌株種類數(shù)量已超過100萬種[17]，由于其長(zhǎng)期寄生植物，直接或間接地參與植物的次生代謝，影響次生代謝產(chǎn)物的合成和積累，因此內(nèi)生真菌可產(chǎn)生與寄生植物相同或相似的物質(zhì)，是探索新的且有意義的活性物質(zhì)的重點(diǎn)方向[18]。已報(bào)道的植物內(nèi)生真菌絕大多數(shù)屬于Alternaria、Fusarium、Ascomycetes、Penicillium等真菌[19]。徐全智[20]以寧夏枸杞為材料，獲得363株內(nèi)生真菌分屬14個(gè)屬，其中Alternaria(46%)、Thielavia(14%)和Aspergillus(13%)為優(yōu)勢(shì)屬。宋海燕等[21]從4個(gè)地區(qū)棉花樣本中分離出79個(gè)菌株16個(gè)屬，包括Alternaria、Setosphaeria、Fusarium等。本研究篩選得到的34株明日葉可培養(yǎng)內(nèi)生真菌分屬于1門、4綱、8目、10科、10屬、22種，果實(shí)的12株優(yōu)勢(shì)種屬為Alternariaalternata；莖的11株菌優(yōu)勢(shì)種屬為Cladosporiumtenuissimum，葉的9株優(yōu)勢(shì)種屬為Colletotrichumkarsti，花僅有屬Aspergillussp.，與絕大多數(shù)藥用被子植物內(nèi)生真菌菌株多樣性結(jié)果相似[6]。

銀杏、青錢柳、燈盞花、甘草等各種植物中分離篩選產(chǎn)黃酮類物質(zhì)的內(nèi)生真菌包括Alternariasp.、Aspergillussp.、Fusariumsp.、Sirosporiumsp.、Eupenicilliumsp.等，其產(chǎn)黃酮能力各有差異。如楊志軍等[22]從甘草中篩選得到內(nèi)生菌的代謝物總黃酮量1.13 mg/g；周寧[23]篩選到甘蔗葉2株產(chǎn)黃酮類化合物的內(nèi)生真菌GZ-4(Aspergillusniger)和GZ-5(Aspergillusaculeatus)，總黃酮量分別為1.21和4.03 mg/g；趙曉璐等[24]從荷葉篩選的棘孢曲霉Aspergillusaculeatus總黃酮量為8.2 mg/g；何福林等[25]分離的銀杏內(nèi)生真菌PhomaglomerateEnf 7黃酮產(chǎn)量最高達(dá)0.7 mg/g。本研究分離的9株明日葉產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌產(chǎn)黃酮量為0.745～1.195 mg/g，其中菌株MRY-1(Alternariaalternata)優(yōu)化發(fā)酵條件后黃酮產(chǎn)量提高至1.598 mg/g，產(chǎn)黃酮能力中等，后期將進(jìn)一步優(yōu)化黃酮類物質(zhì)的提取方法，提高黃酮獲得量。

內(nèi)生真菌抑菌機(jī)理主要通過分泌產(chǎn)生具有抑菌功能的物質(zhì)，從空間和營養(yǎng)上抑制病原菌繁殖，或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性能力。從植物中篩選抑菌能力的內(nèi)生真菌對(duì)生物防治具有現(xiàn)實(shí)意義。施文廣等[26]從檀香紫檀植物根、莖、葉組織分離的337株內(nèi)生真菌中，16株(35.56%)對(duì)金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、大腸桿菌和痢疾桿菌具有抑制活性，36株(80.00%)可抑制白色念珠菌和黑曲霉，15株(33.33%)對(duì)6種測(cè)試細(xì)菌和真菌均具抑制活性。本研究同樣顯示明日葉內(nèi)生真菌對(duì)病原指示真菌具有抑制作用的菌株數(shù)量多于抑制細(xì)菌指示菌，其中6株有較強(qiáng)的抑菌性能，包括鏈格孢屬、枝孢屬、粘孢子屬、曲霉屬、鐮刀霉屬。趙梓伊等[27]研究發(fā)現(xiàn)桑葚總黃酮對(duì)5種病原指示菌有不同程度的抑制作用，其中對(duì)大腸桿菌、白色假絲酵母及金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強(qiáng)，表明桑葚總黃酮可以作為天然活性成分用作抑菌劑。本實(shí)驗(yàn)篩選的9株產(chǎn)黃酮菌株中7株具有抑菌能力，且6株菌株可抑制2種以上指示病原菌，說明產(chǎn)黃酮與抑菌作用存在正相關(guān)性，后續(xù)將提取產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的黃酮類產(chǎn)物，檢測(cè)提取物的抑菌能力。

內(nèi)生真菌作為一種潛在的自然資源，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究從明日葉果實(shí)、莖、葉、花分離的34株內(nèi)生真菌，對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)黃酮和抑菌活性測(cè)定，結(jié)果表明明日葉存在較高比例的功能性菌株，為全面挖掘明日葉內(nèi)生真菌代謝物研究提供了菌株資源，同時(shí)也為解決科學(xué)利用藥食兼用的明日葉活性物質(zhì)資源提供了新思路，但具體的活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)及生理功能有待進(jìn)一步探究，特別是MRY-1菌株，后續(xù)將對(duì)其深入探討。同時(shí)還可以通過培養(yǎng)基配方的改良、微生物誘變育種等手段，增強(qiáng)菌株的穩(wěn)定性。