李培謙，藥震，馮寶珍，師守國

(運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城，044000)

克倫生(Crison)是常見的鮮食無核葡萄品種，因其品質(zhì)好，抗病性強(qiáng)，儲(chǔ)藏期長等優(yōu)點(diǎn)倍受農(nóng)戶青睞，然而在采后儲(chǔ)藏過程中仍有腐爛病發(fā)生。植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)廣泛存在，具有豐富的多樣性[1-2]，它們與植物長期共存，在植物生命過程中發(fā)揮著多種功能[3]。內(nèi)生菌能夠誘導(dǎo)寄主植物的抗性產(chǎn)生，目前人們已經(jīng)證實(shí)菌根菌[4]、植物內(nèi)生細(xì)菌[5]及線蟲[6]通過激發(fā)寄主系統(tǒng)獲得性抗性以增強(qiáng)對病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)。比如Colletotrichumtropicale能誘導(dǎo)可可葉片內(nèi)幾百個(gè)防御基因表達(dá)，增強(qiáng)植物免疫力[7]。另一方面，內(nèi)生菌也能夠抑制寄主植物防御反應(yīng)，侵染寄主植物，同時(shí)也為其他病原菌共同侵染提供條件[8-9]。內(nèi)生菌還通過與病原菌直接相互作用的方式調(diào)節(jié)宿主植物病害的發(fā)生[3]。如內(nèi)生菌可以通過過度寄生、競爭或抗菌來拮抗病原體?？傊壳暗难芯勘砻鲀?nèi)生菌能夠通過拮抗作用減弱植物病害發(fā)生，也能通過協(xié)助作用加重病害發(fā)生[3]。

葡萄內(nèi)生菌包括真菌、細(xì)菌、放線菌，主要分布在根、莖、葉和藤條內(nèi)，而果實(shí)內(nèi)生菌報(bào)道很少。在樹干、藤條、根部、葉片主要分離到細(xì)菌和放線菌[10]。葡萄內(nèi)生菌以芽胞桿菌(Bacillusspp.)、假單胞菌(Pseudomonasspp.)、彎曲桿菌(Curtobacteriumspp.)、葡萄球菌(Staphylococcusspp.)和鏈霉菌(Streptomycesspp.)居多[10-11]。PANCHER等[12]對意大利北部112個(gè)葡萄園的葡萄莖稈內(nèi)生真菌群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鏈格孢(Alternariasp.)和黑附球菌(Epicoccumnigrum)分布最廣。國內(nèi)學(xué)者從赤霞珠分離到73個(gè)菌株，包括23個(gè)細(xì)菌，14個(gè)放線菌，36個(gè)真菌，其中從根部分離的內(nèi)生菌最多，占比34%，而從果實(shí)分離的內(nèi)生菌最少，占比12%[13]。GUARNACCIA等[14]對歐洲和以色列葡萄植株內(nèi)生菌進(jìn)行調(diào)查，分離鑒定了間作殼屬(Diaporthe)的175個(gè)菌株，絕大多數(shù)為D.eres和D.ampelina，并且D.baccae,D.celeris,D.hispaniae和D.hungariae菌株對葡萄均具有強(qiáng)致病性。然而，鮮食葡萄儲(chǔ)藏期內(nèi)生菌的種類及致病性罕見報(bào)道。

本研究對儲(chǔ)藏期鮮食克倫生葡萄內(nèi)生菌進(jìn)行分離鑒定，并測定其致腐能力，為葡萄采后病害防控提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基及樣品

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min?？藗惿咸压麑?shí)于2020年10～12月取自運(yùn)城夏縣葡萄冷庫。

1.1.2 試劑及設(shè)備

2×TaqPCR MasterMix II PCR擴(kuò)增試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker DL2000，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒，艾德萊生物科技公司；引物ITS1/ITS4、NL1/NL4，生工生物工程(上海)股份有限公司；葡萄糖、NaCl、瓊脂粉等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

BMJ-250型培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Olympus CX43顯微鏡，日本奧林巴斯公司；T100TMThermal Cycler PCR儀，美國伯樂公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄內(nèi)生菌的分離鑒定

1.2.1.1 內(nèi)生菌的分離純化

選取健康的克倫生葡萄果實(shí)15 g，先在自來水下沖洗晾干，再用75%酒精充分浸泡5 min，無菌水沖洗3～5次，然后用5.4% 的NaClO溶液浸泡5 min，無菌水沖洗4～5次，最后于無菌吸水紙上晾干。置于無菌研缽內(nèi)加10 mL無菌水研碎，取組織液100 μL均勻涂布在PDA平板上。將平板置于25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)20 d，每天觀察菌落的生長情況，根據(jù)菌落的顏色以及形態(tài)挑取單菌落，將菌株(K1～K13)進(jìn)行純化后保存，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

消毒可靠性檢驗(yàn)采用漂洗液培養(yǎng)法和組織印記檢查法。漂洗液培養(yǎng)：取最后一次漂洗液100 μL均勻涂在PDA平板上，按上述條件進(jìn)行培養(yǎng)。組織印跡檢查：葡萄晾干后，用無菌的鑷子夾住葡萄，在PDA平板上滾動(dòng)印記，置于相同條件下培養(yǎng)。在無菌操作和實(shí)驗(yàn)材料的嚴(yán)格消毒滅菌下，組織印記與漂洗液培養(yǎng)的培養(yǎng)基上無任何微生物生長。

1.2.1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

內(nèi)生菌株純化后，觀察其菌落特點(diǎn)，用顯微鏡觀察菌絲及孢子形態(tài)并拍照。

1.2.1.3 基因組DNA提取及分子生物學(xué)鑒定

將菌株在PDA平板上培養(yǎng)10 d，用直徑7 mm的打孔器打取菌餅，置于150 mL液體PDA中，搖瓶培養(yǎng)5 d，收集菌絲。液氮研磨后，采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。采用真菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、DNA模板1 μL、上下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(internal transcribed spacer)序列擴(kuò)增引物為ITS1和ITS4[15];核糖體28S rDNA D1/D2區(qū)序列引物為NL1(TGCGTTGATTACGTCCCTGC)和NL4(GGTCCGTGTT-TCAAGACGG)[16]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步檢測后，送到楊凌天潤奧科生物科技有限公司進(jìn)行測序，并上傳至美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GenBank。

1.2.1.4 進(jìn)化樹構(gòu)建

測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行在線BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)比對分析，并下載模式菌株序列用CLUTALX 1.83軟件進(jìn)行多重序列比對。使用MEGA-X 軟件以鄰接法(neighbor-joining methods，NJ)對ITS、28 S rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，分析該菌與其他菌株的親緣關(guān)系，以確定其分類地位[17-18]。

1.2.2 葡萄儲(chǔ)藏期病原菌分離鑒定

將明顯病變的克倫生葡萄果實(shí)用75%酒精處理1 min，然后用無菌水沖洗4～5次；用鑷子取病健交界處置于PDA平板上，于25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)2～3 d；待出現(xiàn)菌落后，再次轉(zhuǎn)接PDA平板，然后將菌株保存。結(jié)合形態(tài)學(xué)和ITS序列進(jìn)行鑒定，具體方法同上。

1.2.3 致腐能力測定

選取健康青提葡萄維多利亞、櫻桃番茄千禧、蘋果藤木一號(hào)果實(shí)，先用無菌水沖洗干凈，再經(jīng)75%酒精消毒，無菌水沖洗后晾干備用。用消毒打孔器在果實(shí)赤道處制造輕微傷口，深度約2 mm；用直徑7 mm的打孔器取得菌餅，菌絲面貼于傷口。每個(gè)菌株處理6個(gè)果實(shí)，內(nèi)生菌和致病菌均進(jìn)行致病性測定。于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，接種1 d后開始觀察發(fā)病癥狀，記錄癥狀。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，對照組用無菌水處理。

1.2.4 對峙培養(yǎng)

將純化的內(nèi)生菌、腐爛病原菌在PDA平板上于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，用直徑7 mm打孔器分別在菌落邊緣打孔，然后將菌餅同時(shí)接種于新的PDA平板(間距2 cm)，置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，檢測內(nèi)生菌對病原菌是否具有拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄內(nèi)生菌的分離純化

在健康克倫生葡萄果實(shí)內(nèi)共分離到20個(gè)真菌菌株，其中K1～K13菌落培養(yǎng)性狀基本一致，菌株在25 ℃ PDA平板上生長緩慢，大約30 d能長滿平板。在PDA培養(yǎng)基上菌落呈白色絨狀，菌落表面平展，菌絲分生孢子單胞，透明，圓柱狀，直或彎，表面光滑，尺寸為(3.0～5.0) μm×(0.7～1.8) μm。其形態(tài)特征與菌核枝頂孢(Acremoniumsclerotigenum)形態(tài)特征吻合(圖1-a)。

a-PDA上菌落生長特征；b-菌絲；c-分生孢子圖1 葡萄內(nèi)生菌形態(tài)特征Fig.1 Morphology of endophytes from grape

隨機(jī)選取3個(gè)菌株K2、K7、K8提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增后測序，序列上傳GenBank(ITS序列：MW64452～MW644524，28S rDNA D1/D2區(qū)序列：MW644777～MW644779)。經(jīng)過NCBI在線BLAST分析后下載CBS模式菌株序列，利用Mega-X構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖2-a所示，ITS序列進(jìn)化樹分析顯示，K2、K7、K8與A.sclerotigenum聚為一支；圖2-b所示，28S rDNA D1/D2區(qū)序列分析顯示K2、K7、K8與A.sclerotigenum聚為一支，結(jié)合形態(tài)學(xué)特點(diǎn)將K2、K7、K8鑒定為菌核枝頂孢(A.sclerotigenum)。

a-基于ITS序列構(gòu)建NJ進(jìn)化樹；b-基于28 S rDNA D1/D2區(qū)序列構(gòu)建NJ進(jìn)化樹圖2 基于ITS序列和28S rDNA序列構(gòu)建NJ樹Fig.2 Neighbor joining tree constructed with sequences of the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) regions and 28S rRNA gene

2.2 葡萄儲(chǔ)藏期腐爛病菌分離鑒定

由病變克倫生果實(shí)上分離純化得到菌株LK4和LK7，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定。LK7菌落灰色至黑灰色，分生孢子梗叢生，不分枝或分支，直立，有分隔，分隔處縊縮，青灰色至灰色，頂端簇生分生孢子，頂端的產(chǎn)孢細(xì)胞膨大；分生孢子橢圓形或倒卵形至近圓形，表面光滑無凸起，無色，單胞，成堆時(shí)呈現(xiàn)淡黃色，其特征與灰葡萄孢(Botrytiscinerea)特征吻合(圖3-b和圖3-c)。LK4菌落初期正面為灰白色后漸變?yōu)榘瞪燎嗪稚?；背面暗褐色至黑褐色。菌絲無色、無隔膜，分生孢子梗叢生，有分支，直立或彎曲；分生孢子深褐色，倒梨形、卵形或倒棍棒形，棕褐色，有3～8個(gè)橫隔，1～4個(gè)縱隔，分隔處略隘縮，有柱狀短喙，其形態(tài)特征符合鏈格孢(Alternariasp.)(圖3-d和圖3-e)。

將菌株LK7的ITS序列(GenBank no：MZ882168)在NCBI進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)其與B.cinerea同源性達(dá)99%，下載同源序列構(gòu)建NJ進(jìn)化樹進(jìn)一步證實(shí)為B.cinerea。將菌株LK4的ITS序列(GenBank no：MZ882167)在NCBI進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)與Alternariasp.同源性達(dá)99%，構(gòu)建NJ進(jìn)化樹進(jìn)一步證明該菌株為Alternariasp.。

a-病變克倫生果實(shí)；b-灰葡萄孢LK7菌落；c-菌株LK7菌絲及分生孢子；d-鏈格孢LK4菌落；e-菌株LK4菌絲及分生孢子圖3 腐爛克倫生葡萄病原菌Fig.3 Pathogen from rot Crison fruits

2.3 致腐能力測定

將菌株K7分別接種于青提、番茄和蘋果，并以無菌水、灰葡萄孢LK7作為參照。接種7 d后，無菌水處理組果實(shí)完好無損；灰葡萄孢LK7處理組果實(shí)完全腐爛，果實(shí)發(fā)病率100%(圖4-b)；而K7處理組，葡萄果實(shí)發(fā)病緩慢，發(fā)病區(qū)域僅局限于接種部位(圖4-c)，甚至放置20 d，處理果實(shí)發(fā)病部位仍然局限于接種區(qū)域(圖4-d)。由此可見，K7對葡萄果實(shí)致腐性明顯，致腐能力弱于灰葡萄孢。

a-無菌水接種7 d；b-灰葡萄孢LK7接種7 d；c-菌株K7接種7 d；d-菌株K7接種20 d圖4 內(nèi)生菌K7對葡萄的致腐作用Fig.4 Saprogenicity of endophyte K7 on grape

圖5顯示，內(nèi)生菌K7對番茄具有明顯致腐性，但致腐能力弱于灰葡萄孢。K7也能夠引起蘋果腐爛，致腐能力弱于灰葡萄孢(圖6)。

a-灰葡萄孢LK7接種7 d；b-菌株K7接種7 d；c-無菌水處理圖5 內(nèi)生菌K7對番茄的致腐作用Fig.5 Saprogenicity of endophyte K7 on tomato

a-灰葡萄孢LK7接種7 d；b-菌株K7接種7 d；c-無菌水處理圖6 內(nèi)生菌K7對蘋果致腐作用Fig.6 Saprogenicity of endophyte K7 on apple

2.4 內(nèi)生菌與致病菌關(guān)系

為探討內(nèi)生菌與病原菌的相互作用，將內(nèi)生菌K7與病原菌LK4、LK7對峙培養(yǎng)。如圖7所示，內(nèi)生菌K7生長緩慢，而病原菌LK4、LK7在PDA上生長迅速，占領(lǐng)了絕大部分的營養(yǎng)和空間，因此內(nèi)生菌K7與病原菌LK4、LK7之間無拮抗作用，它們均能引起果實(shí)腐爛。

a-K7與灰葡萄孢LK4；b-K7與鏈格孢LK7圖7 內(nèi)生菌與病原菌對峙培養(yǎng)Fig.7 Endophytes and pathogens confrontation culture

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定了克倫生葡萄果實(shí)內(nèi)生菌A.sclerotigenum，證明了該菌能夠引起葡萄、番茄和蘋果腐爛；明確了儲(chǔ)藏期克倫生葡萄致腐菌主要為灰葡萄孢(B.cinerea)和鏈格孢(Alternariasp.)。本研究首次報(bào)道了克倫生葡萄內(nèi)生菌A.sclerotigenum，豐富了葡萄內(nèi)生菌多樣性，也為克倫生采后病害防治提供了重要理論依據(jù)。

Acremonium屬種類繁多，大約有150個(gè)種，該屬真菌大多在土壤中腐生或者寄生在植物、昆蟲等生物體內(nèi)，有些種類還能引起人類和哺乳動(dòng)物疾病[19]。Acremonium屬鑒定除了需要形態(tài)學(xué)特征，還需要結(jié)合ITS序列和28S序列等基因進(jìn)行鑒定。PARK等[20]從土壤中分離到該屬真菌，利用形態(tài)學(xué)及ITS序列分析鑒定為A.sclerotigenum。GIRALDO等[21]從西班牙土壤內(nèi)分離到Acremonium屬真菌，利用形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合ITS和28S序列進(jìn)行鑒定，鑒定了該屬2個(gè)新種。BURRUANO等[22]從葡萄根、葉、芽、種子內(nèi)分離到94株Acremonium屬內(nèi)生菌；LO+PICCOLO等[16]利用ITS和28S rDNA將這94個(gè)菌株進(jìn)行鑒定，其中有68個(gè)為A.persicinum和26個(gè)為A.sclerotigenum[16]。本研究首次從克倫生葡萄果實(shí)中分離到了13株A.sclerotigenum菌株，其形態(tài)特征與前人[16,20-21]研究基本一致。

儲(chǔ)藏期葡萄腐爛由黑曲霉、黑根霉、灰葡萄孢、白腐病菌、炭疽病菌、青霉菌、交鏈孢霉等病菌侵染引起，并且灰霉和交鏈孢霉在低溫條件下具有較強(qiáng)的致病性，是低溫貯運(yùn)中的主要致腐菌[23]。本研究中，在儲(chǔ)藏期克倫生葡萄果實(shí)上分離到的致腐爛菌主要為灰葡萄孢和鏈格孢，說明克倫生葡萄儲(chǔ)藏期應(yīng)該加強(qiáng)對這2種病原菌的防治。此外，筆者也發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌K7能夠引起果實(shí)腐爛，說明內(nèi)生菌引起的植物病害值得深入研究。

目前植物內(nèi)生菌焦點(diǎn)在于拮抗菌的報(bào)道，而內(nèi)生菌A.sclerotigenumK1菌株對克倫生葡萄儲(chǔ)藏期致病菌B.cinerea和Alternariasp.均無抑制作用。HUANG等[24]分析了葫蘆科植物的1044株內(nèi)生菌，發(fā)現(xiàn)有84株對葫蘆科主要致病菌無拮抗活性。體外對峙培養(yǎng)內(nèi)生菌的拮抗作用表現(xiàn)為營養(yǎng)競爭、抗生物質(zhì)及重寄生。在PDA平板上A.sclerotigenumK7菌株生長速率遠(yuǎn)小于病原菌，對病原菌無抑制作用。Acremonium屬真菌大多為土壤和植物腐生菌，有些種能夠引起人類、動(dòng)物疾病和植物病害[25]。前人對94株Acremonium屬葡萄內(nèi)生真菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)所有的A.persicinum菌株對葡萄霜霉菌(Plasmoparaviticola)游動(dòng)孢子萌發(fā)具有不同程度的抑菌作用，而部分A.sclerotigenum菌株卻對葡萄霜霉病菌無任何抑制作用[16]。A.sclerotigenum可能參與寄主生長過程，提高寄主對環(huán)境脅迫的抗性，這些需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。本文首次報(bào)道了儲(chǔ)藏期克倫生葡萄內(nèi)生菌A.sclerotigenum，明確了腐爛病菌的主要種類，為葡萄采后病害防治提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。