茍宗芹，音提扎爾·吐爾遜買買提，田園，戴健欣，艾連中，熊智強(qiáng)

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

番茄紅素(lycopene)是一種脂溶性天然色素，具有強(qiáng)抗氧化和清除自由基的活性，能抗衰老、調(diào)血脂和預(yù)防各種癌癥，已被用于健康食品和功能性飲料的開發(fā)。番茄紅素屬于四萜類化合物，其生物合成通過異戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)作為前體，由香葉基香葉基二磷酸合成酶(CrtE)生成香葉基二磷酸酯，在八氫番茄紅素合成酶(CrtB)作用下合成八氫番茄紅素，然后由八氫番茄紅素去飽和酶(CrtI)作用產(chǎn)生番茄紅素。IPP和DMAPP來源于甲羥戊酸(mevalonate, MVA)途徑和2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(methyl-D-erythritol 4-phosphate, MEP)途徑，微生物中酵母和其他真菌通常存在MVA途徑，而大多數(shù)細(xì)菌如大腸桿菌只存在MEP途徑[1]。番茄紅素主要通過植物天然提取、化學(xué)合成和微生物合成獲取，但植物天然提取法成本高，化學(xué)合成法有化學(xué)殘留且易造成環(huán)境污染。相比而言，微生物合成具有無污染、生產(chǎn)周期短等優(yōu)勢，是較為理想的生產(chǎn)方式。

利用微生物作為細(xì)胞工廠異源合成番茄紅素已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)，特別是大腸桿菌作為常用萜類合成底盤細(xì)胞，具有MEP途徑為異源合成番茄紅素直接提供前體，有明顯的天然優(yōu)勢和研究前景。目前微生物異源生產(chǎn)番茄紅素主要依賴于代謝工程改造來提高其產(chǎn)量。ALPER等[2]采用基因組尺度代謝流平衡分析，組合敲除谷氨酸脫氫酶(△gdhA)、丙酮酸脫氫酶(△aceE)和甲醛脫氫酶(△fDhE)，增強(qiáng)E.coli內(nèi)源MEP途徑的前體物質(zhì)DMAPP和IPP合成，使番茄紅素產(chǎn)量提高37%。XIE等[3]對番茄紅素合成酶(CrtYB)進(jìn)行修飾，與來源于紅發(fā)夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)crtI和crtE及釀酒酵母MVA途徑中限速酶HMG1催化區(qū)tHMG1共表達(dá)，使番茄紅素單位細(xì)胞產(chǎn)量達(dá)到24.41 mg/g菌體干重(dry cell weight,DCW)。

培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件優(yōu)化也是提高微生物異源生產(chǎn)番茄紅素的通用策略。KIM等[4]對產(chǎn)番茄紅素工程菌的培養(yǎng)基進(jìn)行碳源優(yōu)化，將葡萄糖和L-阿拉伯糖作為輔助碳源補(bǔ)充到以甘油為碳源的培養(yǎng)基中，使番茄紅素的濃度和得率顯著提高，終產(chǎn)量達(dá)到1.35 g/L，比優(yōu)化前提高了約7倍。JIN等[5]構(gòu)建異源合成番茄紅素重組菌株，以LB培養(yǎng)基作對照，另外選取2×YT+G培養(yǎng)基和SM培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后2×YT+G培養(yǎng)基的產(chǎn)量最高，相比優(yōu)化前提高1.12倍。本研究基于已構(gòu)建的大腸桿菌番茄紅素異源合成質(zhì)粒pACLYC，首先篩選出高產(chǎn)番茄紅素的大腸桿菌菌株，在LB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素的培養(yǎng)條件，進(jìn)一步提高番茄紅素合成效率，為大腸桿菌異源生產(chǎn)番茄紅素奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而促進(jìn)番茄紅素相關(guān)益生制劑及功能性食品開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、JM110、Top10和BL21(DE3)及pACLYC質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)室保存。pACLYC攜帶番茄紅素合成酶基因crtE、crtB和crtI，氯霉素抗性。由大腸桿菌異源合成番茄紅素途徑可知，大腸桿菌以內(nèi)源IPP和DMAPP合成FPP為前體，通過CrtE、CrtB和CrtI 3個(gè)異源酶連續(xù)催化合成番茄紅素。

1.1.2 培養(yǎng)基和抗生素

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母浸出粉5、NaCl 10。LB固體培養(yǎng)基需加入20 g/L瓊脂粉。本研究添加的抗生素為氯霉素，其工作濃度為50 μg/mL。

1.1.3 主要試劑和儀器

番茄紅素(HPLC級，≥90%，CAS#502-65-8)標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物有限公司；Trizol、氯霉素，生工生物工程(上海)股份有限公司；二氯甲烷、丙酮為分析純，甲醇為色譜純，國藥集團(tuán)；質(zhì)粒提取試劑盒，Axygen公司；Nanodrop 2000c超微量核酸蛋白定量儀，美國Thermo公司；冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司；DU-800型分光光度計(jì)，美國Beckman公司；生化培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；Lightcycle96實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，瑞士Roche公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組大腸桿菌構(gòu)建

分別取1 μL pACLYC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至100 μLE.coliDH5α、JM110、Top10和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，冰上靜置30 min，42 ℃水浴90 s后冰上靜置5 min，加入900 μL LB液體培養(yǎng)基于37 ℃下200 r/min搖床復(fù)蘇1 h，取100 μL菌液涂布于含氯霉素的LB固體培養(yǎng)基，倒置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)16 h挑取轉(zhuǎn)化子。

1.2.2 宿主菌發(fā)酵

挑取1.2.1中平板上長出的單菌落接種于含4 mL LB培養(yǎng)基的試管中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，然后按2%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接至250 mL錐形瓶(含50 mL LB培養(yǎng)基)中，37 ℃、200 r/min發(fā)酵24 h后收集菌體用于番茄紅素提取和測定產(chǎn)量。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取2 mg番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品，加入丙酮進(jìn)行溶解，定容至10 mL容量瓶，配制成200 μg/mL母液。將其用丙酮稀釋成150、100、50、25、12.5 μg/mL溶液后在波長472 nm處測定吸光值。以番茄紅素質(zhì)量濃度X(μg/mL)對吸光值Y進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=0.002 8X-0.015，R2為0.996。

1.2.4 生物量和番茄紅素檢測

將發(fā)酵液稀釋5倍后，用分光光度計(jì)測定OD600，菌體總OD600值為稀釋倍數(shù)乘以稀釋菌液的OD600讀數(shù)。取10 mL發(fā)酵液于已稱重的離心管中，離心收集菌體后置于65 ℃烘干至恒重，稱量獲得發(fā)酵液中菌體干重，建立OD600與菌體干重的線性關(guān)系。

用1 mL丙酮進(jìn)行番茄紅素萃取，置于55 ℃水浴鍋中萃取15 min，其間每隔5 min渦旋振蕩20 s，然后12 000×g離心10 min取上清液用分光光度計(jì)在472 nm下檢測番茄紅素含量，代入1.2.3中的回歸方程[6]。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

基于LB培養(yǎng)基，分別添加葡萄糖、果糖、蔗糖和甘油等碳源(6 g/L)及不同濃度(0、2、4、6、8、10 g/L)的果糖，檸檬酸氫二銨、NH4Cl、(NH4)2SO4和尿素等無機(jī)氮源(5 g/L)及不同NH4Cl質(zhì)量濃度(0、5、10、15、20 g/L)，正己烷、正庚烷、正十二烷和正十六烷等氧載體(10%，體積分?jǐn)?shù))和不同正十二烷體積分?jǐn)?shù)(0%、5%、10%、15%、20%)對番茄紅素產(chǎn)量的影響，確定最佳條件。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，對大腸桿菌異源生產(chǎn)番茄紅素的關(guān)鍵因素進(jìn)一步優(yōu)化，以獲得番茄紅素高產(chǎn)。

1.2.7 RNA提取和q-PCR反應(yīng)

大腸桿菌工程菌培養(yǎng)后收集菌體，參照生工Trizol法提取RNA，Nanodrop 2000c測定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整度。然后依據(jù)TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法制備cDNA。q-PCR通過Lightcycle96實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行測定。用2-ΔΔCT方法分析每個(gè)基因的數(shù)據(jù)，以clpB基因作為內(nèi)參基因，基因引物由華大基因股份有限公司合成(表1)。

表1 本研究使用的引物序列Table 1 Primers used in this study

續(xù)表1

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值，采用Origin 2019作圖，SPSS Statistics 26.0、Design-Expert 10.0.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大腸桿菌菌株對番茄紅素生產(chǎn)的影響

NAM等[7]采用4種不同大腸桿菌異源合成β-胡蘿卜素，發(fā)現(xiàn)不同宿主生產(chǎn)β-胡蘿卜素具有明顯差異，不同大腸桿菌異源合成番茄紅素可能存在明顯差異。本研究采用4株大腸桿菌DH5α、JM110、Top10和BL21(DE3)作為番茄紅素異源生產(chǎn)宿主。結(jié)果表明Top10番茄紅素產(chǎn)量和得率高于其他菌株，達(dá)到124.8 mg/L和12.43 mg/g。BL21(DE3)發(fā)酵產(chǎn)量僅次于Top10(118.4 mg/L)，其次是DH5α和JM110，表明不同菌株異源合成番茄紅素確實(shí)存在顯著差異(圖1)。4株菌株都是常用的大腸桿菌菌株，但只有BL21(DE3)是最常用蛋白表達(dá)宿主菌，能高效表達(dá)各種異源蛋白，其余3種菌株都為常見的基因工程克隆宿主。Top10得率也顯著高于其他3株菌，可能是由于其MEP途徑合成前體IPP和DMAPP最強(qiáng)。

圖1 不同大腸桿菌菌株對番茄紅素生產(chǎn)的影響Fig.1 Effect of different E.coli strains on lycopene production注：番茄紅素得率均通過測定菌體干重(DCW)得到(下同)

李文[8]在選擇異源合成番茄紅素的大腸桿菌時(shí)，BL21(DE3)合成番茄紅素的產(chǎn)量也不是最高，與本研究結(jié)果相似。因此，E.coliTop10/pACLYC為生產(chǎn)番茄紅素的最優(yōu)重組菌株用于后續(xù)研究。

2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化大腸桿菌異源合成番茄紅素

LB培養(yǎng)基是大腸桿菌培養(yǎng)使用最普遍的培養(yǎng)基，它可以促使微生物以較高生長率快速生長。為進(jìn)一步提高大腸桿菌異源合成番茄紅素產(chǎn)量，通過單因素試驗(yàn)對LB培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，分析碳源、無機(jī)氮源和氧載體對大腸桿菌異源合成番茄紅素的影響。

2.2.1 碳源對番茄紅素生產(chǎn)的影響

微生物生長與代謝產(chǎn)物積累受培養(yǎng)基顯著影響，在LB培養(yǎng)基中添加碳源能改善菌株生長和影響目標(biāo)代謝物合成。本研究選取的4種常見碳源中，添加果糖的番茄紅素產(chǎn)量和得率最高，達(dá)到326 mg/L和15.8 mg/g，而添加蔗糖和甘油的番茄紅素產(chǎn)量和得率與LB培養(yǎng)基(空白)相比差異不大，添加蔗糖產(chǎn)量和得率為80.6 mg/L和7.6 mg/g，添加甘油產(chǎn)量和得率為83.6 mg/L和5.1 mg/g。添加葡萄糖得到的番茄紅素產(chǎn)量及得率最低，僅為22.5 mg/L和1.8 mg/g(圖2-a)。李文[8]也發(fā)現(xiàn)添加果糖后番茄紅素產(chǎn)量最高，與本研究結(jié)果一致，這可能與E.coliTop10/pACLYC對果糖的利用效率有關(guān)。DU等[9]比較分別添加葡萄糖和果糖的大腸桿菌工程菌轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)果糖吸收代謝、丙酮酸分解代謝、三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循環(huán)和氧化磷酸化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄差異顯著(P<0.05)。MEP途徑需要消耗大量的NADPH和ATP，增強(qiáng)胞內(nèi)還原力和能量供給是提高異源萜類合成的關(guān)鍵[4]。果糖添加后提高TCA循環(huán)和磷酸戊糖途徑模塊基因表達(dá)，增加NADH和NADPH供給和加強(qiáng)MEP途徑的前體物3-磷酸甘油醛和丙酮酸的合成代謝。TCA循環(huán)中基因轉(zhuǎn)錄水平顯著變化也暗示細(xì)胞的NADH和NADPH還原力供給增加，為菌體生長和番茄紅素合成提供豐富的輔助因子和能量[10]。

確定果糖是大腸桿菌異源合成番茄紅素最佳碳源后，進(jìn)一步對果糖最適添加濃度進(jìn)行優(yōu)化。當(dāng)果糖質(zhì)量濃度為6 g/L時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量和得率最高，達(dá)到445.8 mg/L和23.35 mg/g，顯著高于其他濃度組(P<0.05)；隨著果糖濃度進(jìn)一步增加，番茄紅素合成趨勢顯著下降，當(dāng)果糖質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量和得率僅為119.1 mg/L和6.04 mg/g。研究表明果糖質(zhì)量濃度為6 g/L時(shí)，大腸桿菌生長達(dá)到穩(wěn)定，且番茄紅素產(chǎn)量最高，而過高濃度果糖對番茄紅素合成不利(圖2-b)。

a-碳源種類；b-果糖圖2 不同碳源對番茄紅素生產(chǎn)的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on lycopene production

2.2.2 無機(jī)氮源對番茄紅素生產(chǎn)的影響

氮源對微生物生長同樣不可或缺，用于細(xì)胞大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、核酸等)和含氮代謝物的合成，充足的氮源是實(shí)現(xiàn)高效合成的必要條件。MUSSAGY等[11]研究添加氮源對紅酵母CCT-2186生產(chǎn)類胡蘿卜素的影響，發(fā)現(xiàn)無機(jī)氮源NH4NO3的補(bǔ)給能進(jìn)一步促進(jìn)目標(biāo)代謝物胡蘿卜素合成和積累。本研究選取的4種無機(jī)氮源中，添加NH4Cl的番茄紅素產(chǎn)量和得率最高，達(dá)到562.4 mg/L和24.03 mg/g。添加檸檬氫二銨后番茄紅素產(chǎn)量和得率與空白LB培養(yǎng)基相比顯著下降(P<0.05)，可能是檸檬氫二銨會使發(fā)酵液的pH值顯著降低，在酸性條件下酶的催化活性顯著降低，抑制菌體生長和色素合成(圖3-a)。李一萌[12]選擇5種氮源對產(chǎn)番茄紅素工程菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)不同氮源對菌體生長和類胡蘿卜素合成存在顯著差異(P<0.05)，與本研究類似。

隨著NH4Cl濃度增加，番茄紅素產(chǎn)量和單位細(xì)胞得率隨之增加，在添加質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，番茄紅素產(chǎn)量和得率最高，達(dá)到537.4 mg/L和24.4 mg/g，顯著高于其他NH4Cl添加濃度(P<0.05)，表明NH4Cl質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)細(xì)胞活力旺盛，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，能夠使番茄紅素發(fā)酵體系發(fā)揮最大功效，而過高濃度NH4Cl對菌體番茄紅素合成有抑制作用，反而降低產(chǎn)量(圖3-b)。與只添加果糖相比，NH4Cl添加使番茄紅素產(chǎn)量和得率進(jìn)一步增加，表明添加NH4Cl后促進(jìn)大腸桿菌異源合成番茄紅素能力。

a-無機(jī)氮源種類；b-NH4Cl圖3 不同無機(jī)氮源對番茄紅素生產(chǎn)的影響Fig.3 Effect of different inorganic nitrogen sources on lycopene production

2.2.3 氧載體對番茄紅素生產(chǎn)的影響

發(fā)酵工程中添加氧載體后可以減少氣液傳遞阻力，提高氧傳質(zhì)效率[13]。任東雪等[14]采用添加氧載體的策略，選擇正己烷、正庚烷和正十二烷等氧載體，顯著提高前體L-谷氨酸轉(zhuǎn)化效率。因此本研究選用正己烷、正庚烷、正十二烷和正十六烷作為氧載體[15]，探討氧載體對番茄紅素生產(chǎn)影響。正十二烷發(fā)酵得到的番茄紅素產(chǎn)量和得率高于其他氧載體，分別為457.5 mg/L和26.18 mg/g；正己烷發(fā)酵的番茄紅素產(chǎn)量和得率卻顯著低于其他氧載體(P<0.05)，僅為80 mg/L和5.87 mg/g，可能是由于10%正己烷的添加抑制菌體生長，顯著影響番茄紅素前體的合成和能量供給，造成產(chǎn)量和得率明顯降低(圖4-a)。與對照不添加氧載體相比，選用正庚烷、正十二烷和正十六烷都能促進(jìn)番茄紅素積累。ZHANG等[16]發(fā)現(xiàn)正十二烷是富馬酸酶表達(dá)的最適氧載體，可以增加ATP濃度，改變能量代謝途徑，為富馬酸酶蛋白折疊提供充足的能量，與本研究結(jié)果相一致，選用正十二烷能更好促進(jìn)番茄紅素合成。

氧載體添加量對番茄紅素合成也有明顯差異，產(chǎn)量和得率隨正十二烷含量的增加先升高后降低，添加量10%時(shí)番茄紅素產(chǎn)量和得率達(dá)到最大值，且顯著高于其他氧載體(P<0.05)，達(dá)到512 mg/L和27.03 mg/g，說明氧載體正十二烷可提高番茄紅素產(chǎn)量，且相較于添加果糖和NH4Cl，番茄紅素得率最高(圖4-b)。

a-氧載體種類；b-正十二烷添加量圖4 不同氧載體對番茄紅素生產(chǎn)的影響Fig.4 Effect of different oxygen carriers on lycopene production

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素的條件

上述單因素試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)果糖、NH4Cl和氧載體對番茄紅素產(chǎn)量影響較為顯著，本研究在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)對其進(jìn)一步優(yōu)化(表2)。

利用Design Expert軟件對表2結(jié)果進(jìn)行方差分析及二次多項(xiàng)回歸擬合，得到大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素得率對果糖、NH4Cl和正十二烷的多元回歸方程為：

Y=84.29-14.76A-2.12B+3.08C+7.84AB+0.175 9AC-7.98BC-23.66A2-8.26B2-4.19C2

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

方差分析中的顯著性檢驗(yàn)可以判斷自變量對因變量的影響。果糖、NH4Cl和氧載體3個(gè)因素對響應(yīng)值都有極顯著影響(P<0.01)；其中交互項(xiàng)果糖和NH4Cl，NH4Cl和氧載體影響極顯著(P<0.01)，果糖和NH4Cl不顯著(P>0.05)；各因素的平方項(xiàng)對響應(yīng)值也具有極顯著影響(P<0.01)。3個(gè)因素對大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素得率的影響程度為：果糖添加量>正十二烷添加量>NH4Cl添加量。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis results of regression and variance of response surface experiment

如圖5所示，NH4Cl和正十二烷曲面斜度較為平緩，等高線圖接近圓形，說明交互作用不顯著(P>0.05)；果糖和NH4Cl、果糖和正十二烷的曲面均較為陡斜，其等高線圖偏橢圓形，表明交互作用顯著(P<0.05)，與方差分析結(jié)果一致。響應(yīng)面最高點(diǎn)在模型設(shè)計(jì)范圍之內(nèi)，說明此響應(yīng)面變量設(shè)計(jì)較好，可以用于后續(xù)分析。與傳統(tǒng)方法相比通過響應(yīng)面法建立模型，測試不同變量之間的整體關(guān)系，在多變量系統(tǒng)中能快速篩選關(guān)鍵因素。郭燕等[17]同樣采用單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件，使?jié)庀阈桶拙浦屑核嵋阴ズ投∷嵋阴サ暮糠謩e增加1.68倍和1.38倍。張博等[18]采用響應(yīng)面方法對腸桿菌MCYS-7生產(chǎn)L-半胱氨酸發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，使得搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量提高169%。

a-果糖與NH4Cl；b-果糖與正十二烷；c-NH4Cl與正十二烷圖5 各因素交互作用對大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素的影響Fig.5 Effect of the factors on lycopene production in E.coli

根據(jù)Design-Expert 10.0軟件分析得出最優(yōu)理論條件：果糖4.22 g/L、NH4Cl 0.89 g/L、正十二烷體積分?jǐn)?shù)15%，預(yù)測產(chǎn)量為29.25 mg/g。按此條件生產(chǎn)番茄紅素，實(shí)際產(chǎn)量達(dá)到29.3 mg/g，與預(yù)測值非常接近，說明模型能夠較好預(yù)測大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素的得率。與優(yōu)化前相比，優(yōu)化后的菌體和丙酮萃取液在顏色上明顯加深，表明優(yōu)化后的番茄紅素產(chǎn)量更高(圖6)。

a-離心菌體；b-發(fā)酵萃取液圖6 優(yōu)化前后的大腸桿菌菌體和萃取液Fig.6 Cells and acetone extract of E.coli before and after optimization注：左為優(yōu)化前，右為響應(yīng)面優(yōu)化后

2.4 優(yōu)化培養(yǎng)基對E.coli異源合成番茄紅素轉(zhuǎn)錄水平的影響

本研究通過q-PCR分析番茄紅素合成途徑和相關(guān)基因在培養(yǎng)基優(yōu)化前后的表達(dá)水平變化，結(jié)果表明優(yōu)化后IspG、IspD、IspF、idi和crtE的mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)(圖7)。大腸桿菌自身MEP途徑代謝流量很弱，相關(guān)中間代謝物積累較少[19]，基因表達(dá)量上調(diào)可促使更多的代謝通路流向番茄紅素前體DMAPP和IPP的合成。DMAPP和IPP積累后進(jìn)一步流向番茄紅素合成，與crtE、crtB和crtI基因密切相關(guān)，優(yōu)化后crtE的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)4.4倍，最終使番茄紅素合成顯著提高(P<0.05)。而部分基因(dxs和IspE)表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，可能是優(yōu)化后中間代謝物積累使MEP途徑產(chǎn)生反饋抑制[20]。異源生物合成模塊與內(nèi)源前體合成模塊之間的代謝通量平衡是提高目標(biāo)代謝物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素和有效方法。本試驗(yàn)優(yōu)化前后的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平差異也表明在異源合成過程中，調(diào)控前體和合成模塊中關(guān)鍵基因表達(dá)，能顯著促進(jìn)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的合成。

圖7 優(yōu)化培養(yǎng)基后大腸桿菌異源合成番茄紅素的基因的表達(dá)水平Fig.7 The transcription of E.coli heterologous synthesizing lycopene gene through the optimized medium

3 結(jié)論

本研究篩選出大腸桿菌Top10為最佳番茄紅素生產(chǎn)菌株，基于LB培養(yǎng)基，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法分析得出，果糖、NH4Cl和正十二烷對于番茄紅素的產(chǎn)量影響極顯著(P<0.01)。最佳培養(yǎng)基配比：LB培養(yǎng)基中添加4.22 g/L果糖、0.89 g/L NH4Cl和15%(體積分?jǐn)?shù))正十二烷。最優(yōu)條件下番茄紅素得率達(dá)到29.3 mg/g，相比優(yōu)化前提高了138%。本研究顯著提高番茄紅素異源合成效率，為大腸桿菌生產(chǎn)番茄紅素奠定基礎(chǔ)。