劉曉燕，張小月，阿卜杜喀依爾·阿卜杜艾尼，曲一鳴，閔海東，李學(xué)文*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052)2(圣元國際北京營養(yǎng)研究院，北京，101125)

新疆地區(qū)屬于干旱和半干旱型氣候區(qū)域，具有光照充足、晝夜溫差大的自然特點，因此釀酒葡萄長勢強、產(chǎn)量高、品質(zhì)好、含糖量高，但酸度較低[1]，而酸度作為葡萄酒感官品質(zhì)的重要組成部分，會對葡萄酒的風(fēng)味、味道、顏色和香氣等產(chǎn)生影響，葡萄酒中常見酸有酒石酸、蘋果酸、檸檬酸，以及發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乳酸、乙酸、琥珀酸[2]。增加葡萄酒酸度通常有化學(xué)增酸、離子交換法增酸和生物法增酸，其中生物增酸主要是利用產(chǎn)酸型非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵增加酸度[3-4]，混合發(fā)酵還對葡萄酒香氣的提升具有貢獻作用[5-6]，隨著非釀酒酵母逐漸被人們所接受，可將其應(yīng)用于葡萄酒的初期發(fā)酵和其他果酒的發(fā)酵來改善酒的風(fēng)味物質(zhì)組成，如增加甘油、總酸、揮發(fā)性酯類含量，降低乙酸含量，形成穩(wěn)定的吡喃花青素等，進而改善酒的整體品質(zhì)[7-9]。

根據(jù)國際葡萄與葡萄酒組織(Organisation Internationale de la vigne et du Vin, OIV)統(tǒng)計，2019年中國葡萄酒產(chǎn)量83萬t，產(chǎn)生廢棄酒泥約1.7～2.6萬t，酒泥富含酒石酸鹽、蛋白質(zhì)、多糖、多酚等物質(zhì)，化學(xué)需氧量非常高且具有很高的生物降解性，直接排放污染環(huán)境，也浪費生物資源[10]。酒泥陳釀是葡萄酒釀造工藝中一種新興技術(shù)，葡萄酒在發(fā)酵結(jié)束后與酒泥接觸一定時間，在酶作用下生成酵母自溶物[11]，其主要是由微生物(主要是酵母菌)以及少量的酒石酸和無機鹽組成的[12]，通過酒泥中的酵母細(xì)胞吸附毒枝菌素，減少了氧化的可能和香氣的損失[13]，同時改善葡萄酒的穩(wěn)定性[14]。適當(dāng)?shù)木颇嚓愥効梢栽黾悠咸丫频膱A潤度和結(jié)構(gòu)感[15-16]。酵母自溶是一個非常緩慢的過程，添加某些富含β-葡聚糖酶的專業(yè)酶制劑可以在一定程度上加速酵母的自溶，促進有益酵母多糖的釋放以縮短上市周期[17]，不同酵母菌發(fā)酵后獲得的酒泥所含有益物質(zhì)存在明顯差異，因此將混菌發(fā)酵與酒泥陳釀結(jié)合改善葡萄酒品質(zhì)與合理利用“廢棄物”具有一定的研究意義。

關(guān)于葡萄酒混菌發(fā)酵后酒泥陳釀中有機酸含量的研究相對較少，本試驗以實驗室自釀葡萄酒為原料，將其在混菌發(fā)酵后的酒泥上陳釀60 d，通過高效液相色譜法檢測葡萄酒中7種有機酸含量，分析添加非釀酒酵母混菌發(fā)酵后酒泥陳釀對干紅葡萄酒有機酸含量的影響，進而分析葡萄酒品質(zhì)差異，以期為葡萄酒品質(zhì)提升以及酵母、酒泥的選擇利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄原料：赤霞珠葡萄含糖量(以還原糖計) 251.00 g/L，可滴定酸含量(以酒石酸計)5.25 g/L，2020年9月采自新疆天山北麓產(chǎn)區(qū)冰湖酒莊。

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)MST、耐熱克魯維酵母(Kluyveromycesthermotolerans)CT10、布魯塞爾德克酵母(Dekkerabruxellensis)PL09、β-葡聚糖酶，上海鼎唐國際貿(mào)易有限公司；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)F33、酒酒球菌(Oenococcusoeni)，法國 Laffort公司。

酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸(色譜純，純度≥98%)，新疆寶信源柏生物技術(shù)有限公司；超純水實驗室自制；KH2PO4、磷酸(分析純)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LE204E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；UPHW-III-90T超純水機，四川優(yōu)普超純科技有限公司；SK8200B超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；LC-20AB高效液相色譜儀、SPD-M20A紫外檢測器、色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、自動進樣器、柱溫箱，日本島津；3H16RI智能高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 色譜條件

參照王燕等[18]的方法，略做修改。色譜柱：Athena C18-WP(120 A，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：含1%甲醇(體積分?jǐn)?shù))和0.02 mol/L KH2PO4溶液，磷酸調(diào)pH 2.8；等度洗脫；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL；λ=210 nm。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品L-酒石酸、丙酮酸、L-蘋果酸、L-乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸10 mg，用流動相溶解定容至10 mL，得到各標(biāo)準(zhǔn)品含量為1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按梯度稀釋為所需濃度，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 葡萄酒的釀造與處理

1.5.1 赤霞珠干紅葡萄酒的釀造與酒泥陳釀處理

赤霞珠釀酒葡萄去除雜質(zhì)，除梗破碎后入60 L不銹鋼桶(裝罐量約80%)，添加SO2(30 mg/L)，分別接入活化好的非釀酒酵母CT10、PL09，每隔5 h進行1次循環(huán)操作，48 h后分別接入活化好的釀酒酵母MST、F33，即CT10與MST(CM)順序接種，PL09與F33(PF)順序接種進行常溫(22～24 ℃)發(fā)酵，酒精發(fā)酵結(jié)束后接入乳酸菌啟動蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation, MLF)(18～20 ℃)，發(fā)酵結(jié)束后添加SO2(60 mg/L)終止發(fā)酵，去除皮渣，分別對葡萄酒進行體積比4∶1的酒泥陳釀，另設(shè)添加富含β-葡聚糖酶液(酶活力30 000 U/mL，添加量50 mL/t)處理組促進酒泥自溶，不添加酒泥為對照組，60 d后分離酒泥取樣分析。具體分組見表1。

表1 試驗處理Table 1 Test treatments

1.5.2 待測樣品處理

參照馬旭藝等[19]的方法，12 000 r/min、4 ℃冷凍離心15 min后超聲，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，用流動相稀釋后進樣分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理

通過Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，利用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，應(yīng)用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

以7種有機酸的混合標(biāo)準(zhǔn)液的6種不同濃度為x，在上述試驗條件下檢測分析得到相應(yīng)的峰面積y，做線性回歸處理后得到表2所示的線性方程，7種有機酸的相關(guān)系數(shù)為0.999 1～1.000 0，線性關(guān)系良好，以3倍性噪比計算樣品的檢出限為 0.171 6～2.835 5 mg/L。7種有機酸標(biāo)準(zhǔn)品及葡萄酒樣品中相應(yīng)酸的高效液相色譜圖見圖1。

2.2 方法回收率與精密度

由表3可知7種有機酸的平均回收率為95.82%～100.79%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.31%，準(zhǔn)確度與精密度滿足本試驗所需要求。

表2 七種有機酸標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程與檢出限Table 2 Regression equation and detection limit of 7 kinds of organic acid standard products

a-有機酸標(biāo)準(zhǔn)品；b-葡萄酒樣品1-酒石酸；2-丙酮酸；3-蘋果酸；4-乳酸；5-乙酸；6-檸檬酸；7-琥珀酸圖1 有機酸標(biāo)準(zhǔn)品和葡萄酒樣品有機酸高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of standards and organic acids in wine samples

表3 添加質(zhì)量濃度、回收率與精密度Table 3 Concentration, recovery rate and precision of the method

2.3 不同處理對赤霞珠干紅葡萄酒中有機酸含量的影響

2.3.1 混菌發(fā)酵對赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量的影響

如圖2所示，混菌發(fā)酵對酒樣中丙酮酸含量有積極作用，其中PF-1顯著高于MST-1，且PF-1即混菌發(fā)酵消耗了更多的蘋果酸，而產(chǎn)生了更多的乳酸，CM-1比MST-1增加12.66%，PF-1比F33-1增加16.07%(P<0.05)，混菌發(fā)酵比單一釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生了更多的乙酸(P<0.05)，其中CM-1酒石酸含量比MST-1增加11.17%(P<0.05)，整體而言，混菌發(fā)酵對赤霞珠干紅葡萄酒中有機酸總量有積極影響，CM-1比MST-1增加13.02%，PF-1比F33-1增加5.37%，由此也體現(xiàn)出增酸非釀酒酵母CT10增酸作用明顯，顯著高于其他處理組(P<0.05)。

圖2 混菌發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量Fig.2 Organic acid content of mixed fermentation Cabernet Sauvignon dry red wines注：不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3.2 混菌發(fā)酵后酒泥陳釀對赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量的影響

如圖3所示，經(jīng)酒泥陳釀后丙酮酸、檸檬酸、琥珀酸含量出現(xiàn)下降現(xiàn)象，其中PF-2琥珀酸含量比F33-2降低14.18%(P<0.05)，PF-2比F33-2乙酸含量高出32.43%，在酒泥陳釀過程中保持上升的有相對含量較高的乳酸和酒石酸，其中CM-2比MST-2的乳酸含量增加5.58%，PF-2比F33-2的乳酸含量增加19.18%，酒石酸含量增加7.06%(P<0.05)，酒泥陳釀后葡萄酒中7種有機酸總量有顯著性差異，其中PF-2總含量最高，比F33-2高出10.52%(P<0.05)，而CM-2與MST-2無顯著差異。

圖3 酵母酒泥陳釀赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量Fig.3 Organic acid content of Cabernet Sauvignon dry red wines aged in yeast mash

2.3.3 混菌發(fā)酵后酒泥陳釀結(jié)合β-葡聚糖酶處理對赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量的影響

如圖4所示，丙酮酸含量下降，最終F33-3含量最高；CM-3蘋果酸含量比MST-3下降了28.57%，檸檬酸含量降低23.40%，乙酸含量比MST-3高出14.81%，PF-3比F33-3高出32.47%，琥珀酸含量降低，其中F33-3含量最高，乳酸含量在陳釀后增加，CM-3比MST-3增加9.92%，PF-3比F33-3增加16.25%，同樣保持增加的有酒石酸，其中PF-3比F33-3增加4.66%(P<0.05)。添加β-葡聚糖酶的變化規(guī)律與酒泥陳釀相似，但差異更顯著，說明在β-葡聚糖酶的作用下，葡萄酒中有機酸的含量及構(gòu)成發(fā)生變化。

圖4 酵母酒泥結(jié)合β-葡聚糖酶處理赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量Fig.4 Organic acid content of Cabernet Sauvignon dry red wines treated by yeast mash combined with β-glucanase

2.3.4 各處理對赤霞珠干紅葡萄酒有機酸含量影響的比較

如表4所示，混菌發(fā)酵后不同酒泥陳釀結(jié)合β-葡聚糖酶處理對葡萄酒中酒石酸含量有顯著影響，檢測結(jié)果顯示其在7種有機酸中含量最高，約占總含量的38.59%～43.47%，樣品處理中酒石酸含量MST-3>MST-2>MST-1，而CM-1酒石酸含量顯著高于CM-2和CM-3，且CM-3>CM-2，酵母F33各處理組中酒石酸含量為F33-2>F33-3>F33-1，PF混菌酒泥陳釀處理則與之有相同規(guī)律，且顯著高于F33各處理，酒泥陳釀可以保留葡萄酒中更多的酒石酸，特別是添加β-葡聚糖酶處理?；炀l(fā)酵可提升丙酮酸含量，PF-1顯著高于F33-1，釀酒酵母酒泥陳釀后丙酮酸含量增加，F(xiàn)33-2、F33-3比F33-1顯著提升(P<0.05)。陳釀后蘋果酸含量出現(xiàn)下降。混菌發(fā)酵和酒泥陳釀均可產(chǎn)生更多的乳酸，MST-2、MST-3比MST-1提升5.90%、5.05%，MST與CT10混菌發(fā)酵與酒泥陳釀后乳酸含量可增加5.58%～12.66%，F(xiàn)33與PL09混菌發(fā)酵與酒泥陳釀后乳酸含量可增加16.07%～19.18%，由此可以看出混菌酒泥陳釀比單一釀酒酵母酒泥陳釀產(chǎn)生乳酸的效果更加顯著，β-葡聚糖酶的添加促進了這種現(xiàn)象。經(jīng)過混菌酒泥陳釀后酒樣乙酸含量下降，CM-2比CM-1下降15.47%，PF-2比PF-1下降6.33%(P<0.05)，說明酒泥陳釀能夠吸附葡萄酒中的醋酸菌，改善葡萄酒品質(zhì)；CM-1比MST-1檸檬酸含量高出28.57%，而PF-1與F33-1檸檬酸含量一致，這可能是CT10增酸所引起的現(xiàn)象，而通過酒泥陳釀和β-葡聚糖酶處理后，檸檬酸含量均有小幅提升，但CM處理出現(xiàn)下降現(xiàn)象且差異顯著(P<0.05)?；炀l(fā)酵降低了琥珀酸含量，CM-1比MST-1減少10.08%，PF-1比F33-1減少11.45%，經(jīng)β-葡聚糖酶處理后琥珀酸含量升高5.69%～23.84%，其中F33-3與F33-1提升23.84%差異顯著(P<0.05)?；炀l(fā)酵增加了有機酸總含量，CM-1比MST-1提升13.02%，PF-1比F33-1提升5.37%；酒泥陳釀處理中MST-2比MST-1增加6.73%，CM-2比MST-1總酸含量增加6.62%(P<0.05)，PF-2比PF-1增加4.73%，PF-2比F33-2增加10.52%，比F33-1增加12.53%(P<0.05)；酒泥陳釀結(jié)合β-葡聚糖酶處理中MST-3比MST-2、MST-1分別增加3.84%、10.31%，CM-3比MST-1總酸含量增加10.53%(P<0.05)，F(xiàn)33-3比F33-2、F33-1分別增加6.08%、8.19%，比PF-1增加7.67%，PF-3比F33-3增加4.84%，比F33-1增加12.63%(P<0.05)。

3 討論與結(jié)論

有機酸是葡萄酒結(jié)構(gòu)的重要組成部分，其中酒石酸是葡萄酒中呈酸澀味的特有有機酸[20]，在7種有機酸中含量最高，本研究結(jié)果顯示混菌發(fā)酵可提高酒石酸含量，在此基礎(chǔ)上進行酒泥陳釀、添加β-葡聚糖酶處理效果更加明顯，這是因為酒泥降解產(chǎn)生的多糖限制了葡萄酒中酒石酸的沉淀[21]，且酒石酸具有抗分解作用，很少受到葡萄酒微生物的攻擊，因此釀酒師在葡萄醪中添加較穩(wěn)定的酒石酸[22]。樣品中混菌發(fā)酵、釀酒酵母酒泥陳釀后可增加丙酮酸含量，研究發(fā)現(xiàn)，混合發(fā)酵能夠有效促進葡萄糖苷特定前體物丙酮酸、乙醛等產(chǎn)量的增加[23]，因此能夠提高穩(wěn)定色素的葡萄糖苷的合成[24]；而混菌發(fā)酵酒泥陳釀以及β-葡聚糖酶處理后丙酮酸含量減少，在葡萄酒老化過程中，丙酮酸的減少可能是由于形成了其他化合物。吡喃花青素色素在花青素結(jié)構(gòu)上顯示出一個額外的吡喃環(huán)，被鑒定為丙酮酸親核加成的結(jié)果[25]，而丙酮酸是乳酸菌代謝的產(chǎn)物，也可由蘋果酸和乳酸氧化產(chǎn)生[26]。蘋果酸在葡萄中以及酒精發(fā)酵結(jié)束時含量較多，而經(jīng)過MLF后含量逐漸減少，MLF是大多數(shù)葡萄酒生產(chǎn)中重要的二次發(fā)酵，通常由乳酸菌在酒精發(fā)酵完成之后進行，將尖銳的L-蘋果酸轉(zhuǎn)化為柔和的L-乳酸，通過乳酸菌殘留的營養(yǎng)物質(zhì)提高微生物的穩(wěn)定性，可促進葡萄酒在乳酸菌次級代謝中的感官調(diào)節(jié)[27]，樣品中混菌發(fā)酵、酒泥陳釀以及結(jié)合β-葡聚糖酶處理可以依次提升葡萄酒中乳酸含量，這種現(xiàn)象可以使葡萄酒的口感更加圓潤[20]。乙酸含量過高則會嚴(yán)重影響葡萄酒的品質(zhì)[28]，而檢測結(jié)果顯示混菌發(fā)酵和釀酒酵母酒泥陳釀均會引起乙酸的增加，前者可能是因為發(fā)酵初期非釀酒酵母發(fā)酵能力弱[29]所引起的，混菌酒泥陳釀與結(jié)合β-葡聚糖酶處理均使乙酸含量下降，說明酒泥自溶過程中吸附了對葡萄酒有消極影響的醋酸菌，能夠改善葡萄酒品質(zhì)。檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物[20]，可以溶解Fe3+形成可溶性絡(luò)合物，可防止葡萄酒的鐵破敗病，在酒精發(fā)酵過程會產(chǎn)生少量檸檬酸，MLF過程中乳酸菌則會消耗檸檬酸產(chǎn)生乙酸、乙偶姻和CO2等[30]。研究結(jié)果顯示，與增酸非釀酒酵母CT10混合發(fā)酵可提升檸檬酸含量，但其含量經(jīng)過酒泥陳釀后減少，而與增香非釀酒酵母PL09混合發(fā)酵則呈相反變化。琥珀酸是糖在葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，會使葡萄酒的味道有咸味、苦味和酸味[28]，試驗結(jié)果顯示酒泥陳釀以及結(jié)合β-葡聚糖酶處理后琥珀酸含量升高，且與增酸非釀酒酵母結(jié)合處理的效果更顯著，高水平的脈沖電場老化葡萄酒時使琥珀酸二乙酯水解，琥珀酸含量升高[22]，酒泥陳釀過程中可能也發(fā)生了這樣的反應(yīng)。酒泥陳釀處理中除CM處理外，其他各組經(jīng)酒泥陳釀后總酸含量均增加了2.25%～7.57%，添加β-葡聚糖酶的處理組增加更為明顯，增幅達(dá)到7.67%～10.31%。綜上，混菌發(fā)酵與酒泥陳釀有利于葡萄酒中總酸含量的提升，β-葡聚糖酶的添加使這種現(xiàn)象更加明顯，史紅梅等[11]發(fā)現(xiàn)貴人香葡萄酒經(jīng)酒泥陳釀后有機酸總量提升，與本研究結(jié)果相似。

此外，酒泥陳釀過程中酵母發(fā)生自溶現(xiàn)象，細(xì)胞膜破裂內(nèi)溶物被釋放產(chǎn)生核苷、核苷酸、氨基酸、肽、葡聚糖、甘露糖蛋白等，增加葡萄酒的結(jié)構(gòu)感和圓潤度，提高澄清度[12]；葡萄酒存在顏色褪色快的問題，史紅梅等[31]利用不同酵母酒泥陳釀提高了蛇龍珠葡萄酒的顏色指標(biāo)，增強顏色的穩(wěn)定性。葡萄酒中農(nóng)藥殘留問題是影響葡萄酒品質(zhì)和健康的一大因素，酒泥陳釀過程中吸附農(nóng)藥，大幅降低殘留量，改善葡萄酒的香氣物質(zhì)，李明月等[15]研究發(fā)現(xiàn)帶細(xì)酒泥陳釀對紅提葡萄酒風(fēng)味有一定的積極影響。MAZA等[16]發(fā)現(xiàn)酒泥陳釀可降低葡萄酒澀感、軟化單寧，從而達(dá)到修飾口感的作用。但是酒泥自溶速度較慢，陳釀工藝把控不好會出現(xiàn)葡萄酒感染雜菌、產(chǎn)生不愉快的酒糟味等問題，因此在加速酒泥自溶速度的研究中出現(xiàn)多種解決方法，例如超聲、脈沖電場、商業(yè)甘露糖蛋白代替等[16]，但都存在經(jīng)濟或?qū)嶋H條件限制的問題，還需進一步研究尋找較好的解決方法和符合實際的推廣技術(shù)。

本研究通過釀酒酵母MST、F33分別與增酸非釀酒酵母CT10、增香非釀酒酵母PL09混菌發(fā)酵后進行酒泥陳釀，并添加β-葡聚糖酶促進酒泥自溶，采用高效液相色譜法檢測樣品中7種有機酸含量，結(jié)果顯示混菌發(fā)酵與酒泥陳釀均對葡萄酒中有機酸含量有提升作用，其中酒石酸、乳酸、乙酸以及總酸的變化差異性較為顯著，與CT10混釀后酒泥陳釀在β-葡聚糖酶的作用下，會更有利于有機酸的保留與產(chǎn)生，與PL09混菌發(fā)酵后酒泥陳釀可以使有機酸生成的代謝活動加強，使其含量增加；釀酒酵母酒泥陳釀后，有機酸總量增加，與混菌發(fā)酵酒泥陳釀的差異性減小，說明酒泥陳釀可以使葡萄酒中的物質(zhì)發(fā)生變化，促進有機酸的產(chǎn)生，使葡萄酒口感平衡，達(dá)到增酸的目的，因此合理利用混菌發(fā)酵后的酒泥結(jié)合β-葡聚糖酶處理進行陳釀對葡萄酒有機酸的提升效果顯著，具有一定的應(yīng)用價值。