劉紅強，程坤，于學(xué)健，翟磊，鄭佳，姚粟*

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015) 2(宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓，644000)

濃香型白酒是我國三大基本香型之一，其“窖香濃郁、綿柔甘洌、香味協(xié)調(diào)”的風格特點深受廣大消費者喜愛，其消費總量占全國白酒的70%左右[1]。濃香型白酒通常以高粱、小麥、玉米等為主要原料，發(fā)酵過程中形成的大曲、窖泥和黃水等基質(zhì)為白酒發(fā)酵過程提供了豐富的微生物，主要以芽胞桿菌、乳酸菌、高溫放線菌等微生物為主[2-3]，微生物能夠為白酒發(fā)酵過程提供糖化發(fā)酵力，是白酒特征風味物質(zhì)的主要來源。近年來，隨著高通量測序技術(shù)和GC-MS技術(shù)的不斷發(fā)展，解析微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物，探究白酒風味與微生物之間的關(guān)系，對提高白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要的意義。

芽胞桿菌屬在白酒發(fā)酵過程中含量較多，且在自然界分布較廣，能夠分泌產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶等酶類物質(zhì)，較其他微生物具有耐酸、耐乙醇、耐高溫等優(yōu)點[4-7]。目前，芽胞桿菌的開發(fā)和應(yīng)用主要集中在枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌等菌株[8-10]，針對其他芽胞桿菌的功能性研究相對較少。前期，本實驗室從我國四川省宜賓地區(qū)濃香型白酒的黃水樣品中分離到1株新種菌株黃水芽胞桿菌Bacillusaquiflavi3H-10[11]，是我國四川省宜賓地區(qū)首株釀酒微生物新種菌株，對于揭示宜賓地區(qū)濃香型白酒發(fā)酵過程機制具有重要價值。

為探究B.aquiflavi3H-10在白酒發(fā)酵過程中的潛在功能特性，本研究基于第二代BGISEQ-500RS測序平臺對菌株進行高通量測序獲得基因組序列，預(yù)測其產(chǎn)酶基因及遺傳基礎(chǔ)，并測定菌株產(chǎn)生生物酶的能力、酶活力大小及發(fā)酵風味物質(zhì)，為明晰該菌株在白酒發(fā)酵過程中的作用機制及后續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

黃水芽胞桿菌B.aquiflavi3H-10，分離自我國四川省宜賓市五糧液濃香型白酒的黃水樣品，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)，保藏編號為CICC 24755。

1.1.2 試劑及耗材

福林酚，北京博奧拓達科技有限公司；三氯乙酸，天津市福晨化學(xué)試劑廠；酪蛋白，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

大豆酪蛋白瓊脂(tryptose soya agar,TSA)培養(yǎng)基、大豆酪蛋白液體(tryptose soya broth,TSB)培養(yǎng)基，碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。

蛋白酶培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO40.36、Na2HPO41.07、MgSO40.5、CaCl20.02、ZnCl20.14、NaCl 0.16、FeSO40.002、胰蛋白胨0.05、脫脂奶粉10、瓊脂20、pH 6.5，113 ℃滅菌15 min。

淀粉酶培養(yǎng)基(g/L)：糊精20、NaNO33.3、KCl 0.5、K3HPO41.0、FeSO40.01、MgSO45.0、瓊脂 20、pH 6.5，113 ℃滅菌15 min。

纖維素酶培養(yǎng)基(g/L)：羧甲基纖維素鈉5.0、酵母膏0.1、蛋白胨0.5、瓊脂20、pH 5.5～6.0，113 ℃ 滅菌15 min。

酯酶培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200、蔗糖20、三丁酸甘油酯4.0、瓊脂20.0、羅丹明B 0.2、pH 6.5，113 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

2000型分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；BHG—8082型恒溫培養(yǎng)箱、THZ-98C恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-3A水浴鍋，常州國華電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1B.aquiflavi3H-10發(fā)酵液制備

將B.aquiflavi3H-10凍干菌粉溶解后接種于TSA斜面培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h得到斜面種子。選取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)72 h得到發(fā)酵液，備用。

1.3.2B.aquiflavi3H-10全基因組測序及生物學(xué)分析

利用商業(yè)化細菌基因組DNA提取試劑盒(Bacterial DNA Kit，D3350)提取菌株的基因組DNA，利用MGIEasy通用DNA文庫制備試劑套裝構(gòu)建文庫，將質(zhì)控合格后的文庫按照BGISEQ-500RS高通量測序試劑套裝(PE100)的操作說明完成上機測序。對下機數(shù)據(jù)進行過濾質(zhì)控，去除質(zhì)量值連續(xù)≤20的堿基數(shù)達到40%的序列、含N堿基數(shù)目>2%的序列和含有接頭和重復(fù)序列污染的序列。過濾后的數(shù)據(jù)利用SPAdes v3.11.0軟件進行多個Kmer參數(shù)的拼接，得到最優(yōu)的組裝結(jié)果作為菌株的基因組序列。使用Prodigal v2.6.3軟件進行基因預(yù)測，獲得各基因的核酸序列與蛋白質(zhì)序列。將蛋白質(zhì)序列與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)[12]、NR(Non-Redundant Protein Sequence Database)[13]和CAZy(The Carbohydrate-Active Enzymes database)[14]數(shù)據(jù)庫進行比對，預(yù)測B.aquiflavi3H-10基因的功能。

1.3.3B.aquiflavi3H-10產(chǎn)生物酶能力分析

利用平板透明圈法對B.aquiflavi3H-10產(chǎn)生物酶的潛力進行初步分析。將滅菌后的濾紙片分別放置于蛋白酶培養(yǎng)基、淀粉酶培養(yǎng)基、纖維素酶培養(yǎng)基和酯酶培養(yǎng)基的平板表面，每個平板上均勻放置3個濾紙片。取1.3.1發(fā)酵液20 μL分別接種到濾紙片上，待菌液稍吹干后將平板倒置于37 ℃培養(yǎng)。72 h后取出平板，肉眼觀察蛋白酶培養(yǎng)基平板和酯酶培養(yǎng)基平板的濾紙片周圍有無透明圈出現(xiàn)。在淀粉酶培養(yǎng)基平板和纖維素酶培養(yǎng)基平板中分別倒入5 mL 0.02 mol/L碘液和5 mL 0.2%剛果紅溶液，使溶液均勻覆蓋于培養(yǎng)基表面，放置5～10 min后，觀察濾紙周圍有無透明圈。

1.3.4B.aquiflavi3H-10蛋白酶酶活性測定

將1.3.1中得到的發(fā)酵液12 000 r/min，4 ℃，離心5 min，收集上清液，根據(jù)GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》的福林酚法測定初始粗酶液的蛋白酶活力。將40 ℃下1 min水解酪蛋白產(chǎn)生l μg酪氨酸定義為1個蛋白酶活力單位。發(fā)酵液蛋白酶活力按公式(1)計算：

(1)

式中：A，由標準曲線得出的樣品最終稀釋液的活力，U/mL；V，溶解樣品所使用的容量瓶體積，mL；4，反應(yīng)試劑的總體積，mL；n，樣品稀釋的倍數(shù)；m，樣品的質(zhì)量，g；1/10，反應(yīng)時間10 min，以1 min計。

1.3.5B.aquiflavi3H-10發(fā)酵液風味物質(zhì)測定

取TSA斜面培養(yǎng)基上的單菌落，接種于TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)72 h得到發(fā)酵液。利用GC-MS[15]測定發(fā)酵液中的代謝風味產(chǎn)物，分析B.aquiflavi3H-10發(fā)酵產(chǎn)生的主體風味。使用未接種菌體的TSB液體培養(yǎng)基作為空白對照。

2 結(jié)果分析

2.1 B.aquiflavi 3H-10全基因組概況

利用BGISEQ-500RS高通量測序技術(shù)，并通過生物學(xué)軟件質(zhì)控、組裝等分析，獲得B.aquiflavi3H-10的全基因組序列，GenBank登錄號為JAAIWN000000000。組裝得到120條scaffold，基因組大小為3.62 Mb，G+C含量為35.40 mol%，預(yù)測3 224個蛋白質(zhì)編碼基因、79個tRNA基因、14個rRNA基因以及4個其他RNA基因，測序質(zhì)量良好。菌株B.aquiflavi3H-10基因組與其近緣物種基因組的一般特性相一致[16]，可以用于后續(xù)功能基因注釋分析。

2.2 B.aquiflavi 3H-10產(chǎn)蛋白酶相關(guān)基因分析

將B.aquiflavi3H-10基因的蛋白質(zhì)序列與KEGG數(shù)據(jù)庫和NR數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果顯示，共預(yù)測到22種編碼蛋白酶的相關(guān)基因(表1)。其中，包括1個編碼孢子蛋白酶YyaC的基因，產(chǎn)物具有裂解酸溶性小分子芽胞蛋白的功能[17]；1個受控膜內(nèi)蛋白水解(regulated intramembrane proteolysis，RIP)金屬蛋白酶RseP編碼基因和1個位點2蛋白酶家族蛋白，有研究報道，RseP在大腸桿菌中作為位點2蛋白酶的直系同源體，能夠切割跨膜序列、釋放跨膜蛋白信號[18]。此外，還包括與2個扁菱形家族膜內(nèi)絲氨酸蛋白酶、6個CAAX蛋白酶和細菌素處理蛋白(CAAX proteases and bacteriocin-processing protein，CPBP)家族膜內(nèi)金屬蛋白酶、2個鋅金屬蛋白酶、7個ATP依賴的LonB、HslV、Clp家族蛋白和2個蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)劑相關(guān)的編碼基因。這些豐富的蛋白酶編碼基因提示，菌株B.aquiflavi3H-10可能具有產(chǎn)生和分泌蛋白酶的潛力。

表1 B.aquiflavi 3H-10蛋白酶相關(guān)基因注釋結(jié)果Table 1 Annotation result of protease genes in strain B.aquiflavi 3H-10

2.3 B.aquiflavi 3H-10碳水化合物活性酶分析

碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes，CAZy)是微生物代謝的重要酶類，在代謝過程中主要發(fā)揮降解、修飾及生成糖苷鍵的功能。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的氨基酸序列相似性，可將CAZy劃分為糖苷水解酶類(glycoside hydrolases, GHs)、糖基轉(zhuǎn)移酶類(glycosyl transferases, GTs)、多糖裂解酶類(polysaccharide lyases, PLs)、糖水化合物酯酶類(carbohydrate esterases, CEs)、輔助模塊酶類(auxiliary activities, AAs)和碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(carbohydrate-binding modules, CBM)等蛋白質(zhì)家族，目前被收錄于CAZy數(shù)據(jù)庫中[14]。通過與CAZy數(shù)據(jù)庫比對，B.aquiflavi3H-10中共含有17個CAZy(圖1)。

圖1 B.aquiflavi 3H-10中不同類別的CAZy相關(guān)基因分布情況Fig.1 Distribution of genes related to CAZy in B.aquiflavi 3H-10

由圖1可以看到，CEs含量較高，所占比例為47.06%；其次依次為GHs、CBMs、GTs，所占比例分別為23.53%、17.65%和11.76%；不含有AAs和PLs。其中，CBMs可以促進酶與底物的結(jié)合，克服了水解酶類對不溶性多糖降解效率低的缺點[19]。這些酶類可為美拉德反應(yīng)提供重要的糖類小分子物質(zhì)，有助于酯類、纖維素和半纖維素等的酶促降解，因此推測B.aquiflavi3H-10在白酒發(fā)酵過程中對底物原料的降解發(fā)揮著重要作用。

2.4 B.aquiflavi 3H-10的產(chǎn)酶特性及酶活力

通過觀察平板上的透明圈發(fā)現(xiàn)，B.aquiflavi3H-10在蛋白酶培養(yǎng)基平板上可觀察到清晰的透明圈(圖2)，在淀粉酶培養(yǎng)基、纖維素酶培養(yǎng)基和酯酶培養(yǎng)基平板上無明顯的透明圈。由此可見，該菌株具有較強的產(chǎn)生蛋白酶的能力，與其基因組中檢測到多個蛋白酶編碼基因的結(jié)果一致。

a-蛋白酶活力；b-纖維素酶活力；c-淀粉酶活力；d-酯酶活力圖2 B.aquiflavi 3H-10酶活力平板測定結(jié)果Fig.2 Enzyme activity of B.aquiflavi 3H-10 on plates

按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中福林酚法，測定B.aquiflavi3H-10發(fā)酵液的蛋白酶活力為85 U/mL，高于已報道的部分芽胞桿菌(8.82～31.27 U/mL)的蛋白酶活力[20]。在發(fā)酵過程中，蛋白酶通過降解蛋白質(zhì)生成氨基酸等小分子物質(zhì)，可以促進其他微生物生長代謝，氨基酸與還原糖發(fā)生的褐變反應(yīng)為特征風味物質(zhì)提供重要的前體物質(zhì)?？紤]到B.aquiflavi3H-10基因組數(shù)量較多的蛋白酶編碼基因，推測通過優(yōu)化發(fā)酵條件，菌株產(chǎn)蛋白酶的能力可進一步提升。B.aquiflavi3H-10前期分離自濃香型白酒發(fā)酵過程中的黃水基質(zhì)[11]，其分泌的蛋白酶可以為發(fā)酵環(huán)境中的美拉德反應(yīng)提供重要的前體物質(zhì)，促進濃香型白酒發(fā)酵過程中特征風味的生成。

2.5 B.aquiflavi 3H-10的發(fā)酵風味物質(zhì)分析

按照1.3.5的方法，采用GC-MS測定B.aquiflavi3H-10發(fā)酵液中的代謝風味物質(zhì)，與空白對照培養(yǎng)基中的物質(zhì)比較，定性分析出B.aquiflavi3H-10的發(fā)酵代謝物及其產(chǎn)生風味物質(zhì)的貢獻率。結(jié)果顯示，B.aquiflavi3H-10發(fā)酵液中共檢測到56種代謝風味物質(zhì)，與空白對照相比，共有31種物質(zhì)的含量顯著提高，主要以醇類化合物、酯類化合物和酮類化合物為主，這些風味物質(zhì)與白酒中的呈香化合物基本一致[15,21]。其中，相對含量最高的5種成分依次是苯甲醛(杏仁香，堅果香)、2,5-二甲基吡嗪(炒芝麻香)、正丁醇(水果香)、3-甲基己醇和己酸乙酯。己酸乙酯是濃香型大曲酒的主體香味物質(zhì)[15]，也是葡萄酒中的重要香氣成分[22]，可賦予酒體甜香、水果香、窖香和青瓜香等味道。苯甲醛具有杏仁香和堅果香，已報道其對黃酒等傳統(tǒng)發(fā)酵酒類獨特風味的形成有重要貢獻[23]。2,5-二甲基吡嗪和正丁醇可分別使酒體呈現(xiàn)炒芝麻香和水果香[22,24]。除此之外，B.aquiflavi3H-10還可發(fā)酵產(chǎn)生異丁酸乙酯(花香，蘋果香，水蜜桃香，水果香)、2-丁酮(焦糖)和三甲基吡嗪(濃厚的堅果香氣)等風味物質(zhì)。由此可見，B.aquiflavi3H-10可發(fā)酵產(chǎn)生豐富的風味物質(zhì)，有助于濃香型白酒主體風味物質(zhì)的形成，并可賦予酒體多種獨特的風味。因此，B.aquiflavi3H-10對濃香型白酒發(fā)酵過程具有較大應(yīng)用潛力。

表2 B.aquiflavi 3H-10發(fā)酵液風味物質(zhì)檢測結(jié)果Table 2 Flavor compounds detected in the fermentation liquid of B.aquiflavi 3H-10

3 結(jié)論

本研究對我國四川省宜賓地區(qū)首株釀酒微生物新種黃水芽胞桿菌B.aquiflavi3H-10[11]進行全基因組測序，通過與數(shù)據(jù)庫比對分析潛在功能基因，并利用平板透明圈法、福林酚法和GC-MS技術(shù)研究其產(chǎn)生物酶特性、酶活力和發(fā)酵風味物質(zhì)?；蚍治鲲@示，菌株B.aquiflavi3H-10基因組中含有編碼22種蛋白酶和多種碳水化合物酶類的基因，具有產(chǎn)生蛋白酶和碳水化合物的潛力。試驗結(jié)果顯示，菌株B.aquiflavi3H-10在蛋白酶培養(yǎng)基平板上透明圈較明顯，蛋白酶酶活力可達85 U/mL，并可產(chǎn)生56種代謝風味化合物，包括酯類、醇類、芳香族、羰基化合物、雜環(huán)化合物等，其中，苯甲醛(杏仁香，堅果香)、2,5-二甲基吡嗪(炒芝麻香)、正丁醇(水果香)、3-甲基己醇和濃香型大曲酒的主體香味物質(zhì)的物質(zhì)己酸乙酯(甜香，水果香，窖香，青瓜香)等成分相對含量較高。研究表明，黃水芽胞桿菌B.aquiflavi3H-10具有顯著的產(chǎn)蛋白酶能力，發(fā)酵產(chǎn)生濃香型白酒具有的特征風味物質(zhì)，推測其在白酒發(fā)酵過程中具有潛在應(yīng)用價值。芽胞桿菌作為重要功能菌株，在白酒發(fā)酵過程具有較好的應(yīng)用潛力，后續(xù)有待進一步解析B.aquiflavi3H-10在安全性和抗逆性等方面的特性，為該菌株的大規(guī)模開發(fā)利用提供前期研究基礎(chǔ)。