孫紅，柴麗娟，方冠宇，陸震鳴，張曉娟，王松濤，沈才洪，史勁松，許正宏,*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)2(糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)3(江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)4(江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 無(wú)錫，214122)5(國(guó)家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州，646000)

泥窖生香發(fā)酵是我國(guó)濃香型白酒的獨(dú)特生產(chǎn)方式，窖泥在濃香型白酒中發(fā)揮著不可或缺的作用，測(cè)序技術(shù)顯示窖泥微生物群落主要由梭菌綱和產(chǎn)甲烷古菌組成[1-3]。梭菌屬(Clostridium)是梭菌綱中的一個(gè)優(yōu)勢(shì)屬，約占細(xì)菌總豐度的0.54%～4.42%[1,4-6]。與退化窖泥相比，正常和優(yōu)質(zhì)窖泥中梭菌的相對(duì)豐度明顯更高[4]，而且梭菌屬的相對(duì)豐度會(huì)隨著窖齡的增加而增加[6]。梭菌屬不僅是窖泥群落中的一個(gè)豐富類群，在濃香型白酒典型風(fēng)味物質(zhì)的形成中也發(fā)揮著重要作用[7]。目前已經(jīng)通過(guò)分離培養(yǎng)和高通量測(cè)序方法證明梭菌屬微生物是窖泥中短/中鏈脂肪酸合成的重要屬之一[2,8-10]。此外，高通量測(cè)序結(jié)果顯示，不同窖泥樣本中互營(yíng)細(xì)菌(包括互營(yíng)球菌、互營(yíng)單胞菌等)的豐度占總細(xì)菌的1.35%～7.64%[1,2,11]，互營(yíng)細(xì)菌能夠與其他微生物進(jìn)行互營(yíng)代謝，但其在白酒釀造體系中與其他微生物的互作報(bào)道較少。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品大多在開放環(huán)境中進(jìn)行生產(chǎn)，發(fā)酵過(guò)程中會(huì)形成復(fù)雜的微生物群落。微生物間相互作用方式有互利共生、偏利共生和競(jìng)爭(zhēng)等多種類型，微生物間的互作在驅(qū)動(dòng)微生物群落組裝[12]、維持群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[13]和調(diào)節(jié)群落代謝功能[14]方面起著至關(guān)重要的作用。到目前為止，關(guān)于窖泥微生物群相互作用關(guān)系的研究主要基于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析[4,15]。例如，通過(guò)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)梭菌綱(Clostridia)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、甲烷桿菌綱(Methanobacteria)和甲烷微菌綱(Methanomicrobia)之間存在大量顯著的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)[4,11,16]。然而，基于共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)等相關(guān)性分析方法研究的窖泥微生物群相互作用受到不同算法的影響[17]，潛在的互作關(guān)系需要通過(guò)其他方法進(jìn)一步驗(yàn)證。盡管目前已經(jīng)從窖泥中分離出許多產(chǎn)脂肪酸的梭菌屬微生物，但是關(guān)于梭菌屬與其他物種之間相互作用對(duì)脂肪酸代謝的影響鮮有研究，這限制了對(duì)窖泥微生物功能的全面理解[8,9,18-19]。

實(shí)驗(yàn)室前期從窖泥中分離篩選到1株互營(yíng)細(xì)菌，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析其屬于毛螺菌科(Lachnospiraceae)，命名為NovisyntrophococcusfermenticellaeJN500902T，與互營(yíng)球菌SyntrophococcussucromutansDSM 3224T具有最高的序列相似性(92.8%)[20]。在前期對(duì)窖泥梭菌分離篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，互營(yíng)球菌與部分梭菌共培養(yǎng)時(shí)存在顯著的協(xié)同效應(yīng)，當(dāng)前者存在時(shí)，這些梭菌菌株產(chǎn)丁酸、己酸等脂肪酸的能力可顯著提高。己酸和丁酸是濃香型白酒主體風(fēng)味物質(zhì)己酸乙酯和丁酸乙酯形成的重要前體物質(zhì)。因此，為進(jìn)一步探究梭菌和互營(yíng)球菌之間的互作規(guī)律，本研究以從窖泥中篩選出的1株互營(yíng)球菌和7株梭菌屬微生物為研究對(duì)象，結(jié)合比較基因組分析和共培養(yǎng)的方法，分析不同梭菌屬微生物的短鏈脂肪酸代謝途徑，以及與互營(yíng)球菌共培養(yǎng)對(duì)生長(zhǎng)和短鏈脂肪酸產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

互營(yíng)球菌NovisyntrophococcusfermenticellaeJN500902(N.902)、老窖梭菌ClostridiumfermenticellaeJN500901(C.901)、酪丁酸梭菌C.tyrobutyricumClt01、糞味梭菌C.scatologenesCls01、路氏梭菌C.luticellariiClu07、嗜酸梭菌C.aciditoleransClaci01、廣西梭菌C.guangxienseClgx01和拜式梭菌C.beijerinckiiClb01。以上菌株均分離自濃香型白酒窖泥，其中，N.902和C.901保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)，編號(hào)分別為CICC 24502T和CICC 24501T，其他菌株保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(RCM)(g/L)：蛋白胨10，酵母粉3，葡萄糖5，可溶性淀粉1，乙酸鈉3，半胱氨酸鹽酸鹽0.5，瓊脂粉20。添加1 mL/L(1.0 g/L)的刃天青作為厭氧指示劑。pH=6.28，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器

Whitley DG250厭氧箱，英國(guó)Don Whitley Scientific；Tecan Spark多模微孔板閱讀器，瑞士Tecan；S22型微量pH計(jì)，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；Waters e2695高效液相色譜，美國(guó)Waters公司。

1.1.4 主要試劑

RCM培養(yǎng)基原料，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸、丁酸和戊酸，Sigma-Aldrich公司；其他化學(xué)試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

基于7株菌的16S rRNA基因全長(zhǎng)序列，利用MEGA X軟件構(gòu)建進(jìn)化樹[21]。分析方法為鄰位相連法(neighbor-joining method)，模型選擇Kimura 2-parameter model，進(jìn)化樹的檢驗(yàn)方法為bootstrap method，設(shè)置重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000，其他參數(shù)使用默認(rèn)值[22]。

1.2.2 梭菌泛基因組分析

從NCBI上下載所研究梭菌物種的模式種或相似度最高的菌株基因組序列文件，基因組具體信息如表1所示。利用Prokka v1.14.6軟件預(yù)測(cè)梭菌基因組的開放閱讀框(open reading frame，ORF)[23]。使用eggNOG-Mapper對(duì)7個(gè)梭菌基因組的ORF進(jìn)行功能注釋，E-value設(shè)為1e-3[24]。采用PanGP軟件的冪律模型，擬合梭菌的基因組數(shù)量與泛基因組大小和核心基因組數(shù)量的曲線[25]。使用在線網(wǎng)站Venn diagrams(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)統(tǒng)計(jì)7株梭菌屬微生物的核心基因組和菌株特異性基因進(jìn)行可視化。根據(jù)KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注釋結(jié)果，統(tǒng)計(jì)梭菌屬微生物短鏈脂肪酸代謝通路中基因的數(shù)量差異，繪制代謝通路圖。

表1 模式菌株或代表菌株的基因組信息Table 1 Genomic information of type strains or representative strains

1.2.3 微生物共培養(yǎng)

種子液的制備：取出于-80 ℃冰箱中保藏的互營(yíng)球菌N.902和7株梭菌，連續(xù)培養(yǎng)傳代3次，經(jīng)劃線分離后獲得純菌株，用RCM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制備活力良好的種子液。

共培養(yǎng)：互營(yíng)球菌N.902和不同梭菌在裝有100 mL的250 mL三角瓶中進(jìn)行純培養(yǎng)和共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期活力良好的互營(yíng)球菌N.902和梭菌種子液，測(cè)量種子液的OD600值后，參考CHARUBIN等[26]的研究計(jì)算種子液的接種量，使得接種后純培養(yǎng)體系的理論初始OD600值為0.01，共培養(yǎng)體系理論初始OD600值為0.02。其中，共培養(yǎng)中互營(yíng)球菌和梭菌的接種量保持一致。所有培養(yǎng)都在厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，每隔6 h取樣測(cè)定菌株生長(zhǎng)和脂肪酸代謝情況。

1.2.4 微生物生長(zhǎng)的檢測(cè)

每隔6 h從上述純培養(yǎng)和共培養(yǎng)的三角瓶中吸取200 μL發(fā)酵液至96孔板中，采用Tecan Spark多模微孔板閱讀器測(cè)量OD600值的變化情況。

1.2.5 葡萄糖和pH值的檢測(cè)

取發(fā)酵過(guò)程菌液0.5 mL，經(jīng)適當(dāng)稀釋后離心(12 000 r/min，5 min)獲得上清液，過(guò)濾膜除雜后，使用生物傳感儀測(cè)量上清液中葡萄糖含量。另取1 mL發(fā)酵液用微量pH計(jì)測(cè)定pH值。

1.2.6 短鏈脂肪酸的檢測(cè)

使用色譜柱為Sapphire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)測(cè)定短鏈脂肪酸；流動(dòng)相：1 mL/min 70% NaH2PO4和30%的乙腈，用磷酸調(diào)節(jié)pH=2.7；進(jìn)樣量為10 μL；流速為1 mL/min；柱溫為40 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為210 nm；每個(gè)樣本的運(yùn)行程序?yàn)?0 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理與可視化

采用在線網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn)繪制花瓣圖，Graphpad Prism 8軟件繪制熱圖，Adobe Illustrator軟件繪制短鏈脂肪酸代謝通路。采用OriginPro 2021軟件對(duì)純培養(yǎng)和共培養(yǎng)的OD600、pH和葡萄糖變化進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與繪圖。所有圖片的組合使用Adobe Illustrator軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育樹和泛基因組分析

將互營(yíng)球菌N.902和7株梭菌的16S rRNA基因全長(zhǎng)序列在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast，互營(yíng)球菌N.902和老窖梭菌C.901為實(shí)驗(yàn)室前期從窖泥中篩選出的新種，全基因組測(cè)序結(jié)果已經(jīng)提交至GenBank，其比對(duì)結(jié)果相似度都為100%。另外6株細(xì)菌與數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast結(jié)果也都在97%以上，符合種水平序列相似度標(biāo)準(zhǔn)，具體的比對(duì)結(jié)果如表2所示。

表2 不同菌株的16S rRNA比對(duì)結(jié)果Table 2 Alignment results of different strains based on 16S rRNA gene sequences

以大腸桿菌EscherichiacoliATCC 11775T為外群構(gòu)建最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明互營(yíng)球菌N.902單獨(dú)聚為一簇，梭菌屬微生物分成兩大支，嗜酸梭菌Claci01、糞味Cls01、老窖梭菌C.901、酪丁酸梭菌Clt01和路氏梭菌Clu07聚為一大支，拜式梭菌Clb01和廣西梭菌Clgx01進(jìn)化距離較近，兩者單獨(dú)聚為一簇(圖1-a)。

a-基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹；b-7株梭菌的泛基因組積累曲線圖1 系統(tǒng)進(jìn)化分析和泛基因組分析Fig.1 Phylogenetic analysis and pan-genome analysis

梭菌屬微生物是濃香型白酒中重要的產(chǎn)香功能菌群，為了進(jìn)一步研究窖泥中梭菌屬微生物的生理和代謝差異，我們從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了7株梭菌屬細(xì)菌的全基因組進(jìn)行比較分析。如圖1-b所示，泛基因組積累曲線表明梭菌屬的核心基因組隨著基因組數(shù)目的增多逐漸減小，而泛基因組呈現(xiàn)線性增加的趨勢(shì)，由此可以推斷梭菌具有開放型的泛基因組。這一結(jié)果與對(duì)其他梭菌屬成員的研究一致，如C.butyricum[27]和C.beijerinckii[28]等，但是值得注意的是，泛基因組積累曲線受到分析的基因組數(shù)量的限制[29]。梭菌屬微生物基因組的異質(zhì)性，可能會(huì)影響互營(yíng)球菌與不同梭菌的互作類型。

2.2 梭菌屬微生物基因組的KEGG功能注釋

泛基因組結(jié)果表明，7株梭菌的核心基因組由1 029個(gè)基因家族組成，占泛基因組的34%左右。特有基因由604個(gè)基因家族組成，占泛基因組的20%左右(圖2-a)。對(duì)核心基因組進(jìn)行功能注釋，可以注釋到細(xì)胞過(guò)程(cellular processes)、環(huán)境信息處理(environmental information processing)、基因信息處理(genetic information processing)、代謝(metabolism)和有機(jī)體系統(tǒng)(organismal systems)5個(gè)大類。其中，注釋到代謝大類的基因數(shù)量最多，老窖梭菌C.901、嗜酸梭菌Claci01、拜式梭菌Clb01、廣西梭菌Clgx01、路氏梭菌Clu07、糞味梭菌Cls01和酪丁酸梭菌Clt01分別注釋到445、528、651、672、588、590、702和581個(gè)(圖2-b)。7株梭菌都含有特異基因，其中拜式梭菌Clb01的特有基因最多，含有180個(gè)，其次為嗜酸梭菌Claci01(125個(gè))、廣西梭菌Clgx01(104個(gè))、糞味梭菌Cls01(89個(gè))、路氏梭菌Clu07(68個(gè))、酪丁酸梭菌Clt01(28個(gè))和老窖梭菌C.901(10個(gè))。拜式梭菌Clb01中的特異基因主要集中在碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)和能量代謝(energy metabolism)方面，分別有32和23個(gè)。老窖梭菌C.901注釋到的特異基因最少，均勻分布在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、脂質(zhì)代謝(lipid metabolism)和輔因子與維生素代謝(metabolism of cofactors and vitamins)等方面。其余梭菌的特異基因則主要分布在碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)方面(圖2-c)。上述注釋結(jié)果表明，梭菌屬微生物在代謝方面可能存在一定的種間差異。

a-核心基因組與特異基因；b-核心基因組功能注釋；c-特異基因功能注釋圖2 梭菌屬細(xì)菌基因組的功能注釋Fig.2 Functional annotation of Clostridium strains’ genomes

2.3 梭菌短鏈脂肪酸代謝通路分析

前期研究表明厭氧微生物可以通過(guò)反向β-氧化途徑利用乙酸進(jìn)行碳鏈延長(zhǎng)，乳酸和乙醇是有效電子供體[30]。在濃香白酒的發(fā)酵體系中，存在糖、乙酸、乳酸和乙醇等多種底物[10]。KEGG代謝通路結(jié)果顯示，這7株從窖泥中篩選出的梭菌屬細(xì)菌都存在與葡萄糖、乙酸、乳酸和乙醇利用相關(guān)的基因，但是短鏈脂肪酸的代謝途徑存在差異(圖3)。

圖3 七株梭菌屬微生物的短鏈脂肪酸代謝通路Fig.3 Metabolic pathways of short-chain fatty acids in seven strains of the genus Clostridium

7株梭菌屬細(xì)菌的基因組中都存在較完整的丁酸和己酸產(chǎn)生相關(guān)的基因，但是路氏梭菌Clu07和酪丁酸梭菌Clt01中未注釋到編碼丁酰磷酸轉(zhuǎn)移酶(phosphate butyryltransferase，EC:2.3.1.19)和丁酸激酶(butyrate kinase，EC:2.7.2.7)相關(guān)的基因(buk途徑)，僅存在but途徑產(chǎn)生丁酸。這和CHAI等[8]通過(guò)克隆文庫(kù)對(duì)窖泥中產(chǎn)丁酸梭菌的研究結(jié)果一致，窖泥中梭菌屬的產(chǎn)丁酸途徑具有種間特異性。此外，全基因組的注釋結(jié)果顯示互營(yíng)球菌N.902可以通過(guò)丙酮酸氧化途徑、Wood-Ljungdahl乙?；緩疆a(chǎn)乙酸、乙醇等代謝物，但不具備逆β-氧化途徑，無(wú)法進(jìn)行碳鏈的進(jìn)一步延伸(圖4)。

圖4 互營(yíng)球菌基因組中的產(chǎn)乙酸代謝途徑Fig.4 Metabolic pathway of acetic acid production in the genome of N.902

這和下文中N.902純培養(yǎng)中主要檢測(cè)到乙酸，檢測(cè)不到2C以上的羧酸的結(jié)果一致。基因組的注釋結(jié)果中互營(yíng)球菌N.902和梭菌的代謝途徑存在一定互補(bǔ)，N.902產(chǎn)生的乙酸、乙醇等是梭菌碳鏈延伸途徑中的底物。7株梭菌都具有編碼乙酰CoA(acetyl-CoA)生成丙二酰CoA(malonyl-CoA)，進(jìn)一步生成丙酰CoA(propionyl-CoA)的相關(guān)基因。丙酰CoA作為重要的前體物質(zhì)，可以進(jìn)一步代謝生成丙酸、戊酸等奇數(shù)鏈脂肪酸。除上述途徑外，嗜酸梭菌Claci01、路氏梭菌Clu07和糞味梭菌Cls01也可以利用葡萄糖產(chǎn)生甘油磷酸(glycerone phosphate)，然后代謝產(chǎn)生丙酰CoA進(jìn)入逆β-氧化途徑。綜合基因組注釋結(jié)果來(lái)看，互營(yíng)球菌N.902和梭菌都可以利用葡萄糖產(chǎn)生短鏈脂肪酸，這可能導(dǎo)致共培養(yǎng)中互營(yíng)球菌和梭菌對(duì)葡萄糖的競(jìng)爭(zhēng)，進(jìn)而影響短鏈脂肪酸的產(chǎn)生。

2.4 互營(yíng)球菌和梭菌純培養(yǎng)和共培養(yǎng)中的生長(zhǎng)代謝差異

窖泥中的微生物不是獨(dú)立存在的，它們之間會(huì)發(fā)生復(fù)雜的交互作用。實(shí)驗(yàn)室前期在分離篩選窖泥微生物時(shí)發(fā)現(xiàn)互營(yíng)球菌N.902具有促進(jìn)梭菌屬微生物短鏈脂肪酸產(chǎn)生的潛力[20]。為了進(jìn)一步研究互營(yíng)球菌N.902和梭菌之間的交互作用，我們將互營(yíng)球菌N.902與7株梭菌屬微生物進(jìn)行共培養(yǎng)。如圖5所示，互營(yíng)球菌N.902和7株梭菌共培養(yǎng)中的生長(zhǎng)、葡萄糖代謝和pH的變化存在較大差異。

a-N.902和C.901共培養(yǎng)；b-N.902和Claci01共培養(yǎng)；c-N.902和Clb01共培養(yǎng)；d-N.902和Clgx01共培養(yǎng)；e-N.902和Clu07共培養(yǎng)；f-N.902和Cls01共培養(yǎng)；g-N.902和Clt01共培養(yǎng)圖5 互營(yíng)球菌和梭菌純培養(yǎng)和共培養(yǎng)中的生長(zhǎng)代謝差異Fig.5 Differences in growth and metabolism of N.902 and Clostridium in mono- and co-culture

互營(yíng)球菌N.902和老窖梭菌C.901共培養(yǎng)顯著促進(jìn)生長(zhǎng)，生長(zhǎng)延滯期縮短，OD值的最大變化速率也高于純培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)共培養(yǎng)的OD值(0.80)高于C.901(0.39)和N.902(0.39)純培養(yǎng)的OD值之和。共培養(yǎng)促進(jìn)了葡萄糖的消耗，48 h利用了3.38 g/L。此外，共培養(yǎng)48 h后pH值為5.58，介于C.901(7.09)和N.902(4.95)之間(圖5-a)?；I(yíng)球菌N.902和嗜酸梭菌Claci01共培養(yǎng)對(duì)生長(zhǎng)、葡萄糖的消耗及pH的影響不大，但是共培養(yǎng)OD值的最大變化速率高于Claci01純培養(yǎng)。這可能和Claci01的生長(zhǎng)速度快，在共培養(yǎng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位有關(guān)(圖5-b)?；I(yíng)球菌N.902和拜式梭菌Clb01共培養(yǎng)前期(12 h之前)對(duì)生長(zhǎng)有一定的抑制作用，但是12 h之后隨著N.902在共培養(yǎng)中逐漸開始生長(zhǎng)，共培養(yǎng)的OD值開始超過(guò)Clb01純培養(yǎng)。發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，純培養(yǎng)和共培養(yǎng)的OD值都為1.0左右，但生長(zhǎng)的最大變化速率遠(yuǎn)高于Clb01純培養(yǎng)，此外，共培養(yǎng)的葡萄糖消耗量也更高(圖5-c)?；I(yíng)球菌N.902和廣西梭菌Clgx01共培養(yǎng)的延滯期比Clgx01純培養(yǎng)提前6 h，發(fā)酵結(jié)束時(shí)共培養(yǎng)(1.1)中OD值高于純培養(yǎng)(0.9)。此外，共培養(yǎng)的葡萄糖最大消耗速率和pH最大變化速率出現(xiàn)時(shí)間比Clgx01純培養(yǎng)更早(圖5-d)。

互營(yíng)球菌N.902和路氏梭菌Clu07共培養(yǎng)顯著促進(jìn)了生長(zhǎng)，48 h時(shí)OD值為0.7左右，遠(yuǎn)高于純培養(yǎng)。共培養(yǎng)中葡萄糖的消耗量最高，發(fā)酵至42 h左右就已耗盡。Clu07純培養(yǎng)中pH逐漸上升，在42 h左右達(dá)到最高點(diǎn)6.4左右，而N.902和共培養(yǎng)的pH均呈下降趨勢(shì)，這可能是由于共培養(yǎng)中N.902大量產(chǎn)酸所致(圖5-e)?；I(yíng)球菌N.902和糞味梭菌Cls01共培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線和葡萄糖消耗曲線與Cls01純培養(yǎng)基本一致。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，Cls01的pH維持在5.5左右，共培養(yǎng)的pH低至5.2左右(圖5-f)?；I(yíng)球菌N.902和酪丁酸梭菌Clt01共培養(yǎng)生長(zhǎng)延滯期縮短至6 h，但是最大生長(zhǎng)速率低于純培養(yǎng)。N.902，Clt01和共培養(yǎng)三者的pH都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，分別在發(fā)酵結(jié)束達(dá)到4.7、5.0和5.2左右(圖5-g)。綜上，N.902和不同梭菌共培養(yǎng)對(duì)生長(zhǎng)產(chǎn)生不同的影響，這可能和多種因素有關(guān)。YAO等[31]研究表明不同葡萄糖濃度下，C.bovifaecis的代謝流會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)一步影響生長(zhǎng)。共培養(yǎng)中兩株菌對(duì)葡萄糖的競(jìng)爭(zhēng)性利用可能會(huì)改變代謝流。除此之外，微生物代謝產(chǎn)生的酸類也會(huì)改變環(huán)境pH造成菌株的生長(zhǎng)壓力[32]。

2.5 互營(yíng)球菌和梭菌純培養(yǎng)和共培養(yǎng)中的短鏈脂肪酸代謝差異

進(jìn)一步研究了互營(yíng)球菌N.902和不同梭菌互作對(duì)短鏈脂肪酸積累的影響。除嗜酸梭菌Claci01外，6株梭菌都可以產(chǎn)生丁酸，只有老窖梭菌C.901中檢測(cè)到己酸存在(表3)。此外，嗜酸梭菌Claci01、路氏梭菌Clu07和糞味梭菌Cls01中都檢測(cè)到奇數(shù)碳戊酸的積累，這和基因組的注釋結(jié)果一致，它們都具備利用葡萄糖代謝產(chǎn)生的甘油醛三磷酸途徑生成丙酰CoA的能力，丙酰CoA可以進(jìn)入逆β-氧化途徑產(chǎn)生奇數(shù)碳脂肪酸。比較純培養(yǎng)和共培養(yǎng)中短鏈脂肪酸的代謝差異，結(jié)果表明互營(yíng)球菌N.902與老窖梭菌C.901、路氏梭菌Clu07和糞味梭菌Cls01共培養(yǎng)能夠促進(jìn)中短鏈脂肪酸的積累。互營(yíng)球菌N.902與老窖梭菌C.901共培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基中乙酸的利用減少，但是丁酸和己酸的積累量分別增加0.44倍和0.63倍左右；互營(yíng)球菌N.902與路氏梭菌Clu07共培養(yǎng)后，丁酸和戊酸的產(chǎn)量分別增加了0.77倍和2.63倍；互營(yíng)球菌N.902和糞味梭菌Cls01共培養(yǎng)丁酸的產(chǎn)量變化不大，但戊酸的積累量略有增加0.12倍。互營(yíng)球菌N.902的主要代謝產(chǎn)物是乙酸和乙醇，前期的研究表明乙醇和乙酸可以作為逆β-氧化途徑的底物，因此共培養(yǎng)中的代謝物的交叉喂養(yǎng)可能是促進(jìn)短鏈脂肪酸積累的原因之一[29]。共培養(yǎng)也會(huì)對(duì)短鏈脂肪酸的積累產(chǎn)生負(fù)作用，互營(yíng)球菌N.902和嗜酸梭菌Claci01共培養(yǎng)中戊酸的積累量比純培養(yǎng)中降低0.63倍左右?；I(yíng)球菌N.902和3株主要產(chǎn)丁酸的拜式梭菌Clb01、廣西梭菌Clgx01和酪丁酸梭菌Clt01共培養(yǎng)中丁酸的積累量都發(fā)生不同程度的下調(diào)?；I(yíng)球菌N.902與梭菌共培養(yǎng)對(duì)丁酸代謝影響不一致可能與生長(zhǎng)、碳源的利用、葡萄糖的消耗及中間代謝物等多種因素有關(guān)[33-34]。

表3 互營(yíng)球菌和梭菌純培養(yǎng)和共培養(yǎng)中短鏈脂肪酸代謝差異Table 3 Difference of short-chain fatty acid metabolism between mono-and co-culture of N.902 and Clostridium

3 結(jié)論

本研究通過(guò)比較基因組和培養(yǎng)的方法，證明了窖泥中不同梭菌屬微生物產(chǎn)短鏈脂肪酸的多樣性。通過(guò)兩兩菌株共培養(yǎng)體系表明，窖泥中的互營(yíng)球菌和不同梭菌屬微生物之間存在正、負(fù)相互作用(圖6)。N.902與老窖梭菌C.901或路氏梭菌Clu07共培養(yǎng)對(duì)生長(zhǎng)和短鏈脂肪酸的代謝都表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用。N.902與Cls01共培養(yǎng)僅對(duì)單一短鏈脂肪酸的積累有促進(jìn)作用。N.902與嗜酸梭菌Claci01、拜式梭菌Clb01、廣西梭菌Clgx01或酪丁酸梭菌Clt01共培養(yǎng)時(shí)對(duì)生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)出多樣化，但都對(duì)短鏈脂肪酸的積累產(chǎn)生抑制作用。本研究加深了對(duì)窖泥中梭菌屬功能多樣性的理解，對(duì)互營(yíng)球菌和梭菌互作關(guān)系的研究拓寬了對(duì)窖泥微生物群落復(fù)雜互作網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。

圖6 互營(yíng)球菌和不同梭菌的交互作用類型Fig.6 Types of interaction between N.902 and different Clostridium species