李子財(cái)，李林，李光洲，王建清，辛維崗，張棋麟，王峰，林連兵*

1(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650500)2(云南省高校飼用抗生素替代技術(shù)工程研究中心，云南 昆明，650500)3(玉溪嘉和生物技術(shù)有限公司，云南 玉溪，653100)

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)普遍存在于人和動(dòng)物腸道中，是一種對(duì)宿主有益的共生菌[1]，它可以通過代謝產(chǎn)生有機(jī)酸、雙乙酰、H2O2、細(xì)菌素及類細(xì)菌素等物質(zhì)[2-4]，是一種具有較高生物開發(fā)價(jià)值的乳酸菌。目前羅伊氏乳桿菌被廣泛應(yīng)用于食品[5]、飼料[6]、抗菌劑[7]、新型材料前體[8-9]等領(lǐng)域，如瑞典BioGaia公司開發(fā)的一系列L.reuteri益生菌制劑，在全世界范圍內(nèi)銷售，用于改善人和動(dòng)物的健康水平；我國也于2003年批準(zhǔn)其可用于保健食品、食品和嬰幼兒食品等領(lǐng)域。由于羅伊氏乳桿菌自身特殊的生長特性，難以達(dá)到高密度發(fā)酵培養(yǎng)，導(dǎo)致其生產(chǎn)成本較高[10]，如何提高羅伊氏乳桿菌的發(fā)酵效率成為亟待解決的問題。

在傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)模式中，多數(shù)通過調(diào)控優(yōu)化培養(yǎng)過程中的pH、溶氧、溫度和培養(yǎng)基組分等參數(shù)來提高菌株發(fā)酵的密度[11]，但受限于培養(yǎng)過程中菌株發(fā)酵產(chǎn)物的不斷累積，導(dǎo)致菌株生長受到抑制或者死亡[12]。灌流培養(yǎng)技術(shù)是利用中空纖維柱截流系統(tǒng)使得菌株產(chǎn)生的代謝物能夠持續(xù)不斷的排出，同時(shí)蠕動(dòng)泵持續(xù)的補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基的置換以減輕乳酸和銨根離子等代謝產(chǎn)物對(duì)菌株生長的負(fù)面影響，并維持菌株的持續(xù)生長代謝。該技術(shù)具有生產(chǎn)成本低、培養(yǎng)時(shí)間短、產(chǎn)量和活性高等特點(diǎn)[13-15]。

近年來，灌流培養(yǎng)和灌流濃縮培養(yǎng)技術(shù)不斷完善，已廣泛應(yīng)用于哺乳細(xì)胞的高密度培養(yǎng)，在較小規(guī)模培養(yǎng)下能實(shí)現(xiàn)較高的產(chǎn)量，例如，原來產(chǎn)品規(guī)模需要2 000 L，如選擇灌流工藝可能只需要200 L就能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)[16]。目前國內(nèi)已有藥明生物、嘉和生物、復(fù)宏漢霖等公司將該工藝應(yīng)用于細(xì)胞的發(fā)酵生產(chǎn)，該工藝發(fā)展應(yīng)用前景廣闊[17]。

有關(guān)羅伊氏乳桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)的研究較少，潘海博等[18]以批培養(yǎng)的方式對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，活菌數(shù)達(dá)9.33×1010CFU/mL；王超[19]對(duì)培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，活菌數(shù)達(dá)4.4×1010CFU/mL，菌體干重(cell dry weight,CDW)13.7 g/L；KRAUTER等[20]用批補(bǔ)料培養(yǎng)的方式使得產(chǎn)量比批培養(yǎng)增加了1倍。目前灌流濃縮培養(yǎng)技術(shù)還未被引入到羅伊氏乳桿菌等相關(guān)益生菌的發(fā)酵培養(yǎng)。本文擬以羅伊氏乳桿菌DSM 17938為發(fā)酵菌株，比較批培養(yǎng)、批補(bǔ)料培養(yǎng)和灌流濃縮培養(yǎng)對(duì)羅伊氏乳桿菌發(fā)酵生物量的影響，探索羅伊氏乳桿菌高密度發(fā)酵技術(shù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)DSM 17938，昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院噬菌體與腸道微生物課題組保存。

1.1.2 試劑

D(+)-無水葡萄糖、胰蛋白胨(casein tryptone，CT)、牛肉浸粉(beef extract powder，BED)、酵母浸粉(yeast extract fermentation，YEF)、Tween-80、消泡劑、瓊脂粉等，北京索萊寶科技有限公司；C2H3NaO2、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、K2HPO4、NH2HPO4、NaOH，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖測定試劑盒，生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EL3002型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；ZHJH-C1115B型超凈工作臺(tái)，上海智誠分析儀器制造有限公司；DNP-9082BS型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；pHS-25數(shù)顯pH計(jì)，上海精密儀器有限公司；6500美國wisdom酶標(biāo)儀，美國WAS公司；BLB10-20SJ自動(dòng)發(fā)酵罐，上海百侖生物科技有限公司；BT600-2 J精密蠕動(dòng)泵，保定蘭格恒流泵有限公司；WA94510INV41LL型中空纖維柱，德國賽多利斯公司；Minispin小型高速離心機(jī)，上海心亮實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱中取1支凍存的羅伊氏乳桿菌甘油菌，用接種環(huán)挑取少量菌液于MRS固體培養(yǎng)基中劃線，將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，挑取單菌落，接種于2 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在恒溫37 ℃搖床中活化培養(yǎng)24 h，按5%接種量將活化后的菌液接種于搖瓶中，在恒溫37 ℃搖床中擴(kuò)大培養(yǎng)12 h，用于上罐培養(yǎng)的種子液。

1.3.2 發(fā)酵液活細(xì)胞計(jì)數(shù)

每2 h取樣1次，將發(fā)酵的菌液搖勻后，取100 μL供試菌液于900 μL PBS緩沖液中，梯度稀釋后取100 μL稀釋液涂于MRS固體培養(yǎng)基上(3個(gè)平行樣)，放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，選擇菌數(shù)為30～300的菌落平板計(jì)數(shù)，取平均值[21]。

1.3.3 菌體質(zhì)量濃度的測定

取25 mL發(fā)酵液在12 000 r/min下離心10 min，棄上清液，PBS緩沖液懸浮洗滌3次，60 ℃烘干至恒重，稱量計(jì)算菌體干重(g/L)。

1.3.4 發(fā)酵液中葡萄糖含量的測定

利用葡萄糖檢測試劑盒(GOD-POD比色法)測定發(fā)酵液中的葡萄糖含量，取等體積混合試劑1和試劑2，分裝成1 mL測試管，樣品管加入10 μL待測樣品，標(biāo)準(zhǔn)管加入10 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，對(duì)照管加入10 μL純化水。37 ℃水浴10 min，調(diào)零后在505 nm波長下測定樣品管和標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度，按公式(1)計(jì)算葡萄糖質(zhì)量濃度：

(1)

1.3.5 羅伊氏乳桿菌批培養(yǎng)生長曲線的繪制

將種子液以5%的接種量接種到裝有15 L MRS液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以批培養(yǎng)的方式發(fā)酵培養(yǎng)。每隔2 h取樣，搖勻后取1 mL于1.5 mL離心管中，6 000 r/min離心10 min，去上清液用PBS緩沖液懸浮，測定菌液的OD600值，當(dāng)菌液OD600值超過0.8時(shí)稀釋一定的倍數(shù)，使稀釋后OD600值維持在0.2～0.8，吸光度值乘以稀釋倍數(shù)即為發(fā)酵液的OD600值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，發(fā)酵OD600值為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長曲線。

1.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)

批培養(yǎng)過程如下：將上罐種子液以5%的接種量[19]接種到裝有15 L MRS液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，將溶氧與通氣關(guān)聯(lián)，pH與堿泵關(guān)聯(lián)，在恒pH 5.5[22]、溶氧15%[23]、恒溫37 ℃[19]，攪拌速率為120 r/min條件下有氧發(fā)酵培養(yǎng)，每隔2 h取樣檢測。

批補(bǔ)料培養(yǎng)過程如下：將上罐種子液以5%的接種量接種到裝有8 L MRS液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，將溶氧與通氣關(guān)聯(lián)，pH與堿泵關(guān)聯(lián)，在恒pH 5.5、溶氧15%、恒溫37 ℃，攪拌速率120 r/min下有氧發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)菌株OD600達(dá)對(duì)數(shù)生長中期后，每隔2 h補(bǔ)加2×MRS培養(yǎng)基1 L，補(bǔ)加至15 L，每隔2 h取樣檢測。

灌流濃縮培養(yǎng)發(fā)酵示意圖見圖1，具體過程如下：將上罐種子液以5%的接種量接種到裝有15 L MRS液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，將溶氧與通氣關(guān)聯(lián)，pH與堿泵關(guān)聯(lián)，在恒pH 5.5、溶氧15%、恒溫37 ℃，攪拌速率120 r/min下有氧發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)菌株發(fā)酵達(dá)對(duì)數(shù)生長中期后，啟動(dòng)中空纖維柱截流系統(tǒng)進(jìn)行濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)，灌流流速20 mL/min，循環(huán)流速為灌流流速的10倍，每隔2 h取樣檢測。

圖1 灌流濃縮培養(yǎng)發(fā)酵示意圖Fig.1 Fermentation diagram of concentrated fed-batch

1.3.7 灌流濃縮培養(yǎng)條件優(yōu)化

為探究在不通氣/通氣和恒pH/不調(diào)pH下對(duì)羅伊氏乳桿菌高密度發(fā)酵的影響，設(shè)計(jì)4個(gè)方案，工藝參數(shù)如表1所示。每隔2 h取樣檢測，以發(fā)酵過程中活菌數(shù)和發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體干重為主要指標(biāo)，確定最優(yōu)的發(fā)酵條件。

灌流流速的優(yōu)化：為了維持發(fā)酵過程中細(xì)胞生長代謝的穩(wěn)定，使發(fā)酵產(chǎn)量和活菌數(shù)最大化，根據(jù)確定的培養(yǎng)條件，進(jìn)一步對(duì)灌流流速進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)計(jì)灌流流速為10、20、30、40、50 mL/min，每2 h取樣檢測，以發(fā)酵過程中活菌數(shù)和發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌體干重為主要指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵灌流流速。

表1 培養(yǎng)條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)Table 1 Optimum design of culture conditions

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel和Origin Pro8.5數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅伊氏乳桿菌批培養(yǎng)生長曲線

按照1.3.4方法，使用自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)羅伊氏乳桿菌DSM 17938的生長曲線進(jìn)行測定，每隔2 h測1次發(fā)酵液吸光度值OD600。繪制的菌株生長曲線如圖2所示，0～2 h處于生長遲緩期，2～8 h步入對(duì)數(shù)生長期，OD600值急速增加，8～12 h進(jìn)入生長穩(wěn)定期，菌體密度達(dá)到最大值4.3×1010CFU/mL，12 h以后細(xì)胞進(jìn)入衰亡期。根據(jù)菌株生長情況，確定羅伊氏乳桿菌DSM 17938在培養(yǎng)6 h時(shí)，可進(jìn)行批補(bǔ)料培養(yǎng)和啟動(dòng)灌流濃縮培養(yǎng)。

圖2 羅伊氏乳桿菌DSM 17938的生長曲線Fig.2 Growth curve of L.reuteri DSM 17938

2.2 羅伊氏乳桿菌不同培養(yǎng)方式的效果比較

由圖3-a可知，3種不同發(fā)酵方式下，活菌數(shù)呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，在一段時(shí)間內(nèi)3種培養(yǎng)方式的活菌數(shù)增加變化趨勢(shì)不大，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌密度持續(xù)增加。灌流濃縮培養(yǎng)雖然延長了發(fā)酵的周期，但凸顯出巨大優(yōu)勢(shì)，在第22 h時(shí)活菌數(shù)達(dá)2.98×1015CFU/mL，CDW為53.43 g/L，是批培養(yǎng)和批補(bǔ)料培養(yǎng)的5.3和3.6倍(圖3-b)。通過監(jiān)測發(fā)酵過程中碳源的消耗情況，發(fā)現(xiàn)灌流濃縮培養(yǎng)過程中可以持續(xù)維持較高的葡萄糖濃度，而較持續(xù)的葡萄糖補(bǔ)入適于乳酸菌的增殖。

上述批培養(yǎng)和批補(bǔ)料培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與潘海博等[18]、王超[19]研究結(jié)果相近，造成這2種培養(yǎng)方式活菌數(shù)和產(chǎn)量較低的主要原因是：(1)菌株所需碳源氮源等主要營養(yǎng)物質(zhì)不足；(2)發(fā)酵過程中乳酸、H2O2和CO2等代謝廢物的不斷積累，導(dǎo)致pH值影響帶電物質(zhì)的解離狀態(tài)和結(jié)構(gòu)，從而影響菌株利用營養(yǎng)成分和代謝產(chǎn)物的效率[24]。而灌流濃縮培養(yǎng)利用中空纖維柱截流裝置，彌補(bǔ)了批培養(yǎng)和批補(bǔ)料培養(yǎng)的缺陷，實(shí)現(xiàn)了持續(xù)補(bǔ)償新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)置換出菌株的代謝廢物，維持一個(gè)適宜的生長環(huán)境。綜合考慮，后續(xù)研究以灌流濃縮培養(yǎng)方式為基礎(chǔ)，對(duì)羅伊式乳桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵的研究。

a-活菌數(shù)；b-菌體干重；c-葡萄糖含量圖3 不同培養(yǎng)方式對(duì)羅伊氏乳桿菌發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of different culture methods on fermentation of L.reuteri

2.3 羅伊氏乳桿菌灌流濃縮培養(yǎng)條件優(yōu)化

羅伊氏乳桿菌屬于兼性厭氧菌，具有較強(qiáng)的耐酸性，根據(jù)2.2中的研究結(jié)論，在灌流濃縮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，按1.3.8的實(shí)驗(yàn)方法，通過監(jiān)測發(fā)酵過程中活菌數(shù)和葡萄糖的消耗速率，確定培養(yǎng)的條件。

由圖4-a可知，在通氣發(fā)酵的前期活菌數(shù)增長速率明顯高于不通氣，隨著發(fā)酵的進(jìn)行恒pH時(shí)活菌數(shù)高于不調(diào)pH，在第22 h時(shí)通氣-恒pH條件下活菌數(shù)高達(dá)2.98×1015CFU/mL，而在不通氣-不調(diào)pH時(shí)活菌數(shù)僅為1.46×1013CFU/mL；圖4-b通過監(jiān)測發(fā)酵過程中碳源的消耗情況，發(fā)現(xiàn)在有氧時(shí)葡萄糖的消耗速率快于無氧時(shí)，恒pH時(shí)葡萄糖消耗速率要高于不調(diào)pH，也證明了通氣和pH控制對(duì)菌株的生長增殖具有重要的作用。

a-活菌數(shù)；b-葡萄糖質(zhì)量濃度圖4 不同培養(yǎng)條件對(duì)羅伊氏乳桿菌發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of different culture conditions on fermentation of L.reuteri

SCHIRALDI等[11]研究乳酸菌生長代謝，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中維持適量的溶氧有助于菌株的生長代謝，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致；不調(diào)pH時(shí)活菌數(shù)較低，主要是由于羅伊氏乳桿菌在代謝過程中產(chǎn)生大量的乳酸，隨著乳酸的不斷積累，導(dǎo)致pH值不斷下降，抑制乳酸脫氫酶的活性，從而抑制糖代謝，影響菌體能量的獲取，從而抑制了菌株的生長[25]。因此，在發(fā)酵過程中維持合適的溶氧和pH有助于菌株的生長和增殖。

2.4 羅伊氏乳桿菌灌流流速優(yōu)化

灌流流速在灌流開發(fā)工藝過程中具有重要的指導(dǎo)價(jià)值，流速過低不足以供給菌株生長最低的營養(yǎng)需求，也不能及時(shí)帶走代謝廢物，導(dǎo)致菌株生長受限，活率下降；流速過高則培養(yǎng)基利用率低，成本高。由圖5-a可知，隨著灌流速度的增加，活菌數(shù)呈先增加后降低的趨勢(shì)，灌流流速為40 mL/min時(shí)，活菌數(shù)最大達(dá)8.1×1015CFU/mL，菌體干重60.96 g/L；菌體OD600值(圖5-b)和菌體干重(圖5-d)則隨流速的增加而緩慢的增加，但流速超過40 mL/min時(shí)，菌株活菌數(shù)在降低，葡萄糖濃度逐漸升高(圖5-c)，主要由于流速過大時(shí)中空纖維柱截流系統(tǒng)和高轉(zhuǎn)速的蠕動(dòng)泵產(chǎn)生的高剪切力造成了菌體死亡，將高剪切力的蠕動(dòng)泵換為低剪切力蠕動(dòng)泵時(shí)，可有效降低細(xì)胞死亡率，即在灌流培養(yǎng)過程中控制合適的流速具有重要作用。

a-活菌數(shù)；b-菌株OD600值；c-葡萄糖質(zhì)量濃度；d-菌體干重圖5 不同灌流流速對(duì)羅伊氏乳桿菌發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of different irrigation rates on fermentation of L.reuteri

3 結(jié)論與討論

本研究利用3種不同培養(yǎng)方式對(duì)羅伊氏乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，證明灌流濃縮培養(yǎng)在活菌數(shù)和產(chǎn)量上都凸顯出巨大的發(fā)酵優(yōu)勢(shì)，通過對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行初步探索，確定最佳灌流發(fā)酵條件為：通氣(氧含量恒定為15%)、恒pH為 5.5、流速為40 mL/min的最優(yōu)條件下活菌數(shù)達(dá)到8.1×1015CFU/mL，菌體干重60.96 g/L，相對(duì)于未優(yōu)化時(shí)提升了2.72和1.07倍。本研究在培養(yǎng)過程中采用恒流灌流培養(yǎng)模式，仍然無法實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基利用率最大化，后期研究可通過代謝流分析不同時(shí)段發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗量和代謝廢物累積量，研究其糖酵解及其代謝機(jī)理，采取階段性增加流速的方式灌流培養(yǎng)，以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基利用率的最大化。在未來益生菌工業(yè)化的進(jìn)程中，獲取產(chǎn)量高、成本低廉和活率高的菌株是發(fā)酵工藝的最終目的。