劉振山，時祎，陳劍雄，辛瑜，顧正華，張梁*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

酶介導(dǎo)的生物催化已經(jīng)成為一種可以有效減少工業(yè)生產(chǎn)中有毒有害物質(zhì)產(chǎn)生的綠色、可持續(xù)技術(shù)[1-2]。脂肪酶作為一類具有催化脂化、酯交換和酯水解等多種功能的酶，通常具有催化活性高、底物范圍廣、區(qū)域選擇性強(qiáng)和對應(yīng)選擇性好等特點[3]。鑒于以上特征，脂肪酶已被廣泛用作生物技術(shù)領(lǐng)域的多功能生物催化劑，使用范圍涵蓋食品生產(chǎn)、藥物、洗滌劑配方、皮革制品以及生物柴油制造等領(lǐng)域[4-8]。源自嗜熱菌的嗜熱脂肪酶因其在高溫以及有機(jī)溶劑環(huán)境中所展現(xiàn)出的優(yōu)異催化活性和穩(wěn)定性而受到更多關(guān)注[9-11]。例如，來自產(chǎn)堿桿菌屬的嗜熱脂肪酶最佳反應(yīng)溫度為60～70 ℃。該酶在酸性或堿性條件下仍具有優(yōu)異的催化活性和穩(wěn)定性[12-14]。除上述酶學(xué)特征外，在工業(yè)生物催化中，普遍需要生物催化劑具有較高酶活力，并且具備一定的儲藏穩(wěn)定性、可重復(fù)使用性以及易于與反應(yīng)體系分離等特性。然而，受限于生物大分子的固有特性，游離酶并不能滿足這類需求。為滿足實際生產(chǎn)需求，將游離酶進(jìn)行固定化是一種行而有效的策略。

近年來，自組裝的有機(jī)-無機(jī)雜化納米花已作為一種新型的酶固定方法被開發(fā)與應(yīng)用[15]。通過該方法，可有效解決游離酶在工業(yè)生物催化中所存在的功能酶穩(wěn)定性差、無法重復(fù)利用、無法長期儲藏等問題。WANG等[16]發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶雜化納米花比游離的α-淀粉酶具有更高的穩(wěn)定性；漆酶的催化效率則在形成基于Cu2+的酶雜化納米花后被提高了2.2倍[17]。盡管無機(jī)雜化納米花可以有效增強(qiáng)酶的活性和穩(wěn)定性，但該反應(yīng)混合物必須在4 ℃下孵育3 d，緩慢的合成過程嚴(yán)重限制了該類固定方法在實際中的廣泛應(yīng)用。為突破此限制，BATULE等[18]于近年來使用聲化學(xué)技術(shù)開發(fā)了一種可快速合成有機(jī)-無機(jī)雜化納米花的新方法，使得有機(jī)-無機(jī)雜化納米花的自組裝過程在室溫條件下超聲5 min即可完成。

在本研究中，首先以大腸桿菌為載體對嗜熱脂肪酶進(jìn)行表達(dá)，并經(jīng)過親和柱純化獲得游離酶；隨后利用聲化學(xué)方法快速制備脂肪酶-無機(jī)雜化納米花，并對合成條件進(jìn)行了優(yōu)化。針對所制備的脂肪酶雜化納米花，使用掃描電子顯微鏡 (scanning electron microscope，SEM)、X射線衍射(X-ray diffraction，XRD) 和傅里葉紅外光譜 (Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR) 對其進(jìn)行相應(yīng)的表征。為探究該固定化酶在實際中的應(yīng)用潛力，還對所獲得的脂肪酶雜化納米花的穩(wěn)定性和催化活性進(jìn)行了研究，以期為該類酶的有效應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

E.colipTIG-liP/BL21(DE3)為本實驗室保存。

1.2 試劑、培養(yǎng)基和儀器

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 5、胰蛋白胨 10、NaCl 10，115 ℃滅菌20 min。

主要試劑：對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-nitrophenyl palmitate)，SIGMA公司；氨芐青霉素，上海生物工程股份有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：SCG蛋白純化系統(tǒng)，蘇州賽譜儀器有限公司；KQ-100型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；酶標(biāo)儀，TECAN公司；超聲細(xì)胞破碎儀，SONICMATERIALS INC.USA；NEXUS傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司；Bruker advance D8 型X射線衍射儀，德國布魯克AXS公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 脂肪酶的表達(dá)

將重組菌E.colipTIG-liP/BL21(DE3)劃線于氨芐青霉素抗性平板上37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種于15 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min的條件下培養(yǎng)12 h，以體積分?jǐn)?shù)2%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至50 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件不變，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8時，添加終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactosid，IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，在16 ℃，200 r/min條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，離心棄上清液收集菌體，用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)洗滌3次，破碎細(xì)胞收集上清液即為粗酶液。

1.3.2 脂肪酶的純化與聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析

將粗酶液用5 mL鎳柱純化，收集純化的脂肪酶(Lip)，用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)透析去除高濃度咪唑，用SDS-PAGE分析檢測。

1.3.3 Lip雜化納米花的制備條件優(yōu)化

以Lip做為有機(jī)部分，以Cu、Co、Ca、Mn、Ni做為無機(jī)部分，制備Cu2+納米花、Co2+納米花、Ca2+納米花、Mn2+納米花以及Ni2+納米花。具體實驗步驟如下：取5 mL離心管，將0.01～0.15 mg/mL的脂肪酶與1～3 mmol/L的5種金屬離子混合后再用pH 6～9的PBS(20 mmol/L)補(bǔ)齊至1 mL，充分混勻5 min，將樣品置于水浴超聲儀中超聲1～15 min。10 000 r/min離心10 min后收集樣品，并用去離子水洗滌3次，通過Bradford方法測量上清液中的酶濃度以確定雜化納米花中的包封率。包封率按公式(1)計算：

(1)

式中：ER，包封率，%；ρ1，上清液蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；ρ0，初始蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL

1.3.4 脂肪酶活力測定

參照SHA等[19]的方法測定，稍作改動。底物1：15 mmol/L對硝基苯酚棕櫚酸酯溶于二甲基亞砜中；底物2：用50 mmol/L Tris-HCl分別溶解脫氧膽酸鈉與阿拉伯樹膠使其終質(zhì)量濃度分別為1.2 g/L與0.55 g/L，并用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至8.0；將底物1與底物2按體積比1∶100(mL∶mL)混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，反應(yīng)前將混合物置于45 ℃孵育5 min。反應(yīng)體系：取混合物2.4 mL，加入0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，于85 ℃下準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后，加入0.1 mL濃度為1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，空白對照為不加酶液的緩沖液，最后于波長410 nm處測定吸光值。酶活力定義：1 min產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚所需要的酶量為一個酶活力單位(U)。酶活力回收率定義為固定化酶吸光值與游離酶吸光值的比值除以包封率，按公式(2)計算：

(2)

式中：A1，固定化酶吸光值；A0，對照組吸光值；A2，游離酶吸光值；RE，包封率，%

1.3.5 Lip雜化納米花的表征

1.3.5.1 SEM 分析

將3種制備好的Cu2+固定化酶冷凍干燥，對樣品進(jìn)行噴金預(yù)處理后，置于樣品臺上，用SEM進(jìn)行掃描觀察，以不加酶的磷酸鹽沉淀作為對照。

1.3.5.2 FT-IR分析

將樣品放置在檢測孔處，使用FT-IR對其進(jìn)行分析，通過軟件分析采集數(shù)據(jù)，以不加酶的磷酸鹽沉淀作為對照。

1.3.5.3 XRD分析

將樣品充分研磨后，覆蓋于檢測中心，并將其輕輕壓實后再進(jìn)行檢測。掃描角度為5°～90°，掃描速度為5 ℃/min，采集數(shù)據(jù)后與Jade軟件中PDF卡片標(biāo)準(zhǔn)庫比對，分析物質(zhì)結(jié)晶情況。

1.3.6 Lip與Lip雜化納米花的酶學(xué)性質(zhì)

1.3.6.1 最適反應(yīng)pH以及pH穩(wěn)定性測定

在pH 4.0～11.0的緩沖液中測定游離酶和固定化酶的酶活力，將實驗中所測得的最高酶活力記作100%，并計算其他pH值條件下的相對酶活力，確定最適pH值。pH穩(wěn)定性測定：將適量稀釋的脂肪酶置于pH 4.0～11.0的不同緩沖液中，室溫孵育4 h后測定殘留酶活力，以未處理酶的酶活力作為100%，測定孵育后脂肪酶相對酶活力。不同pH緩沖體系分別為：NaAc-HAc(pH 3.0～5.0)、Na2HPO4-NaH2PO4(pH 6.0～7.0)、Tris-HCl(pH 8.0～9.0)、Gly-NaOH(pH 10.0～11.0)。

1.3.6.2 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性測定

在60～95 ℃內(nèi)測定游離酶以及固定化酶的酶活力，以最高酶活力作為100%并計算其他溫度下的相對酶活力，確定最適反應(yīng)溫度。溫度穩(wěn)定性測定：在60～95 ℃孵育1 h，以未處理酶的酶活力作為100%，測定孵育后脂肪酶相對酶活力。

1.3.6.3 固定化酶的儲藏穩(wěn)定性及可重復(fù)使用性

儲藏穩(wěn)定性：將固定化酶放置在室溫條件下30 d，每3 d測定1次酶活力, 以初始酶活力為100%，測定固定化酶儲藏穩(wěn)定性。

可重復(fù)使用性：在固定化酶反應(yīng)后，通過離心(10 000 r/min， 5 min)將固定化酶與反應(yīng)混合物分離，并用去離子水洗滌2次，回收的固定化酶立刻用于下一個反應(yīng)的測量，以初始酶活力為100%，測定固定化酶的可重復(fù)使用性。

1.3.6.4 動力學(xué)研究

以對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物，在85 ℃下與脂肪酶反應(yīng)，測得初始反應(yīng)速度，利用Origin軟件中的Michaelis-Menten方程進(jìn)行非線性擬合，得到Km值，根據(jù)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和蛋白質(zhì)濃度計算kcat和kcat/Km值，確定游離脂肪酶以及固定化脂肪酶對對硝基苯酚棕櫚酸酯的特異性，kcat按公式(3)計算：

(3)

(4)

式中：kcat，催化常數(shù)，s-1；Vm，最大反應(yīng)速率，μmol/min；[E]，蛋白物質(zhì)的量，μmol；T，反應(yīng)時間，s；ρ，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；V，酶液體積；M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，kDa。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lip的表達(dá)與純化

如圖1所示，通過10% SDS-PAGE分析，在3號泳道38 kDa處觀察到明顯的目的蛋白積累，并且與預(yù)測的分子質(zhì)量一致。凝膠泳道中呈現(xiàn)出清晰的目標(biāo)蛋白條帶，表明在此獲得了純度較高的Lip。

M-marker；1-空載；2-粗酶；3-純酶圖1 Lip SDS-PAGE分析Fig.1 Lip SDS-PAGE analysis

2.2 Lip雜化納米花固定化酶的制備與條件優(yōu)化

在雜化納米花的合成過程中，酶與金屬離子會形成強(qiáng)復(fù)合物。該合成過程經(jīng)歷3個連續(xù)的步驟，包括成核、生長以及自組裝成花狀結(jié)構(gòu)[15]。在納米花形成過程中，合成條件對于金屬離子納米花的活性有很大的影響，ZHANG等[20]發(fā)現(xiàn)脂肪酶雜化納米花的形成與金屬離子類別、脂肪酶的濃度、溫度有關(guān)；而BATULE等[18]則發(fā)現(xiàn)通過聲化學(xué)的方法僅超聲5 min就可以快速完成雜化納米花的自組裝過程并且超聲時間對其活性影響較大。除此之外，SAR等[21]也發(fā)現(xiàn)不同銅鹽類型會影響納米花的生長和形態(tài)。為了進(jìn)一步了解不同合成條件對所形成的脂肪酶雜化納米花的活性影響，本研究對金屬離子種類、濃度、脂肪酶濃度、超聲時間和PBS的pH在內(nèi)的各項參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。由圖2可知，用聲化學(xué)方法制備脂肪酶納米花時，只有Cu2+可以獲得包封率較高的雜化納米花，當(dāng)Cu2+濃度為3 mmol/L時，包封率可達(dá)100%，且酶活力回收率可達(dá)到82.79%。而使用其他金屬離子固定化后的包封率除Co2+外普遍低于50%，雖然Co2+可使包封率達(dá)到65.20%，但與其相對應(yīng)的酶活力回收率會顯著下降。上述結(jié)果可能是由于固定化酶的載量過高導(dǎo)致空間位阻增大所造成的。綜合包封率及酶活力回收率，本研究選擇Cu2+進(jìn)行后續(xù)的固定化條件優(yōu)化。

a-包封率；b-酶活力回收率圖2 不同金屬離子納米花Fig.2 Nanoflowers formed with different metal ions

考慮到不同銅鹽類型可能會造成固定化效果的差異性，分別使用CuCl2、Cu (NO3)2和CuSO4作為金屬離子納米花制備材料，以期獲得最優(yōu)的固定化酶。如圖3所示，與游離酶相比，CuCl2和Cu (NO3)2制備的納米花[Lip-CuCl2和Lip-Cu(NO3)2]的酶活力最高，分別提升了21.15%和10.24%。就包封率而言，CuSO4制備的納米花(Lip-CuSO4)最高可達(dá)100%。對比掃描電鏡結(jié)果(圖5)可以看出， Lip-CuSO4顯示出花瓣狀的致密結(jié)構(gòu)，這類結(jié)構(gòu)可為脂肪酶固定化提供更多的附著位點從而導(dǎo)致包封率的提高；Lip-CuCl2和Lip-Cu (NO3)2的結(jié)構(gòu)較Lip-CuSO4更為致密，這有利于底物分子與酶的活性中心結(jié)合從而提高固定化酶酶活力[13]。綜合對比后選擇了金屬離子濃度為3 mmol/L的Lip-CuSO4(包封率最高)和金屬離子濃度為2 mmol/L的Lip-CuCl2(酶活力回收率最高)2個組來進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化。

a-包封率；b-酶活力回收率圖3 不同銅鹽納米花Fig.3 Nanoflowers formed by different copper salts

如圖4-a所示，隨著脂肪酶濃度的提升，酶活力回收率逐漸提高。在脂肪酶質(zhì)量濃度達(dá)到0.05 mg/mL時，由CuSO4和CuCl2所制備的納米花均達(dá)到最高的酶活力回收率。其中Lip-CuSO4的酶活力回收率為78.6%，Lip-CuCl2為110.6%。從圖4-b可知，Lip-CuSO4在pH 6～8所測得的酶活力回收率均在90%左右，當(dāng)PBS的pH為7時酶活力回收率最高可達(dá)93.4%， Lip-CuCl2酶活力回收率最高達(dá)137.9%。由圖4-c所示，通過對比不同超聲時間(1、5、10、15 min)對酶活力回收率的影響后發(fā)現(xiàn)，超聲5 min所制備的Lip-CuSO4納米花酶活力回收率最高可達(dá)86.4%，而超聲10 min制備的Lip-CuCl2納米花酶活力回收率最高可達(dá)145.7%。

a-酶濃度；b-PBS緩沖液pH；c-超聲波時間圖4 Lip雜化納米花制備條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of preparation conditions for Lip hybrid nanoflowers

鑒于以上結(jié)果，在后續(xù)的實驗中則選取金屬離子濃度3 mmol/L、脂肪酶質(zhì)量濃度0.05 mg/mL、pH 7的PBS、超聲5 min作為Lip-CuSO4納米花的制備條件。而Lip-CuCl2則以金屬離子濃度2 mmol/L、脂肪酶質(zhì)量濃度0.05 mg/mL、pH 7的PBS、超聲10 min為最佳制備條件。通過以上合成條件優(yōu)化，相較于優(yōu)化前Lip-CuSO4的酶活力回收率從78.6%提升到了93.4%，Lip-CuCl2的酶活力則從110.6%提升到了145.7%。

2.3 Lip雜化納米花的表征

2.3.1 SEM結(jié)果分析

由圖5可知，對照組中并未觀察到特定的形貌結(jié)構(gòu)，而實驗組中Lip-CuSO4納米花結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)為松散的花瓣狀；Lip-CuCl2和Lip-Cu(NO3)2相較于Lip-CuSO4結(jié)構(gòu)則為更加致密的繡球花狀。本研究中所形成的納米花結(jié)構(gòu)與此前使用Cu3(PO4)2·3H2O作為晶核固定脂肪酶的多篇文獻(xiàn)所報道的納米花結(jié)構(gòu)基本一致[18, 22-23]，從而進(jìn)一步表明本研究中的Lip已被成功固定。

a-Lip-CuSO2對照；b-Lip-CuCl2對照；c-Lip-Cu(NO3)2對照；d-Lip-CuSO4;e-Lip-CuCl2;f-Lip-Cu(NO3)2圖5 Lip雜化納米花SEM圖Fig.5 SEM image of Lip hybrid nanoflower

2.3.2 FT-IR結(jié)果分析

a-Lip-CuSO4；b-Lip-CuCl2；c-Lip-Cu(NO3)2圖6 Lip雜化納米花FT-IR圖Fig.6 FT-IR image of Lip hybrid nanoflower

2.3.3 XRD結(jié)果分析

對比Cu3(PO4)2·3H2O標(biāo)準(zhǔn)卡片(JCPDS，卡片 00-022-0548)，3種脂肪酶納米花衍射峰與其基本吻合(圖7)，表明這3種脂肪酶雜化納米花均具有良好的結(jié)晶度，且上述雜化納米花的無機(jī)成分為Cu3(PO4)2·3H2O[18, 22-23]。

圖7 Lip納米花XRD圖Fig.7 XRD pattern of Lip Nanoflower

2.4 Lip與Lip雜化納米花的酶學(xué)性質(zhì)

如圖8-a所示，Lip的最佳反應(yīng)溫度為85 ℃，通過固定化所獲得的脂肪酶雜化納米花的最適反應(yīng)溫度可提高至90 ℃。此外，游離酶與固定化酶在95 ℃時均可保持較高的酶活力，具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。由圖8-b可看出，Lip固定化前后的最佳pH均為9，而固定化后的脂肪酶則擁有更寬泛的pH適用范圍，說明雜化納米花的形成可以保護(hù)酶免受極端條件的影響[22]。值得注意的是，本研究中所固定的脂肪酶本身已具備較高的溫度以及pH穩(wěn)定性(圖8-c和圖8-d)。盡管Lip-CuSO4與Lip-CuCl2納米花的pH穩(wěn)定性都較好，且Lip-CuCl2納米花具有更高的酶活力，但這2種雜化納米花的溫度穩(wěn)定性均低于游離酶。此現(xiàn)象可能是由于固定化過程中破壞了酶的部分結(jié)構(gòu)使酶的剛性下降所引起的[20]。

a-最適反應(yīng)溫度；b-最適反應(yīng)pH；c-溫度穩(wěn)定性；d-pH穩(wěn)定性圖8 溫度和pH對游離酶和Lip納米花的影響Fig.8 Effect of temperature and pH on free enzymes and Lip nanoflowers

針對游離酶和固定化酶，通過測量其對不同濃度的對硝基苯酚棕櫚酸脂的初始反應(yīng)速率，利用Origin軟件中的Michaelis-Menten方程進(jìn)行非線性曲線擬合，得到Km和Vm值，并計算kcat和kcat/Km值。如表1所示，游離酶的Km值為0.005 mmol/L， Lip-CuSO4納米花Km基本無變化，Lip-CuCl2納米花的Km值提高了2.6倍，表明固定化后的酶對底物的親和能力有所降低。這可能是由于酶的構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致形成的底物-酶復(fù)合物的概率降低；或者是由于傳質(zhì)阻力的增加導(dǎo)致底物對固定化酶活性位點的可及性降低，但與底物的弱結(jié)合可能使酶易于在反應(yīng)部位消除產(chǎn)物[21,24]。在催化效率方面，Lip-CuSO4納米花的kcat/Km值增加了約6%，Lip-CuCl2納米花的kcat/Km值增加了約34%。結(jié)果表明脂肪酶納米花將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的活性有所增強(qiáng)，這可能與脂肪酶納米花獨特的花狀結(jié)構(gòu)具有高比表面積有關(guān)[23]。

表1 游離酶和Lip納米花動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of free enzyme and Lip nanoflower

2.5 Lip納米花的儲藏穩(wěn)定性與可重復(fù)使用性

固定化酶的儲藏穩(wěn)定性與可重復(fù)使用性對于實際應(yīng)用有重要的意義，本研究通過長期室溫儲存以及連續(xù)5個反應(yīng)分別評估了脂肪酶雜化納米花的儲藏穩(wěn)定性以及可重復(fù)使用性。如圖9-a所示，在經(jīng)過30 d的室溫儲藏后游離酶的酶活力只有原來的44%，而固定化酶仍能保持80%以上的酶活力，這可能是由于納米花獨特的花狀結(jié)構(gòu)能夠更好地保護(hù)酶免受外界條件的干擾[22]。

a-儲藏穩(wěn)定性；b-可重復(fù)使用性圖9 Lip納米花的儲藏穩(wěn)定性與可重復(fù)使用性Fig.9 Storage stability and reusability of Lip nanoflower

如圖9-b所示，脂肪酶雜化納米花在連續(xù)使用5次后仍能保持近40%的酶活力，而彭開敏等[25]以豬肝酯酶作為有機(jī)部分，磷酸鈣作為無機(jī)部分制備納米花，在固定化酶重復(fù)使用6次后活性僅為10%左右，表明本研究中所采取的固定化策略可有效提高該嗜熱脂肪酶的可重復(fù)使用性。

3 結(jié)論與討論

本文系統(tǒng)地研究了不同金屬離子、銅鹽類型、酶濃度、超聲時間和PBS的pH對脂肪酶雜化納米花活性的影響。發(fā)現(xiàn)采用聲化學(xué)方法制備的雜化納米花Cu2+固定化效果最好。在銅鹽類型的研究中發(fā)現(xiàn)SO42-可能有助于提高脂肪酶雜化納米花的載量，而Cl-與NO3-則有助于脂肪酶雜化納米花酶活力的提升。上述差異可能是由不同銅鹽類型制備的脂肪酶納米花結(jié)構(gòu)不同所導(dǎo)致的。通過SEM、FT-IR和XRD分析表明Lip成功固定于Cu3(PO4)2·3H2O上。與游離酶相比，Lip-CuSO4與Lip-CuCl2納米花的最適反應(yīng)溫度有所提高，而最適反應(yīng)pH無變化。在催化效率方面，Lip-CuSO4的催化效率是游離酶的106%，Lip-CuCl2的催化效率是游離酶的134%。此外，制備的脂肪酶雜化納米花，室溫儲藏30 d仍能保持80%以上的酶活力，有效地提升了該酶的儲藏穩(wěn)定性。綜上所述，采用聲化學(xué)方法制備無機(jī)雜化納米花可為脂肪酶固定化提供一種簡單快捷的途徑，并且在一定程度上提高固定化酶的催化活性和穩(wěn)定性，進(jìn)一步證實通過該方法獲得的Lip雜化納米花在工業(yè)生物催化方面具有廣泛的應(yīng)用潛力。