李金玲，李文茹，張建設(shè)，黃旭斌，廖康，謝小保

(1.浙江海洋大學(xué)國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；2.廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東廣州 510080；4.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東廣州 510080)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是一種引起院內(nèi)感染的主要條件致病菌，能適應(yīng)惡劣的生存環(huán)境，且分布廣泛，常存在于水體、土壤以及空氣等自然環(huán)境中以及人類(lèi)的皮膚、消化道和呼吸道等位置。該菌可引起肺炎、燒傷感染、血流感染等多種感染，致死率高。PA 具有龐大的基因庫(kù)，極易產(chǎn)生耐藥，對(duì)多種抗生素具有較強(qiáng)耐藥性[1-4]。據(jù)中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHINET)報(bào)道2005-2020 年銅綠假單胞菌的臨床分離率均位于革蘭氏陰性菌的前五[5-11]，一直是治療院內(nèi)感染亟待解決的問(wèn)題，給臨床抗感染治療帶來(lái)了極大困擾，已成為臨床關(guān)注焦點(diǎn)[12-13]。近年來(lái)，關(guān)于PA 異質(zhì)性耐藥(heteroresistance,HR)的報(bào)道也越來(lái)越多，使其臨床治療越發(fā)棘手。

異質(zhì)性耐藥是細(xì)菌中的不同細(xì)胞亞群對(duì)抗生素的敏感性不同，是細(xì)菌由敏感菌株發(fā)展成耐藥菌株的中間階段[14-15]。異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象最早見(jiàn)報(bào)于1947年[16]，但1970 年這種現(xiàn)象才被命名為“異質(zhì)性耐藥”[17]。NICOLOFF,et al[18]研究者認(rèn)為當(dāng)某種細(xì)菌在臨床檢驗(yàn)中主要群體為藥敏，但存在最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)與最高不抑菌濃度(maximum non inhibitory concentration,MNIC)比值大于8，且發(fā)生頻率大于1×10-7的耐藥亞群，則可以確認(rèn)為是異質(zhì)性耐藥。1997 年，有研究者發(fā)現(xiàn)對(duì)甲氧西林異質(zhì)性耐藥的金黃色葡萄球菌[19]，后續(xù)有研究人員相繼在肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌等多種常見(jiàn)致病菌中發(fā)現(xiàn)了異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象[20-24]。但對(duì)PA 異質(zhì)性耐藥的研究較少，大多局限于PA 對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的異質(zhì)性耐藥，目前PA 對(duì)頭孢菌素類(lèi)抗生素異質(zhì)性耐藥的相關(guān)報(bào)道較少，其異質(zhì)性耐藥機(jī)制也尚不明確。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)菌株為中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科臨床分離的50 株P(guān)A，質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853，由廣東省科學(xué)院微生物分析檢測(cè)中心保存。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

Kirby-Bauer(K-B)藥敏紙片：CAZ(30 μg)，購(gòu)自英國(guó)Oxoid 公司；頭孢他啶粉劑，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；水解酪蛋白胨(Mueller-Hinton,MH)瓊脂培養(yǎng)基、Luria-Bertani(LB)肉湯培養(yǎng)基，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；陽(yáng)離子調(diào)節(jié)Mueller-Hinton(MH)肉湯(CAMHB)培養(yǎng)基，購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司；哥倫比亞血平板，購(gòu)自廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株保存

菌株保存采用甘油保存法，采集的菌株于平板上劃線(xiàn)培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落接種于LB 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將高溫消毒后的50%甘油與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液按1:1 的比例混勻，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 最小抑菌濃度測(cè)定

公共圖書(shū)館服務(wù)對(duì)象廣泛，涉及各個(gè)年齡段，一般采用調(diào)查問(wèn)卷的方式來(lái)采集用戶(hù)評(píng)價(jià)。調(diào)查問(wèn)卷包含3各部分，第一部分是用戶(hù)基本信息，如年齡、性別、家庭住址等；第二部分是調(diào)查問(wèn)卷的核心內(nèi)容，即LibQUAL+TM的各個(gè)指標(biāo)；最后一部分是開(kāi)放性問(wèn)題，如用戶(hù)對(duì)圖書(shū)館服務(wù)的建議與意見(jiàn)。調(diào)查問(wèn)卷的核心是用戶(hù)對(duì)LibQUAL+TM各指標(biāo)的滿(mǎn)意情況，每一指標(biāo)可分若干種滿(mǎn)意程度，并用不同分值計(jì)量。通過(guò)調(diào)查問(wèn)卷的回收統(tǒng)計(jì)，對(duì)公共圖書(shū)館各服務(wù)層面進(jìn)行客觀(guān)總結(jié)，以便提高圖書(shū)館服務(wù)質(zhì)量。

CAZ 對(duì)PA 的MIC 測(cè)定按照標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法進(jìn)行[25]。在12×8 孔板中每孔各加入100 μL CAMHB培養(yǎng)基，設(shè)置CAZ 濃度梯度為0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg·mL-1，以指數(shù)生長(zhǎng)期的PA 細(xì)胞配制菌懸液，實(shí)驗(yàn)菌株終濃度為5×105CFU·mL-1。本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)無(wú)CAZ，陰性對(duì)照孔內(nèi)無(wú)菌液，實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)平行。將加好樣的孔板在37 ℃靜置培養(yǎng)16～20 h 后讀取結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853。根據(jù)CLSI 2020版[25]進(jìn)行結(jié)果判讀，裸眼觀(guān)察到的孔內(nèi)無(wú)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)的最低CAZ 濃度判定為MIC。陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)細(xì)菌正常生長(zhǎng)，陰性對(duì)照孔內(nèi)沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)，參考質(zhì)控菌株的抗生素MIC 結(jié)果在指南要求范圍內(nèi)。

1.2.3 K-B 藥敏實(shí)驗(yàn)

K-B 藥敏紙片擴(kuò)散法的實(shí)驗(yàn)操作步驟參考臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standard Institute,CLSI)2020版[25]。挑取血平板上過(guò)夜生長(zhǎng)的單菌落配制菌懸液，使用生理鹽水將菌懸液濃度調(diào)整為(1～2)×108CFU·mL-1。以上述菌液濃度接種，使用無(wú)菌棉簽浸入菌懸液后均勻的涂布于MH 瓊脂平板上，將CAZ 藥敏紙片平置于涂布菌液的平板中央。37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)16～18 h，測(cè)定CAZ 抑菌圈的直徑。根據(jù)CLSI 2020版[25]進(jìn)行結(jié)果判讀。通過(guò)裸眼觀(guān)察抑菌圈內(nèi)是否有菌落出現(xiàn)，抑菌圈內(nèi)出現(xiàn)菌落生長(zhǎng)則初步判斷為異質(zhì)性耐藥。本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2.4 菌落譜型分析(population analysis profile,PAP)

菌落譜型分析法作為一種菌落計(jì)數(shù)的相對(duì)定量方法，也被認(rèn)為是異質(zhì)性耐藥確證的金標(biāo)準(zhǔn)[26]。使用MHA 培養(yǎng)基配制CAZ 濃度梯度為0、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg·mL-1的MH 平板，以指數(shù)生長(zhǎng)期的PA 細(xì)胞配制菌懸液，菌液濃度為107～102CFU·mL-1。以上述菌液濃度取100 μL 均勻涂布于MH平板上，實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)平行。37 ℃靜置培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，使用Microsoft Excel 處理數(shù)據(jù)并作圖，若菌株MIC 與MNIC 比值大于8，且耐藥亞群發(fā)生頻率大于1×10-7，則可以確認(rèn)為是HR 菌株。對(duì)照菌株為非異質(zhì)性耐藥的銅綠假單胞菌ATCC27853 和臨床分離的耐藥菌株P(guān)AS96。

1.2.5 適應(yīng)成本測(cè)定

生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)主要是檢測(cè)實(shí)驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)特征[27]。本實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)對(duì)比親本菌株和異質(zhì)性耐藥亞群兩者在相同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)速率是否有顯著差異以判斷異質(zhì)性耐藥菌株是否產(chǎn)生適應(yīng)成本。

在12×8 孔板中每孔各加入100 μL 的LB 肉湯培養(yǎng)基，用處于指數(shù)生長(zhǎng)期的PA 菌株配制菌懸液，實(shí)驗(yàn)菌株終濃度為1×106CFU·mL-1。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行?？装逯糜谌ㄩL(zhǎng)酶標(biāo)儀37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，每小時(shí)測(cè)定1 次OD600值，直至24 h。根據(jù)數(shù)據(jù)繪制時(shí)間生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖，對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，判斷生長(zhǎng)速度是否有顯著差異。

1.2.6 耐藥穩(wěn)定性測(cè)試

耐藥穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)是為了證實(shí)CAZ 異質(zhì)性耐藥亞群在無(wú)抗生素壓力下是否能夠穩(wěn)定遺傳。挑取PAP實(shí)驗(yàn)中最高CAZ 濃度平板上的耐藥亞群，制備甘油管于-20 ℃冰箱保存。按照1%的接種量在無(wú)抗生素的MH 平板上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜，連續(xù)傳代50 代并且在超低溫冰箱(-80 ℃)保存菌株。使用CAMHB 培養(yǎng)基對(duì)原始菌株和耐藥亞群以及傳代菌株進(jìn)行MIC 值的測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 MIC 藥敏結(jié)果

根據(jù)CLSI(2020)發(fā)布的M100-S30 文件中所制定的PA 的CAZ 耐藥標(biāo)準(zhǔn)[25]，采用肉湯稀釋法根據(jù)MIC值判斷藥敏結(jié)果為：MIC 值≤8 μg·mL-1為敏感(susceptible,S)，MIC 值≥32 μg·mL-1為耐藥(resistant,R)，MIC 值是16 μg·mL-1時(shí)為中介(intermediate,I)。本次研究對(duì)50 株臨床分離的PA 對(duì)CAZ 的MIC 范圍為1～256 μg·mL-1，其中，37 株菌株的MIC 值在1～8 μg·mL-1范圍內(nèi)，判定為CAZ 敏感；1 株菌株MIC 值為16 μg·mL-1，判定為中介；12 株菌株MIC 值在32～256 μg·mL-1范圍內(nèi)，判定為CAZ 耐藥(表1)。其中菌株P(guān)AS56、PAS73、PAS95 的MIC 為4 μg·mL-1，菌株P(guān)AS81 的MIC 為8 μg·mL-1。

表1 50 株銅綠假單胞菌對(duì)頭孢他啶的藥敏結(jié)果Tab.1 Experimental results of 50 P.aeruginosa strains susceptibility to CAZ

2.2 異質(zhì)性耐藥菌株的初篩

根據(jù)CLSI(2020)中所制定的PA 的CAZ 耐藥標(biāo)準(zhǔn)[25]，采用紙片擴(kuò)散法并根據(jù)抑菌圈直徑大小判斷其藥敏結(jié)果為：抑菌圈直徑≥18 mm 為敏感，抑菌圈直徑≤14 mm 為耐藥，抑菌圈直徑介于15 mm 與17 mm 之間的為中介耐藥，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853 的抑菌圈直徑質(zhì)控范圍為22～29 mm。

本次研究對(duì)50 株臨床分離的PA 進(jìn)行了K-B 藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1 所示。50 株P(guān)A 對(duì)CAZ 的抑菌圈直徑的范圍為8.29～31.55 mm，其中，37 株菌株的抑菌圈直徑范圍為22～32 mm，判定為CAZ 敏感，占比74%；1 株菌株的抑菌圈直徑則為15 mm，判定為中介，占比2%；12 株菌株其抑菌圈直徑范圍為8～11 mm，判定為CAZ 耐藥，占比24%。

PA 對(duì)CAZ 的K-B 藥敏表型如圖1 所示，通過(guò)觀(guān)察抑菌圈內(nèi)是否出現(xiàn)大小不等的菌落生長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行異質(zhì)性耐藥情況的初步篩選。質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853 的K-B 藥敏結(jié)果，抑菌圈的直徑為28 mm 且圈內(nèi)無(wú)菌落生長(zhǎng)，根據(jù)CLSI 標(biāo)準(zhǔn)該菌株為CAZ 敏感(圖1A)；臨床分離株P(guān)AS64 的抑菌圈直徑為25 mm，根據(jù)CLSI 標(biāo)準(zhǔn)該菌株為CAZ 敏感(圖1B)；臨床分離株P(guān)AS96 的抑菌圈直徑為9 mm，根據(jù)CLSI 標(biāo)準(zhǔn)該菌株為CAZ 耐藥(圖1C)；臨床分離株P(guān)AS81 的抑菌圈直徑為26 mm，CAZ 紙片抑菌環(huán)的邊緣出現(xiàn)了一些菌落(透射光下裸眼可見(jiàn))，這些菌落是可能的異質(zhì)性耐藥菌落(圖1D)，初步判定為CAZ 異質(zhì)性耐藥。初步篩選到異質(zhì)性耐藥菌株20 株，占總實(shí)驗(yàn)菌株的40%。

圖1 銅綠假單胞菌對(duì)頭孢他啶的K-B 藥敏表型Fig.1 Phenotypic susceptibility of P.aeruginosa to CAZ by K-B test

2.3 異質(zhì)性耐藥菌株的確認(rèn)

本研究對(duì)初步篩選出的20 株異質(zhì)性耐藥菌株進(jìn)行菌落譜型分析驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，有4 株為異質(zhì)性耐藥菌株(圖2)。敏感菌株ATCC27853 在CAZ 濃度達(dá)到8 μg·mL-1無(wú)菌落生長(zhǎng)；耐藥菌株P(guān)AS96 在藥物濃度為128 μg·mL-1時(shí)，仍保持穩(wěn)定生長(zhǎng)；而這4 株(PAS56、PAS73、PAS81、PAS95)異質(zhì)性耐藥菌株的曲線(xiàn)則是緩慢下降，隨著頭孢他啶濃度的增加，菌株可以在平板上生長(zhǎng)的耐藥亞群數(shù)量也逐漸減少，且MIC 與MNIC 比值大于8，異質(zhì)性耐藥亞群的發(fā)生頻率也均大于等于1×10-7(表2)。其中圖2A 中銅綠假單胞菌ATCC27853 的MIC/MNIC 值為4，判定為CAZ 敏感菌株；臨床分離株P(guān)AS96 的MIC 值大于32 μg·mL-1，且在藥物濃度為128 μg·mL-1時(shí)，仍保持穩(wěn)定生長(zhǎng)，判定為CAZ 耐藥菌株；臨床分離株P(guān)AS56 的MIC/MNIC 值為32，判定為CAZ 異質(zhì)性耐藥菌株；臨床分離株P(guān)AS81 的MIC/MNIC 值為16，判定為CAZ 異質(zhì)性耐藥菌株；圖2B 中臨床分離株P(guān)AS73 的MIC/MNIC 值為64，判定為CAZ 異質(zhì)性耐藥菌株；臨床分離株P(guān)AS95 的MIC/MNIC 值為32，判定為CAZ 異質(zhì)性耐藥菌株。這4 株(PAS56、PAS73、PAS81、PAS95)異質(zhì)性耐藥菌株的MIC 值均表現(xiàn)為CAZ 敏感，而PAP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示一部分亞群細(xì)胞對(duì)CAZ 耐藥。當(dāng)耐藥發(fā)生頻率大于10-7時(shí)，將抗生素濃度最高的平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)除以對(duì)照(無(wú)抗生素)平板上的菌落數(shù)，計(jì)算得到本次這4 株菌株的異質(zhì)性耐藥亞群的發(fā)生頻率范圍為1×10-7～1.2×10-5。

圖2 6 株銅綠假單胞菌對(duì)頭孢他啶的菌落譜型分析曲線(xiàn)圖Fig.2 Population analysis profiling curves of 6 P.aeruginosa strains to CAZ

表2 4 株銅綠假單胞菌頭孢他啶異質(zhì)性耐藥菌株的菌落譜型分析結(jié)果Tab.2 Population analysis profiles results of 4 P.aeruginosa heteroresistance to CAZ

2.4 異質(zhì)性耐藥菌株的適應(yīng)成本

生長(zhǎng)曲線(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示，圖3A 中異質(zhì)性耐藥菌株(親本菌株)PAS56 與其兩株P(guān)AP 實(shí)驗(yàn)中最高CAZ 濃度平板上的耐藥亞群在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(4～12 h)的生長(zhǎng)速率均沒(méi)有表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PAS56-1(P=0.079 4)、PAS56-3(P=0.084 3))，但同樣從PAP 實(shí)驗(yàn)中最高濃度平板上分離的耐藥亞群(記作PAS56-2)則比親本菌株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(4～8 h)的生長(zhǎng)速率明顯慢許多，有極顯著差異(P=0.007 7)，而在9～12 h 時(shí)則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.059 6)，從整體來(lái)看，生長(zhǎng)速率并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；圖3B 中PAS95 與3 株P(guān)AP 實(shí)驗(yàn)中最高CAZ 濃度平板上的耐藥亞群在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率(4～12 h) 均表現(xiàn)為有極顯著差異(P＜0.01) (PAS95-1(P=1.4E-7)、PAS95-2(P=3.2E-7)、PAS95-3(P=5.8E-7))，3 株耐藥亞群在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率與親本菌株相比明顯快許多，并且親本菌株的細(xì)菌總量相對(duì)較少。本結(jié)果表明異質(zhì)性耐藥菌株的耐藥亞群的生長(zhǎng)速率與親本菌株相比沒(méi)有顯著差異。

圖3 銅綠假單胞菌頭孢他啶異質(zhì)性耐藥菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.3 Growth curve of P.aeruginos heteroresistance to CAZ

2.5 異質(zhì)性耐藥菌株的耐藥穩(wěn)定性

將PAP 實(shí)驗(yàn)中最高CAZ 濃度平板上生長(zhǎng)的的耐藥亞群接種在無(wú)抗生素的平板上連續(xù)傳代50 代后，每5 代進(jìn)行1 次MIC 值的測(cè)定，結(jié)果如表3 所示。PAS56 親本菌株經(jīng)微量肉湯稀釋實(shí)驗(yàn)測(cè)定MIC 為4 μg·mL-1，其耐藥亞群(PAS56-1、PAS56-2、PAS56-3)的初始MIC 為32 μg·mL-1，耐藥亞群的MIC 值是親本菌株的8 倍。經(jīng)過(guò)在不含抗生素的平板傳代50 代后，PAS56-1 和PAS56-2 亞群的MIC 值一直保持在32 μg·mL-1，未發(fā)生CAZ 敏感性回復(fù)。耐藥亞群PAS56-3 的MIC 值在10-15 代左右由32 μg·mL-1回復(fù)為16 μg·mL-1，并且在后續(xù)傳代過(guò)程中MIC 值保持在16 μg·mL-1，是親本菌株的4 倍，回復(fù)為CAZ 中介。PAS95 親本菌株的MIC 經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定為4 μg·mL-1，其耐藥亞群(PAS95-1、PAS95-2、PAS95-3)的初始MIC 均為32 μg·mL-1，耐藥亞群MIC 是親本菌株的8 倍，在經(jīng)過(guò)50 代傳代后，PAS95-1、PAS95-2、PAS95-3 的MIC 均保持在32 μg·mL-1，CAZ 敏感性未發(fā)生回復(fù)。結(jié)果表明，除PAS56-3 亞群分離株CAZ 敏感性傳代后回復(fù)為中介，其他亞群分離株P(guān)AS56-1、PAS56-2、PAS95-1、PAS95-2、PAS95-3 傳代后耐藥亞群的CAZ 敏感性均未發(fā)生回復(fù)，耐藥表型穩(wěn)定。

表3 銅綠假單胞菌頭孢他啶異質(zhì)性耐藥菌株耐藥穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Tab.3 Resistance stability test of P.aeruginos heteroresistance to CAZ

3 討論

本研究基于藥敏實(shí)驗(yàn)(K-B test)并結(jié)合微量肉湯稀釋法對(duì)臨床分離的PA 進(jìn)行異質(zhì)性耐藥菌株的初篩，50 株P(guān)A 中有37 株對(duì)CAZ 敏感，占比74%(37/50)；1 株對(duì)CAZ 中介，占比2%(1/50)；12 株對(duì)CAZ 耐藥，占比24%(12/50)。其中，37 株CAZ 敏感菌株有20 株初步判定為異質(zhì)性耐藥，占比40%(20/50)。吳婷婷[28]研究發(fā)現(xiàn)PA 對(duì)頭孢他啶(CAZ)藥敏紙片的耐藥率為23.5%，與本研究結(jié)果一致。本研究通過(guò)對(duì)初篩結(jié)果中的異質(zhì)性耐藥菌株進(jìn)行菌落譜型分析驗(yàn)證，顯示PA 對(duì)CAZ 的異質(zhì)性耐藥率為8%(4/50)。本研究PA 對(duì)CAZ 異質(zhì)性耐藥率低于許磊[29]研究中PA 對(duì)多粘菌素的異質(zhì)性耐藥率35%(7/20)，略低于吳婷婷[28]研究中PA 對(duì)亞胺培南的異質(zhì)性耐藥率11.6%(36/310)，且明顯低于何建春[30]研究中PA 對(duì)亞胺培南和美羅培南的異質(zhì)性耐藥率(54.3%，72.5%)，以及JIA Xiaojiong,et al[31]研究中PA 對(duì)頭孢吡肟的異質(zhì)性耐藥率(57.3%)。本課題組選用這50 株P(guān)A 對(duì)哌拉西林異質(zhì)性耐藥進(jìn)行研究，研究發(fā)現(xiàn)PA 對(duì)哌拉西林的異質(zhì)性耐藥率為26%(13/50)，表明同一PA 可能對(duì)不同抗生素產(chǎn)生異質(zhì)性耐藥率不同[32]。篩選到的異質(zhì)性耐藥菌株的比例差異與多種因素有關(guān)，如實(shí)驗(yàn)菌株的來(lái)源、抗生素的種類(lèi)以及檢測(cè)異質(zhì)性耐藥菌株的實(shí)驗(yàn)方法的不同等。本研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)K-B 法初篩的異質(zhì)性耐藥率與PAP 實(shí)驗(yàn)后確證的異質(zhì)性耐藥率相差較大，因此不能將K-B 法的結(jié)果作為臨床使用的標(biāo)準(zhǔn)，需結(jié)合K-B 和PAP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行綜合判定。前人也發(fā)現(xiàn)使用K-B 法以及Etest 法這2 種方法檢測(cè)異質(zhì)性耐藥菌株仍存在較高的假陰性率，導(dǎo)致異質(zhì)性耐藥菌株的漏檢[33]。K-B 法以及E-test 法兩種方法判斷是否為異質(zhì)性耐藥菌的依據(jù)都是通過(guò)裸眼觀(guān)察藥敏紙片所形成的抑菌圈內(nèi)是否有菌落生長(zhǎng)。此類(lèi)方法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)于臨床上來(lái)說(shuō)操作簡(jiǎn)單快捷，結(jié)果判定一目了然；但其缺點(diǎn)是國(guó)際上目前對(duì)異質(zhì)性耐藥菌株的判斷沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)，只能通過(guò)主觀(guān)方面進(jìn)行判斷，抑菌圈內(nèi)的耐藥亞群的發(fā)生頻率不能準(zhǔn)確計(jì)算，而且由于菌株對(duì)抗生素敏感性可能存在的差異性而導(dǎo)致異質(zhì)性耐藥菌株的漏檢。目前菌群譜型分析法(PAP)被認(rèn)為是判斷異質(zhì)性耐藥細(xì)菌的金標(biāo)準(zhǔn)[19]，但是該方法的缺點(diǎn)也十分明顯，實(shí)驗(yàn)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)且操作繁瑣，只適合在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)施，不適用于臨床上的快速檢測(cè)。

4 株異質(zhì)性耐藥菌株經(jīng)過(guò)PAP 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，其耐藥亞群少數(shù)能在大于不抑制絕大多數(shù)群體生長(zhǎng)的最高藥物濃度8 倍以上的抗生素平板上生長(zhǎng)，極少數(shù)亞群甚至發(fā)展為高水平的耐藥。本次4 株異質(zhì)性耐藥菌株耐藥亞群的發(fā)生頻率為1×10-7～1.2×10-5。POURNARAS,et al[34]研究中指出PA 對(duì)亞胺培南和美羅培南這兩種碳青霉烯類(lèi)抗生素異質(zhì)性耐藥耐藥亞群的發(fā)生頻率為1.2×10-7～6.9×10-5。吳婷婷[35]研究中臨床分離的PA 對(duì)亞胺培南異質(zhì)性耐藥的發(fā)生頻率介于4.5×10-9與8.9×10-7之間。許磊[29]研究發(fā)現(xiàn)PA 對(duì)多粘菌素的異質(zhì)性耐藥的發(fā)生頻率范圍為3.5×10-7～2×10-6。與本研究結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，PA 對(duì)CAZ 異質(zhì)性耐藥的發(fā)生頻率相對(duì)較高。課題組研究發(fā)現(xiàn)PA 對(duì)哌拉西林異質(zhì)性耐藥亞群的發(fā)生頻率為7.3×10-7～1.2×10-5[32]，與本研究結(jié)果相近。有研究指出異質(zhì)性耐藥細(xì)菌中表現(xiàn)為高耐藥性的亞群在無(wú)抗生素作用下培養(yǎng)5～10 代后，有少數(shù)亞群仍保持高耐藥性，絕大多數(shù)亞群回復(fù)為敏感且保持異質(zhì)性耐藥特性[36]。而本研究對(duì)挑取的高水平耐藥亞群進(jìn)行無(wú)抗生素傳代50 代培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其耐藥表型可以保持穩(wěn)定遺傳，即高水平耐藥亞群保持高水平耐藥，低水平耐藥亞群保持低水平耐藥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PA 對(duì)CAZ 異質(zhì)性耐藥的菌株極易發(fā)展為完全耐藥菌株。PAS95 親本菌株與其3 個(gè)耐藥亞群在生長(zhǎng)速率上表現(xiàn)出極顯著差異，耐藥亞群生長(zhǎng)速率均大于親本菌株，且其耐藥穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明耐藥亞群保持高水平耐藥。高耐藥性亞群的穩(wěn)定遺傳將對(duì)臨床上抗生素的抗菌效果產(chǎn)生影響，其機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

本研究中所有的樣本均來(lái)自臨床分離，數(shù)量有限，研究可能具有一定的局限性。從以上分析可以看出，PA 對(duì)CAZ 的異質(zhì)性耐藥率相對(duì)較低，但其耐藥亞群的高耐藥性可以穩(wěn)定遺傳，極易發(fā)展成完全耐藥菌株，應(yīng)當(dāng)引起重視。異質(zhì)性耐藥菌株在臨床上不易檢出，常規(guī)藥敏實(shí)驗(yàn)中常表現(xiàn)為“假敏感”，導(dǎo)致用藥失效，進(jìn)而發(fā)展為耐藥菌株。由于目前臨床上還沒(méi)有實(shí)用的方法來(lái)準(zhǔn)確檢測(cè)出異質(zhì)性耐藥菌株，因此開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)方法是當(dāng)務(wù)之急。本研究在PA 對(duì)CAZ 異質(zhì)性耐藥表型等方面做了一定的探究，在后續(xù)工作中將對(duì)其異質(zhì)性耐藥機(jī)制進(jìn)行深入研究，為相關(guān)臨床感染治療提供一些有效的依據(jù)。