陳華靈，葉明彬，謝子強，肖寶華，廖寶林，王付民，王少鋒，姜怡薇

(1.廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)管理局，廣東惠州 516359；2.廣東海洋大學深圳研究院，廣東深圳 518108；3.深圳市碧海藍天海洋科技有限公司，廣東深圳 518108)

綠海龜Chelonia mydas是一種古老的海洋生物，分布在熱帶和亞熱帶海域，是最常見的海龜種類[1]。研究指出，在自然環(huán)境中綠海龜具有強烈的產(chǎn)卵洄游特性，成年雌性海龜會準確地找回其出生地并進行繁殖產(chǎn)卵活動[2-3]。隨著時間的推移，種群之間會產(chǎn)生強烈的遺傳差異，尤其是在母系遺傳的線粒體基因(mtDNA)上[4]。隨著分子標記技術的發(fā)展，分子標記技術廣泛應用于海洋生物的種群遺傳結構和遺傳多樣性分析[5-6]。國外學者也通過相關分子標記技術開展了綠海龜種群結構、聯(lián)通性和區(qū)域系統(tǒng)地理學等研究。20世紀90 年代，BOWEN,et al[2]通過研究綠海龜線粒體基因型提出，綠海龜種群有2 個主要的地理種群，一個為大西洋-地中海地理種群，另一個為印度-太平洋地理種群。此后，許多學者對大西洋、地中海、印度洋、西太平洋、中太平洋和東太平洋等相對較小距離上的綠海龜?shù)牡乩碜V系和種群結構進行研究，并表明在不同海區(qū)的綠海龜種群中，有限的基因流動與偶然的長距離擴散事件是一種常見的現(xiàn)象[7-10]。

綠海龜是在我國分布的5 種海龜中種群數(shù)量最多的物種，也是唯一一種在我國華南沿岸筑巢產(chǎn)卵的海龜，從我國山東到南海海域均有分布，現(xiàn)為我國一級保護動物[11-13]。由于受到漁業(yè)捕獲、非法貿(mào)易、產(chǎn)卵地生境破壞和海洋污染等威脅，我國綠海龜種群在過去幾十年中嚴重衰退[11]。因此了解我國綠海龜種質資源和遺傳多樣性現(xiàn)狀是開展綠海龜種群保護和開展人工繁育的必要理論基礎。近年來，國內包括香港、臺灣地區(qū)的學者紛紛對我國綠海龜種群結構及其遺傳多樣性開展調查研究。楊文嘉[14]利用D-loop 在內的多種分子標記對中國南海海域的175 只綠海龜遺傳多樣性進行了遺傳多樣性研究，初步探究了我國南海綠海龜種群遺傳結構。魏文芝[11]采取問卷調查、實地調查和線粒體DNA 分子標記技術對中國南海綠海龜資源進行研究，結果顯示我國南海海域的綠海龜種群具有較高水平的遺傳多樣性。香港城市大學NG,et al[13]采集來自香港、廣東和臺灣海域的110 只綠海龜樣品，獲取了線粒體DNA 控制區(qū)的基因序列和單倍型信息，對其繁殖種群的遺傳多樣性進行了探究，并與整個東太平洋和東南亞海域的綠海龜種群聯(lián)系進行了分析和討論。

廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)是目前我國大陸近岸唯一的綠海龜產(chǎn)卵地，自20 世紀80 年代成立保護區(qū)以來，開展了大量的綠海龜種質資源保護工作，并在國內首次人工繁育出綠海龜子代[15-16]。近10 年來，國內雖然已有基于分子標記的南海綠海龜生物多樣性研究報道[13-14]，但僅集中于較小范圍內的地理種群研究。本研究利用D-loop 序列部分片段作為分子標記，對廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)、粵西海域和海南三沙海域綠海龜群體的遺傳多樣性進行比對，為探究我國綠海龜種群遺傳多樣性和開展綠海龜種質資源保護奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與基因組總DNA 的提取

本研究所采集的綠海龜?shù)慕M織樣本均來自廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)救護或洄游產(chǎn)卵孵化的野生綠海龜，其中包括從海南三沙(七連嶼)海域救護綠海龜樣本25 個(編號S)、廣東粵西(硇洲島、東海島至徐聞一帶)海域救護的綠海龜樣本26 個(編號I)、廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)(巽寮灣、平海和港口)海域救護或洄游綠海龜產(chǎn)卵孵化的綠海龜樣本81 個(編號X)，共計132 個樣本。采集樣品的綠海龜均為活體，剪取綠海龜前肢量上皮組織并保存在無水乙醇中，用安多福溶液對傷口消毒處理。記錄樣品編號及對應的電子芯片號，用北京擎科生物科技有限公司生產(chǎn)的動物基因組DNA 提取試劑盒(TSP201-200)提取海龜DNA，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR 擴增與測序分析

D-loop 基因的PCR 引物參照NORMAN,et al[17]的研究。上下游引物序列分別為TCR-5：TTGTACATC TACTTATTTACCAC(5′-3′)和TCR-6：GTAAGTAAAACTACCGTATGCCAGGTTA(5′-3′)。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR 反應體系的反應總體積50 μL：1.1×T3 Super PCR Mix(擎科生物)47 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL。PCR 反應條件：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。將擴增好的PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(2 μL 樣品+6 μL溴酚藍)，300 V 電壓下12 min，獲取鑒定膠圖，通過膠圖確定擴增條件是否單一，是否彌散，有無非特異性條帶。選取擴增質量較高的PCR 產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進行測序，獲得測序峰圖和堿基序列。

1.3 序列分析

測序獲得的堿基序列使用MEGA 6.0 軟件統(tǒng)計序列的堿基組成與含量、堿基信息位點數(shù)量，計算遺傳距離，并構建基于K2-P 的鄰位連接(neighbor-joining,NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹。采用DnaSP 5.10 軟件統(tǒng)計變異位點位置，單倍型分布等，采用Arlequin 3.1 軟件計算Fst值、Nm值、Tajima′s D 和Fu′s Fs中性檢驗以及進行AMOVA 分析。應用DNAsp 軟件與PopART 1.7 軟件單倍型中介連接網(wǎng)絡(median-joining)分析。

2 結果與分析

2.1 序列多態(tài)性分析

本研究擴增獲得了132 條D-loop 基因序列，排序去除兩端冗余序列后得到堿基片段在336～388 bp之間，絕大部分的堿基片段在384 bp 以上。在這132 條D-loop 基因序列中T、C、A 和G 堿基的平均含量分別為35.6%、14.4%、32.6%、17.4%，其中A+T 含量(68.2%)明顯高于C+G 含量(31.8%)，堿基組成具有明顯的偏向性(表1)。

表1 3 個地理群體D-loop 基因片段的堿基組成比例Tab.1 The nucleotide percentage composition of the D-loop fragments in 3 populations

2.2 群體遺傳多樣性及單倍型分析

在132 條D-loop 基因序列中，共檢測出32 個變異位點，總單倍型多樣性為0.779，總核苷酸多樣性為0.007 55；各群體的單倍型多樣性(Hd)在0.157～0.775 之間，核苷酸多樣性(π)在0.000 63～0.010 17 之間(表2)。根據(jù)GRANT,et al[18]的研究報道，種群單倍型多樣性及核苷酸多樣性臨界值分別為0.5 和0.005，二者的值越大，群體的多樣性程度越高。本研究的三沙地理群體(S)內的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均未超過臨界值，表明其群體內的遺傳多樣性程度較低；粵西地理群體(I)的單倍型多樣性大于0.5，而核苷酸多樣性小于0.005，表明其群體內遺傳多樣性程度一般；廣東惠東國家級海龜保護區(qū)群體(X)的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均超過臨界值，表明其群體內的遺傳多樣性程度較高。以132 個樣本為1 個總群體來算，其種群單倍型多樣性和核苷酸多樣性均超臨界值，總群體的遺傳多樣性程度較高。

表2 3 個綠海龜群體D-loop 基因的遺傳多樣性指數(shù)Tab.2 Genetic diversity index based on D-loop sequences of 3 populations in C.mydas

在132 條D-loop 基因序列中共檢測出19 個單倍型，其中共享單倍型有7 個(Hap_1、Hap_3、Hap_4、Hap_5、Hap_6、Hap_7 和Hap_9)。從單倍型網(wǎng)絡圖(圖1)可以看出，Hap_3 和Hap_5 作為中心向其他單倍型發(fā)散，其單倍型出現(xiàn)的頻率也是最高的2 個，分別為31.06%和33.33%。各單倍型之間的突變步數(shù)1～14 步不等。三沙地理群體(S)包含了Hap_4、Hap_5 和Hap_10 這3 種單倍型，粵西地理群體(I)包含了Hap_1、Hap_3、Hap_4、Hap_5、Hap_6、Hap_7、Hap_8 和Hap_9 這8 種單倍型，廣東惠東國家級海龜保護區(qū)群體(X)包含了除Hap_4、Hap_8 和Hap_10 之外的所有16 種單倍型。通過在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)上進行的序列比對，并查閱DUTTON，et al[19]、JENSEN，et al[20]和楊文嘉[14]有關印度-太平洋地區(qū)綠海龜單倍型分類研究的結果，本研究獲得的單倍型對應的相同的序列及對應的單倍型如表3 所示。其中Hap_10、Hap_14 以及Hap_19 這3 個單倍型在NCBI 上比對不到完全相同的序列。Hap_18 的單倍型序列與楊文嘉的研究報道中CmC8 一致，其余的15 種單倍型序列信息與DUTTON,et al[19]和JENSEN,et al[20]的研究報道中的相關15 種單倍型信息一致。

表3 19 個綠海龜單倍型與其他學者研究對比情況Tab.3 The 19 haplotypes of C.mydas were compared with other studies

圖1 基于D-loop 基因序列的3 個綠海龜群體單倍型網(wǎng)絡中介圖Fig.1 Median-joining network based on D-loop sequences of 3 populations in C.mydas

2.3 遺傳分化和基因流

從群體間的遺傳分化結果（表4）可以看出，S 和I 群體間的Fst值最大，S 和X 群體間的Fst值其次、且大于0.15，I 和X 間的Fst值最小、且小于0.05。群體遺傳分化系數(shù)(Fst)是一個衡量群體間遺傳分化程度的參數(shù)：Fst＜0.05 表示分化較小，0.05＜Fst＜0.15 表示中等分化，0.15＜Fst＜0.25 表示高度分化，0.25＜Fst＜1.00 表示極高度分化[21]。基因流Nm值顯示S、I、X 這3 個群體之間存在基因交流現(xiàn)象。從3 個群體的種群AMOVA 分子變異結果分析，群體的遺傳變異主要來自群體內，占比達到88.3%，群體內的占比僅為11.7%(表5)。本研究3 個群體間存在一定的分化，三沙群體和其他2 個群體存在高度的分化，粵西群體和海龜保護區(qū)群體存在較小的分化。

表4 基于D-loop 基因的群體間Fst(對角線下)和Nm 值(對角線上)Tab.4 The Fst and Nm value based on D-loop sequences

表5 3 個群體D-loop 序列的種群AMOVA 分析Tab.5 The AMOVA analysis of D-loop sequences in 3 populations

2.4 基于Tajima′s D 和Fu′s Fs 的綠海龜群體中性檢測分析

從3 個綠海龜群體的Tajima′sD和Fu′sFs中性檢測分析結果來看(表6)，3 個群體的Tajima′sD和Fu′sFs中性檢測D值均為負值，三沙地理群體(S)的Tajima′sD和Fu′sFs中性檢測P值均小于0.05，粵西地理群體(I)的Tajima′sD的P值大于0.05 而Fu′sFs的P值大于0.05，廣東惠東國家級海龜保護區(qū)群體(X)的Tajima′sD和Fu′sFs中性檢測P值均大于0.05。Tajima′sD和Fu′sFs中性檢測結果說明三沙群體可能經(jīng)歷過快速種群擴張。

表6 3 個綠海龜群體的Tajima′s D 和Fu′s Fs 中性檢測值Tab.6 Neutrality tests of 3 populations in C.mydas

2.5 基于D-loop 序列片段對綠海龜群體和單倍型的系統(tǒng)進化分析

以棱皮龜Dermochelys coriacea作為外源種(GenBank 序列號：AF121964.1)，采用鄰位連接法(neighborjoining,NJ)構建3 個綠海龜?shù)乩砣后w共的D-loop 系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結果顯示3 個群體的綠海龜存在較為復雜的交叉聚類現(xiàn)象。132 個樣本的系統(tǒng)發(fā)育樹主要分為3 個大的分支，其中第1 大分支包含了3 個群體共125 個樣本，第2 大分支包含了廣東惠東國家級海龜保護區(qū)群體(X)的6 個樣本，第3 個分支僅含有廣東惠東國家級海龜保護區(qū)群體(X)的1 個樣本。同時根據(jù)19 個單倍型的D-loop 序列和棱皮龜?shù)男蛄胁捎绵徫贿B接法構建了單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類情況也與132 個樣本的系統(tǒng)發(fā)育樹的結果相互對應，一共分為3 大分支，其中Hap_11 單獨為一支(分支Ⅲ)，Hap_2、Hap_15、Hap_16 和Hap_17 聚為分支II，其余的14 個單倍型聚為分支I。

圖2 利用132 個樣品的D-loop 序列數(shù)據(jù)構建的分子系統(tǒng)進化NJ樹Fig.2 The neighbor-joining tree constructed with D-loop gene sequence of 132 samples

圖3 利用19 個單倍型D-loop 序列數(shù)據(jù)構建的分子系統(tǒng)進化NJ樹Fig.3 The neighbor-joining tree constructed with D-loop gene sequence of 19 haplotypes

3 討論

物種群體遺傳多樣性是評估地理區(qū)域內物種種質資源豐富度和現(xiàn)狀的重要指標，也是開展物種保護和人工繁育的基礎[21-22]。本研究通過檢測群體單倍型數(shù)量、單倍型多樣性和核苷酸多樣性3 個指標來對3個綠海龜?shù)乩砣后w的遺傳多樣性進行評估分析。其中3 個綠海龜?shù)乩砣后w132 個樣本共定義了19 個單倍型，其中三沙、粵西和惠東海龜保護區(qū)的群體單倍型數(shù)量分別為3、7 和16 個，總單倍型多樣性為0.779，總核苷酸多樣性為0.007 55。NG,et al[13]在香港、廣東惠東海龜保護區(qū)和臺灣海域共采集110 只綠海龜并檢測出27 個單倍型，其中廣東惠州海龜國家級自然保護區(qū)檢測出CmP19 和CmP49 2 種單倍型；魏文芝[11]對采集于三沙的51 個野生綠海龜樣品的D-loop 序列進行分析，共定義了14 個單倍型，總單倍型多樣性為0.818，總核苷酸多樣性為0.007 72。楊文嘉[14]對采集于海南島附近的綠海龜樣本進行D-loop 序列擴增，獲得91 個D-loop 序列共定義了8 個單倍型，總單倍型多樣性為0.45，總核苷酸多樣性為0.003 5。JENSEN曾研究了全球4 878 只海龜?shù)倪z傳多樣性，共統(tǒng)計出144 種單倍型，群體平均單倍型多樣性為0.420，平均核苷酸多樣性為0.009 3[20]。綜合國內的相關報道，地處西太平洋的華南沿岸和南海海域的綠海龜群體，單倍型多樣性水平高于全球平均值，具有較高的生物多樣性水平。

目前，主流的綠海龜系統(tǒng)演化觀點仍遵循著20 世紀末BOWEN,et al[2]提出的2 大地理種群學說，并由后續(xù)全球各地區(qū)學者對較小地理區(qū)域的種群結構和譜系進行深入研究。但由于缺乏對D-loop 單倍型命名的標準協(xié)議，全球已報道的綠海龜D-loop 單倍型就有700 多個，其中出現(xiàn)了大量的重復現(xiàn)象[20]。因此為了方便我們研究對比討論，本研究主要以DUTTON,et al[19]和JENSEN,et al[20]的研究報道中以CmP 命名的印度-太平洋種群的單倍型數(shù)據(jù)作為參考。JENSEN,et al[20]通過收集全球127 個產(chǎn)卵地的4 878 個綠海龜樣本的mtDNA 數(shù)據(jù)集，對種群的聯(lián)通性和基因流動障礙進行了深入的研究，并通過D-loop 序列在2 大地理種群的基礎上細分了11 個綠海龜線粒體DNA 分支譜系。本研究的3 個群體的19 個單倍型，其構建的系統(tǒng)進化樹的3 大分支與JENSEN,et al[20]研究成果中的Ⅲ、Ⅶ和Ⅷ這3 個分支譜系是相互契合的。而在JENSEN,et al[20]的研究報道中，本研究對應相同的單倍型包含了西太平洋中部、西太平洋南部、日本、印度-太平洋、西南印度洋、西北印度洋等不同地理區(qū)域的綠海龜個體，也從側面說明華南沿岸和南海海域這個較小地理范圍內的綠海龜與整個印度-太平洋大區(qū)的綠海龜具有種群連通性。

不同群體間的遺傳分化系數(shù)Fst值和基因流Nm值反映了其分化狀況的程度,但國內對我國南海海域和華南沿岸兩大區(qū)域內的綠海龜遺傳分化方面的研究仍鮮有報道。本研究的3 個地理群體間存在一定的遺傳分化現(xiàn)象，三沙和粵西2 個野生地理群體與廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)群體之間的Fst值分別為0.171 7 和0.043 4，三沙地理群體與粵西地理群體之間的Fst值為0.194 8。南海海域的綠海龜群體與華南沿岸綠海龜群體的Fst值均大于0.15，屬于高度分化的水平。由于綠海龜是一種洄游性海洋生物，在覓食、繁殖和海流等因素作用下，其遷徙活動的范圍十分廣袤。葉明彬等[23]采用衛(wèi)星追蹤的手段對惠東幼年海龜?shù)匿в我?guī)律及覓食地選擇進行研究，發(fā)現(xiàn)在惠東產(chǎn)卵的海龜在東海和南海之間作季節(jié)性定向洄游，覓食活動足跡主要沿我國華南沿岸一直到粵西再到越南沿岸。本研究的遺傳分化結果也側面說明了粵西地區(qū)由于地處惠東海龜洄游路線上，其地理群體與惠東海龜保護區(qū)群體存在更近的親緣關系。

我國華南沿岸和南海海域是位于整個西太平洋綠海龜?shù)乩砘顒拥慕裹c位置，是西北太平洋、西南太平洋、中太平洋等多個地理譜系綠海龜洄游的交界區(qū)域，從遺傳育種的角度看，在該地區(qū)開展綠海龜?shù)倪z傳雜交育種有利于提升本地區(qū)海龜品種的遺傳多樣性水平。近年來，廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)開展了大量綠海龜人工繁育的技術研究，并在國內首次全人工繁育出綠海龜子代[15-16]。本研究的綠海龜總體樣本具有較高的遺傳多樣性水平，尤其是廣東惠東綠海龜保護區(qū)圈養(yǎng)的綠海龜群體具有豐富的遺傳多樣性，其單倍型數(shù)據(jù)可為該保護區(qū)綠海龜人工選育工作提供指導依據(jù)。

4 小結

本研究對3 個綠海龜?shù)乩砣汗?32 個綠海龜?shù)木€粒體D-loop 基因部分序列進行了擴增、測序及分析，結果表明：3 個綠海龜?shù)乩砣后w的D-loop 基因片段序列的A+T 含量為68.2%，堿基組成具有明顯的偏向性。132 個樣本共定義了19 個單倍型，單倍型多樣性在0.157～0.775 之間，核苷酸多樣性在0.000 63～0.010 17 之間，本研究的綠海龜總體樣本具有較高的遺傳多樣性。3 個群體間存在一定的分化，其中三沙群體和其他2 個群體存在高度的分化，粵西群體和海龜保護區(qū)圈養(yǎng)群體存在較小的分化，3 個群體之間存在基因交流現(xiàn)象。采用鄰位連接法(NJ)對132 個序列片段和19 個單倍型分別構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，3 個群體的綠海龜存在較為復雜的交叉聚類現(xiàn)象，19 個單倍型聚類為3 個大的分支。