陳華靈，葉明彬，謝子強，肖寶華，廖寶林，王付民，王少鋒，姜怡薇

(1.廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)管理局，廣東惠州 516359；2.廣東海洋大學深圳研究院，廣東深圳 518108；3.深圳市碧海藍天海洋科技有限公司，廣東深圳 518108)

綠海龜Chelonia mydas是一種古老的海洋生物，分布在熱帶和亞熱帶海域，是最常見的海龜種類[1]。研究指出，在自然環(huán)境中綠海龜具有強烈的產(chǎn)卵洄游特性，成年雌性海龜會準確地找回其出生地并進行繁殖產(chǎn)卵活動[2-3]。隨著時間的推移，種群之間會產(chǎn)生強烈的遺傳差異，尤其是在母系遺傳的線粒體基因(mtDNA)上[4]。隨著分子標記技術(shù)的發(fā)展，分子標記技術(shù)廣泛應(yīng)用于海洋生物的種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析[5-6]。國外學者也通過相關(guān)分子標記技術(shù)開展了綠海龜種群結(jié)構(gòu)、聯(lián)通性和區(qū)域系統(tǒng)地理學等研究。20世紀90 年代，BOWEN,et al[2]通過研究綠海龜線粒體基因型提出，綠海龜種群有2 個主要的地理種群，一個為大西洋-地中海地理種群，另一個為印度-太平洋地理種群。此后，許多學者對大西洋、地中海、印度洋、西太平洋、中太平洋和東太平洋等相對較小距離上的綠海龜?shù)牡乩碜V系和種群結(jié)構(gòu)進行研究，并表明在不同海區(qū)的綠海龜種群中，有限的基因流動與偶然的長距離擴散事件是一種常見的現(xiàn)象[7-10]。

綠海龜是在我國分布的5 種海龜中種群數(shù)量最多的物種，也是唯一一種在我國華南沿岸筑巢產(chǎn)卵的海龜，從我國山東到南海海域均有分布，現(xiàn)為我國一級保護動物[11-13]。由于受到漁業(yè)捕獲、非法貿(mào)易、產(chǎn)卵地生境破壞和海洋污染等威脅，我國綠海龜種群在過去幾十年中嚴重衰退[11]。因此了解我國綠海龜種質(zhì)資源和遺傳多樣性現(xiàn)狀是開展綠海龜種群保護和開展人工繁育的必要理論基礎(chǔ)。近年來，國內(nèi)包括香港、臺灣地區(qū)的學者紛紛對我國綠海龜種群結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性開展調(diào)查研究。楊文嘉[14]利用D-loop 在內(nèi)的多種分子標記對中國南海海域的175 只綠海龜遺傳多樣性進行了遺傳多樣性研究，初步探究了我國南海綠海龜種群遺傳結(jié)構(gòu)。魏文芝[11]采取問卷調(diào)查、實地調(diào)查和線粒體DNA 分子標記技術(shù)對中國南海綠海龜資源進行研究，結(jié)果顯示我國南海海域的綠海龜種群具有較高水平的遺傳多樣性。香港城市大學NG,et al[13]采集來自香港、廣東和臺灣海域的110 只綠海龜樣品，獲取了線粒體DNA 控制區(qū)的基因序列和單倍型信息，對其繁殖種群的遺傳多樣性進行了探究，并與整個東太平洋和東南亞海域的綠海龜種群聯(lián)系進行了分析和討論。

廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)是目前我國大陸近岸唯一的綠海龜產(chǎn)卵地，自20 世紀80 年代成立保護區(qū)以來，開展了大量的綠海龜種質(zhì)資源保護工作，并在國內(nèi)首次人工繁育出綠海龜子代[15-16]。近10 年來，國內(nèi)雖然已有基于分子標記的南海綠海龜生物多樣性研究報道[13-14]，但僅集中于較小范圍內(nèi)的地理種群研究。本研究利用D-loop 序列部分片段作為分子標記，對廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)、粵西海域和海南三沙海域綠海龜群體的遺傳多樣性進行比對，為探究我國綠海龜種群遺傳多樣性和開展綠海龜種質(zhì)資源保護奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與基因組總DNA 的提取

本研究所采集的綠海龜?shù)慕M織樣本均來自廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)救護或洄游產(chǎn)卵孵化的野生綠海龜，其中包括從海南三沙(七連嶼)海域救護綠海龜樣本25 個(編號S)、廣東粵西(硇洲島、東海島至徐聞一帶)海域救護的綠海龜樣本26 個(編號I)、廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)(巽寮灣、平海和港口)海域救護或洄游綠海龜產(chǎn)卵孵化的綠海龜樣本81 個(編號X)，共計132 個樣本。采集樣品的綠海龜均為活體，剪取綠海龜前肢量上皮組織并保存在無水乙醇中，用安多福溶液對傷口消毒處理。記錄樣品編號及對應(yīng)的電子芯片號，用北京擎科生物科技有限公司生產(chǎn)的動物基因組DNA 提取試劑盒(TSP201-200)提取海龜DNA，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 PCR 擴增與測序分析

D-loop 基因的PCR 引物參照NORMAN,et al[17]的研究。上下游引物序列分別為TCR-5：TTGTACATC TACTTATTTACCAC(5′-3′)和TCR-6：GTAAGTAAAACTACCGTATGCCAGGTTA(5′-3′)。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系的反應(yīng)總體積50 μL：1.1×T3 Super PCR Mix(擎科生物)47 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。將擴增好的PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(2 μL 樣品+6 μL溴酚藍)，300 V 電壓下12 min，獲取鑒定膠圖，通過膠圖確定擴增條件是否單一，是否彌散，有無非特異性條帶。選取擴增質(zhì)量較高的PCR 產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進行測序，獲得測序峰圖和堿基序列。

1.3 序列分析

測序獲得的堿基序列使用MEGA 6.0 軟件統(tǒng)計序列的堿基組成與含量、堿基信息位點數(shù)量，計算遺傳距離，并構(gòu)建基于K2-P 的鄰位連接(neighbor-joining,NJ)系統(tǒng)發(fā)育樹。采用DnaSP 5.10 軟件統(tǒng)計變異位點位置，單倍型分布等，采用Arlequin 3.1 軟件計算Fst值、Nm值、Tajima′s D 和Fu′s Fs中性檢驗以及進行AMOVA 分析。應(yīng)用DNAsp 軟件與PopART 1.7 軟件單倍型中介連接網(wǎng)絡(luò)(median-joining)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列多態(tài)性分析

本研究擴增獲得了132 條D-loop 基因序列，排序去除兩端冗余序列后得到堿基片段在336～388 bp之間，絕大部分的堿基片段在384 bp 以上。在這132 條D-loop 基因序列中T、C、A 和G 堿基的平均含量分別為35.6%、14.4%、32.6%、17.4%，其中A+T 含量(68.2%)明顯高于C+G 含量(31.8%)，堿基組成具有明顯的偏向性(表1)。

表1 3 個地理群體D-loop 基因片段的堿基組成比例Tab.1 The nucleotide percentage composition of the D-loop fragments in 3 populations

2.2 群體遺傳多樣性及單倍型分析

在132 條D-loop 基因序列中，共檢測出32 個變異位點，總單倍型多樣性為0.779，總核苷酸多樣性為0.007 55；各群體的單倍型多樣性(Hd)在0.157～0.775 之間，核苷酸多樣性(π)在0.000 63～0.010 17 之間(表2)。根據(jù)GRANT,et al[18]的研究報道，種群單倍型多樣性及核苷酸多樣性臨界值分別為0.5 和0.005，二者的值越大，群體的多樣性程度越高。本研究的三沙地理群體(S)內(nèi)的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均未超過臨界值，表明其群體內(nèi)的遺傳多樣性程度較低；粵西地理群體(I)的單倍型多樣性大于0.5，而核苷酸多樣性小于0.005，表明其群體內(nèi)遺傳多樣性程度一般；廣東惠東國家級海龜保護區(qū)群體(X)的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均超過臨界值，表明其群體內(nèi)的遺傳多樣性程度較高。以132 個樣本為1 個總?cè)后w來算，其種群單倍型多樣性和核苷酸多樣性均超臨界值，總?cè)后w的遺傳多樣性程度較高。

表2 3 個綠海龜群體D-loop 基因的遺傳多樣性指數(shù)Tab.2 Genetic diversity index based on D-loop sequences of 3 populations in C.mydas

在132 條D-loop 基因序列中共檢測出19 個單倍型，其中共享單倍型有7 個(Hap_1、Hap_3、Hap_4、Hap_5、Hap_6、Hap_7 和Hap_9)。從單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)可以看出，Hap_3 和Hap_5 作為中心向其他單倍型發(fā)散，其單倍型出現(xiàn)的頻率也是最高的2 個，分別為31.06%和33.33%。各單倍型之間的突變步數(shù)1～14 步不等。三沙地理群體(S)包含了Hap_4、Hap_5 和Hap_10 這3 種單倍型，粵西地理群體(I)包含了Hap_1、Hap_3、Hap_4、Hap_5、Hap_6、Hap_7、Hap_8 和Hap_9 這8 種單倍型，廣東惠東國家級海龜保護區(qū)群體(X)包含了除Hap_4、Hap_8 和Hap_10 之外的所有16 種單倍型。通過在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)上進行的序列比對，并查閱DUTTON，et al[19]、JENSEN，et al[20]和楊文嘉[14]有關(guān)印度-太平洋地區(qū)綠海龜單倍型分類研究的結(jié)果，本研究獲得的單倍型對應(yīng)的相同的序列及對應(yīng)的單倍型如表3 所示。其中Hap_10、Hap_14 以及Hap_19 這3 個單倍型在NCBI 上比對不到完全相同的序列。Hap_18 的單倍型序列與楊文嘉的研究報道中CmC8 一致，其余的15 種單倍型序列信息與DUTTON,et al[19]和JENSEN,et al[20]的研究報道中的相關(guān)15 種單倍型信息一致。

表3 19 個綠海龜單倍型與其他學者研究對比情況Tab.3 The 19 haplotypes of C.mydas were compared with other studies

圖1 基于D-loop 基因序列的3 個綠海龜群體單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖Fig.1 Median-joining network based on D-loop sequences of 3 populations in C.mydas

2.3 遺傳分化和基因流

從群體間的遺傳分化結(jié)果（表4）可以看出，S 和I 群體間的Fst值最大，S 和X 群體間的Fst值其次、且大于0.15，I 和X 間的Fst值最小、且小于0.05。群體遺傳分化系數(shù)(Fst)是一個衡量群體間遺傳分化程度的參數(shù)：Fst＜0.05 表示分化較小，0.05＜Fst＜0.15 表示中等分化，0.15＜Fst＜0.25 表示高度分化，0.25＜Fst＜1.00 表示極高度分化[21]?；蛄鱊m值顯示S、I、X 這3 個群體之間存在基因交流現(xiàn)象。從3 個群體的種群AMOVA 分子變異結(jié)果分析，群體的遺傳變異主要來自群體內(nèi)，占比達到88.3%，群體內(nèi)的占比僅為11.7%(表5)。本研究3 個群體間存在一定的分化，三沙群體和其他2 個群體存在高度的分化，粵西群體和海龜保護區(qū)群體存在較小的分化。

表4 基于D-loop 基因的群體間Fst(對角線下)和Nm 值(對角線上)Tab.4 The Fst and Nm value based on D-loop sequences

表5 3 個群體D-loop 序列的種群AMOVA 分析Tab.5 The AMOVA analysis of D-loop sequences in 3 populations

2.4 基于Tajima′s D 和Fu′s Fs 的綠海龜群體中性檢測分析

從3 個綠海龜群體的Tajima′sD和Fu′sFs中性檢測分析結(jié)果來看(表6)，3 個群體的Tajima′sD和Fu′sFs中性檢測D值均為負值，三沙地理群體(S)的Tajima′sD和Fu′sFs中性檢測P值均小于0.05，粵西地理群體(I)的Tajima′sD的P值大于0.05 而Fu′sFs的P值大于0.05，廣東惠東國家級海龜保護區(qū)群體(X)的Tajima′sD和Fu′sFs中性檢測P值均大于0.05。Tajima′sD和Fu′sFs中性檢測結(jié)果說明三沙群體可能經(jīng)歷過快速種群擴張。

表6 3 個綠海龜群體的Tajima′s D 和Fu′s Fs 中性檢測值Tab.6 Neutrality tests of 3 populations in C.mydas

2.5 基于D-loop 序列片段對綠海龜群體和單倍型的系統(tǒng)進化分析

以棱皮龜Dermochelys coriacea作為外源種(GenBank 序列號：AF121964.1)，采用鄰位連接法(neighborjoining,NJ)構(gòu)建3 個綠海龜?shù)乩砣后w共的D-loop 系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示3 個群體的綠海龜存在較為復雜的交叉聚類現(xiàn)象。132 個樣本的系統(tǒng)發(fā)育樹主要分為3 個大的分支，其中第1 大分支包含了3 個群體共125 個樣本，第2 大分支包含了廣東惠東國家級海龜保護區(qū)群體(X)的6 個樣本，第3 個分支僅含有廣東惠東國家級海龜保護區(qū)群體(X)的1 個樣本。同時根據(jù)19 個單倍型的D-loop 序列和棱皮龜?shù)男蛄胁捎绵徫贿B接法構(gòu)建了單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類情況也與132 個樣本的系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果相互對應(yīng)，一共分為3 大分支，其中Hap_11 單獨為一支(分支Ⅲ)，Hap_2、Hap_15、Hap_16 和Hap_17 聚為分支II，其余的14 個單倍型聚為分支I。

圖2 利用132 個樣品的D-loop 序列數(shù)據(jù)構(gòu)建的分子系統(tǒng)進化NJ樹Fig.2 The neighbor-joining tree constructed with D-loop gene sequence of 132 samples

圖3 利用19 個單倍型D-loop 序列數(shù)據(jù)構(gòu)建的分子系統(tǒng)進化NJ樹Fig.3 The neighbor-joining tree constructed with D-loop gene sequence of 19 haplotypes

3 討論

物種群體遺傳多樣性是評估地理區(qū)域內(nèi)物種種質(zhì)資源豐富度和現(xiàn)狀的重要指標，也是開展物種保護和人工繁育的基礎(chǔ)[21-22]。本研究通過檢測群體單倍型數(shù)量、單倍型多樣性和核苷酸多樣性3 個指標來對3個綠海龜?shù)乩砣后w的遺傳多樣性進行評估分析。其中3 個綠海龜?shù)乩砣后w132 個樣本共定義了19 個單倍型，其中三沙、粵西和惠東海龜保護區(qū)的群體單倍型數(shù)量分別為3、7 和16 個，總單倍型多樣性為0.779，總核苷酸多樣性為0.007 55。NG,et al[13]在香港、廣東惠東海龜保護區(qū)和臺灣海域共采集110 只綠海龜并檢測出27 個單倍型，其中廣東惠州海龜國家級自然保護區(qū)檢測出CmP19 和CmP49 2 種單倍型；魏文芝[11]對采集于三沙的51 個野生綠海龜樣品的D-loop 序列進行分析，共定義了14 個單倍型，總單倍型多樣性為0.818，總核苷酸多樣性為0.007 72。楊文嘉[14]對采集于海南島附近的綠海龜樣本進行D-loop 序列擴增，獲得91 個D-loop 序列共定義了8 個單倍型，總單倍型多樣性為0.45，總核苷酸多樣性為0.003 5。JENSEN曾研究了全球4 878 只海龜?shù)倪z傳多樣性，共統(tǒng)計出144 種單倍型，群體平均單倍型多樣性為0.420，平均核苷酸多樣性為0.009 3[20]。綜合國內(nèi)的相關(guān)報道，地處西太平洋的華南沿岸和南海海域的綠海龜群體，單倍型多樣性水平高于全球平均值，具有較高的生物多樣性水平。

目前，主流的綠海龜系統(tǒng)演化觀點仍遵循著20 世紀末BOWEN,et al[2]提出的2 大地理種群學說，并由后續(xù)全球各地區(qū)學者對較小地理區(qū)域的種群結(jié)構(gòu)和譜系進行深入研究。但由于缺乏對D-loop 單倍型命名的標準協(xié)議，全球已報道的綠海龜D-loop 單倍型就有700 多個，其中出現(xiàn)了大量的重復現(xiàn)象[20]。因此為了方便我們研究對比討論，本研究主要以DUTTON,et al[19]和JENSEN,et al[20]的研究報道中以CmP 命名的印度-太平洋種群的單倍型數(shù)據(jù)作為參考。JENSEN,et al[20]通過收集全球127 個產(chǎn)卵地的4 878 個綠海龜樣本的mtDNA 數(shù)據(jù)集，對種群的聯(lián)通性和基因流動障礙進行了深入的研究，并通過D-loop 序列在2 大地理種群的基礎(chǔ)上細分了11 個綠海龜線粒體DNA 分支譜系。本研究的3 個群體的19 個單倍型，其構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹的3 大分支與JENSEN,et al[20]研究成果中的Ⅲ、Ⅶ和Ⅷ這3 個分支譜系是相互契合的。而在JENSEN,et al[20]的研究報道中，本研究對應(yīng)相同的單倍型包含了西太平洋中部、西太平洋南部、日本、印度-太平洋、西南印度洋、西北印度洋等不同地理區(qū)域的綠海龜個體，也從側(cè)面說明華南沿岸和南海海域這個較小地理范圍內(nèi)的綠海龜與整個印度-太平洋大區(qū)的綠海龜具有種群連通性。

不同群體間的遺傳分化系數(shù)Fst值和基因流Nm值反映了其分化狀況的程度,但國內(nèi)對我國南海海域和華南沿岸兩大區(qū)域內(nèi)的綠海龜遺傳分化方面的研究仍鮮有報道。本研究的3 個地理群體間存在一定的遺傳分化現(xiàn)象，三沙和粵西2 個野生地理群體與廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)群體之間的Fst值分別為0.171 7 和0.043 4，三沙地理群體與粵西地理群體之間的Fst值為0.194 8。南海海域的綠海龜群體與華南沿岸綠海龜群體的Fst值均大于0.15，屬于高度分化的水平。由于綠海龜是一種洄游性海洋生物，在覓食、繁殖和海流等因素作用下，其遷徙活動的范圍十分廣袤。葉明彬等[23]采用衛(wèi)星追蹤的手段對惠東幼年海龜?shù)匿в我?guī)律及覓食地選擇進行研究，發(fā)現(xiàn)在惠東產(chǎn)卵的海龜在東海和南海之間作季節(jié)性定向洄游，覓食活動足跡主要沿我國華南沿岸一直到粵西再到越南沿岸。本研究的遺傳分化結(jié)果也側(cè)面說明了粵西地區(qū)由于地處惠東海龜洄游路線上，其地理群體與惠東海龜保護區(qū)群體存在更近的親緣關(guān)系。

我國華南沿岸和南海海域是位于整個西太平洋綠海龜?shù)乩砘顒拥慕裹c位置，是西北太平洋、西南太平洋、中太平洋等多個地理譜系綠海龜洄游的交界區(qū)域，從遺傳育種的角度看，在該地區(qū)開展綠海龜?shù)倪z傳雜交育種有利于提升本地區(qū)海龜品種的遺傳多樣性水平。近年來，廣東惠東海龜國家級自然保護區(qū)開展了大量綠海龜人工繁育的技術(shù)研究，并在國內(nèi)首次全人工繁育出綠海龜子代[15-16]。本研究的綠海龜總體樣本具有較高的遺傳多樣性水平，尤其是廣東惠東綠海龜保護區(qū)圈養(yǎng)的綠海龜群體具有豐富的遺傳多樣性，其單倍型數(shù)據(jù)可為該保護區(qū)綠海龜人工選育工作提供指導依據(jù)。

4 小結(jié)

本研究對3 個綠海龜?shù)乩砣汗?32 個綠海龜?shù)木€粒體D-loop 基因部分序列進行了擴增、測序及分析，結(jié)果表明：3 個綠海龜?shù)乩砣后w的D-loop 基因片段序列的A+T 含量為68.2%，堿基組成具有明顯的偏向性。132 個樣本共定義了19 個單倍型，單倍型多樣性在0.157～0.775 之間，核苷酸多樣性在0.000 63～0.010 17 之間，本研究的綠海龜總體樣本具有較高的遺傳多樣性。3 個群體間存在一定的分化，其中三沙群體和其他2 個群體存在高度的分化，粵西群體和海龜保護區(qū)圈養(yǎng)群體存在較小的分化，3 個群體之間存在基因交流現(xiàn)象。采用鄰位連接法(NJ)對132 個序列片段和19 個單倍型分別構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，3 個群體的綠海龜存在較為復雜的交叉聚類現(xiàn)象，19 個單倍型聚類為3 個大的分支。