早在19世紀中葉，人們就認識到芳香化合物單體在香氣貢獻中的重要作用，并開始采用化學法進行合成，從而代替一些稀有的或者昂貴的天然香料，但是直到20世紀才實現(xiàn)合成香料的大規(guī)模生產(chǎn)。苯甲醛是最早合成的重要芳香物質之一。

苯甲醛是自然界存在的結構最簡單的，同時也是工業(yè)上最常用的芳香醛，常常被形容為具有特殊的杏仁香氣或者櫻桃香味。它廣泛存在于多個科屬植物的花、果實和葉片中，具有吸引昆蟲授粉者和抑制真菌生長等作用。

盡管被廣泛用作商業(yè)食品調味品和工業(yè)溶劑，苯甲醛的主要用途仍是用于合成從醫(yī)藥品到塑料添加劑的各種其他化合物，也是生產(chǎn)香水、香料和合成某些苯胺染料的重要中間產(chǎn)物。

一般來說，苯甲醛主要通過化學合成和天然提取獲得，天然提取又包括植物和動物來源。當前主要的制備途徑為甲苯的液態(tài)氯化或氧化。已經(jīng)被淘汰的制備方法包括苯甲醇的不完全氧化、苯甲酰氯的堿解和苯與一氧化碳的加成?；瘜W合成具有環(huán)境不友好、反應條件復雜等很多缺點。

“苯甲醛也可由昆蟲、非昆蟲節(jié)肢動物和微生物產(chǎn)生，而相對于動物來源，植物生產(chǎn)苯甲醛的優(yōu)勢在于潛在的產(chǎn)量巨大，生產(chǎn)過程相對便利，對生產(chǎn)條件要求不高，容易實現(xiàn)綠色環(huán)保生產(chǎn)，且植物提取產(chǎn)品直接用于食品工業(yè)的安全性和附加價值較高，消費者非常容易接受?！秉S惺祺表示。

多年以來，研究者只知道植物中的苯甲醛由苯丙氨酸合成而來，但是直接合成苯甲醛的酶基因一直沒有被克隆到。不少研究組從多組織、多時間點的轉錄組入手進行相關性分析，試圖篩選到一些候選基因并驗證功能，但是都沒有成功。

2022年2月，發(fā)表在《自然·通訊》期刊上的一項研究成功解析了苯甲醛在植物中的生物合成途徑。

文章的第一作者黃惺祺博士2007年考入南京大學，本科畢業(yè)后，繼續(xù)在南大生科院盧山教授實驗室進行研究生學習，并于2018年獲得博士學位。之后他前往普渡大學從事博士后研究工作，在農學院生化系娜塔麗婭·都達瑞娃教授的領導下，研究植物揮發(fā)物次生代謝及調控。

黃惺祺

01 解析苯甲醛在植物中的合成途徑

為了吸引傳粉者，矮牽牛花會在夜間合成并釋放大量含有苯環(huán)的揮發(fā)性有機化合物，其中，苯甲醛的含量為第二高。目前一般認為苯甲醛可以通過肉桂酸的β氧化或者非β氧化途徑合成而來，黃惺祺和合作者首先利用同位素標記法，證明了在矮牽牛中苯甲醛通過肉桂酸的β氧化途徑合成。

“理論上，通過β氧化機理合成苯甲醛最簡單的方式是直接將苯甲酰輔酶A還原成苯甲醛，于是我們嘗試用矮牽?；ò甑鞍状痔嵛餀z測苯甲醛合酶的活性。幸運的是，我們測試的第一種輔酶NADPH正是苯甲醛合酶利用的還原劑，這樣一來，就確定了矮牽牛苯甲醛合酶的兩個底物是苯甲酰輔酶A和還原型輔酶II?！秉S惺祺表示。

盡管相關性分析在過去五到十年中幫助鑒定到了大量的次生代謝基因，依然存在很多代謝步驟尚未得到解析。黃惺祺他們決定利用團隊發(fā)現(xiàn)的底物和反應條件進行酶純化。

矮牽?；ㄖ刑烊籔hBS的部分純化

黃惺祺指出，酶純化正是該研究中阻力最大的一步。這個酶在前期實驗中表現(xiàn)出了極高的體外酶活，因此盡管苯甲醛是矮牽?；ㄏ阒泻康诙叩幕衔?，但與其他花香合成酶不同，直接負責合成苯甲醛的酶在總蛋白中的比例卻很低，因此前期的幾次純化都沒有鑒定到正確的基因?！拔覀兺ㄟ^不斷提高起始植物材料的用量并優(yōu)化純化方法，才能在蛋白膠上看到對應的條帶?！?/p>

“最終我們從大約400朵矮牽?；ɑò曛屑兓蕉鄠€具有苯甲醛合酶活性的組分，并通過蛋白質譜鑒定，最終鎖定兩個具有NADPH結合結構域的候選蛋白。由于這兩個蛋白的分子量之和剛好接近于矮牽牛花瓣苯甲醛合酶的表觀分子量（通過凝膠阻滯色譜測定），拿到這個結果時我們高度懷疑這兩個蛋白就是我們要找的酶，它們可能通過形成異源二聚體發(fā)揮功能?！秉S惺祺說道。

后續(xù)的體外和體內實驗進一步驗證了他們的猜想，即這兩個蛋白單獨存在時沒有苯甲醛合酶活性，只有在形成異源二聚體時才具有酶活，并且這個異源二聚體酶負責了矮牽?；ㄖ兄饕谋郊兹┖铣赏?。

另外，團隊還通過體外酶活證明，這兩個亞基在其他物種中的同源蛋白，包括擬南芥、番茄和扁桃，同樣通過組成異源二聚體形成有活性的苯甲醛合酶，并且物種間的α和β亞基之間絕大多數(shù)也能形成有功能的異源二聚體，說明異源二聚體酶可能是進化過程中相對保守的合成苯甲醛的方式。

植物細胞中絕大多數(shù)生化反應都由單基因編碼的酶催化，異源二聚體酶參與代謝的情況屈指可數(shù)?！氨竟ぷ麒b定到的異源二聚體苯甲醛合酶，很可能是第一個鑒定到的參與植物揮發(fā)物次生代謝的酶，這提示我們植物的次生代謝很可能比我們之前預想的要更加復雜?！?/p>

黃惺祺從中得到的啟示是，未來遇到任何難以通過相關性分析鑒定的代謝步驟，思路不能局限在單基因這個層面，很有可能再次出現(xiàn)異源二聚體甚至多酶復合體的情境。

針對這一研究，限于文章的篇幅和側重點，仍然留有不少疑問，例如兩個亞基是否都有催化活性？還是只有其中一個亞基具有催化活性？亦或是兩個亞基共同組成酶活性中心？兩個亞基形成二聚體的結構基礎是什么？有哪些關鍵氨基酸參與了蛋白之間的相互作用？

對此，黃惺祺表示，“這些疑問只能通過結構生物學的數(shù)據(jù)來揭示。目前正在與合作實驗室共同解析矮牽牛苯甲醛合酶的蛋白晶體結構?！?/p>

02 在實際生產(chǎn)中意義重大

目前食品香精行業(yè)使用的苯甲醛主要由半化學合成方法生產(chǎn)，天然來源的苯甲醛在實際應用中的占比很低。傳統(tǒng)的天然來源苯甲醛主要通過苦杏仁苷水解產(chǎn)生，但這種方法獲得的苯甲醛通常有少量有毒化合物氫氰酸污染，很難去除干凈。

植物合成苯甲醛也存在類似的困難或者劣勢。較高濃度的苯甲醛對細胞存在明顯的毒性，很難在胞內積累到很高的濃度。植物細胞會將苯甲醛氧化成苯甲酸或者還原成苯甲醇以降低細胞毒性，苯甲酸和苯甲醇則可以很容易發(fā)生糖基化衍生儲存起來并進一步降低毒性。此外由于苯甲醛本身的揮發(fā)性較高，當合成代謝非常旺盛時也可能通過揮發(fā)逸散發(fā)生損失。

植物中苯甲醛的生物合成途徑

據(jù)黃惺祺介紹，“通過異源二聚體苯甲醛合酶合成苯甲醛，沒有任何有毒有害副產(chǎn)物生成，可以放心地用作食品工業(yè)的風味添加劑，該生物合成途徑還可能通過基因轉移到酵母或其他微生物中，成為廣泛用于食品和飲料生產(chǎn)的發(fā)酵過程?！?/p>

同時，該研究還有一個重要的潛在利用方向。鑒于植物細胞中很容易發(fā)生苯甲醛的還原反應生成苯甲醇，且苯甲醇可以進一步糖基化衍生后大量存儲在細胞中，該方法也可以作為天然來源苯甲醇的生產(chǎn)方法。

“事實上本項研究中，僅僅通過驗證性質地在煙草葉片中瞬時轉化矮牽牛苯甲醛合成通路基因，并聯(lián)合伺喂苯丙氨酸底物，就可以輕松獲得大約140微克/克鮮重的苯甲醇產(chǎn)量，如果以產(chǎn)量為首要目標進行深度合成生物學優(yōu)化，完全可能在煙草葉片中獲得更高的產(chǎn)量?！?/p>