劉 霞 孔華庭 張繼超 諸 穎

1（中國科學院上海應(yīng)用物理研究所中國科學院微觀界面物理與探測重點實驗室 上海201800）

2（中國科學院上海高等研究院基礎(chǔ)交叉研究中心張江實驗室上海光源 上海201210）

3（中國科學院大學 北京100049）

生物實驗中，表面活性劑［1］在免疫染色［2-4］或者組織透明化［5-7］中發(fā)揮著重要的作用。在免疫染色過程中，它能溶解細胞膜中的脂類物質(zhì)，提高細胞膜的通透性，促進大分子物質(zhì)（單克隆抗體）快速滲透到細胞質(zhì)內(nèi)與抗原結(jié)合，提高染色效率。最近開發(fā)的CLARITY 組織透明化技術(shù)［8-9］，是在不顯著改變組織天然結(jié)構(gòu)的前提下，通過有效去除脂質(zhì)，將厚的組織或完整的器官轉(zhuǎn)化為光學透明的凝膠狀樣品，從而可以對整個組織或器官進行光學成像。目前市面上的表面活性劑種類繁多，使用不同的表面活性劑將直接影響具體實驗的結(jié)果。因此，對實驗中常用的表面活性劑的細胞膜通透性能進行研究，篩選合適的表面活性劑和最佳處理時間具有重要的實驗價值和實用意義。

十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）［10］和聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）［3］是實驗室中常用的表面活性劑，能夠溶解脂質(zhì)雙分子層中的兩親性磷脂，從而增加細胞膜的通透性［9］，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)兩者在去脂的程度上有很大不同。本工作根據(jù)熒光染料對細胞膜的染色情況判斷細胞膜的通透程度，研究了SDS 與Triton X-100 在提高細胞膜通透作用方面的差異。如圖1 所示，在蛋白酶催化分子聚合［11］的實驗中，SDS與Triton X-100增加了細胞膜通透性，促進3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（3，3'-Diaminobenzidine，DAB）進入細胞并對線粒體進行染色。本工作研究了兩者在具體染色實驗中對蛋白酶活性和DAB 染色效果的影響。最后應(yīng)用合肥光源軟X射線納米顯微線站的全場透射成像技術(shù)研究了透膜前后細胞形態(tài)的變化。本工作有望為實驗中選擇合適的表面活性劑提供實驗基礎(chǔ)。

圖1 表面活性劑增加細胞膜通透性，促進DAB進入細胞并對線粒體進行染色的示意圖Fig.1 The schematic diagram of surfactant increasing cell membrane permeability,facilitating DAB entry into cells and staining mitochondria

1 實驗材料

1.1 主要儀器

離心機（5702）：德國Eppendorf 公司；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（3423）：美國Thermo Fisher Scientific 公司；超純水儀系統(tǒng)（Advantage A10）：美國Millipore公司；激光共聚焦熒光顯微鏡（Leica TCS sp8）：徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司；合肥同步輻射光源（National Synchrotron Radiation Laboratory，NSRL）。

1.2 實驗試劑

人宮頸癌細胞（Hela細胞）購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

SDS、多聚甲醛購自國藥集團化學試劑有限公司（上海）；Triton X-100、30%過氧化氫和DAB 購自Sigma-Aldrich 上海貿(mào)易有限公司；DiO 細胞膜綠色熒光探針、10×磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、青霉素-鏈霉素溶液（100×）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、Opti-MEM?減血清無酚紅培養(yǎng)基、MEM（Minimum Essential Medium）培養(yǎng)基購自美國GIBCO 公司；L-谷氨酰胺（L-Glu）、Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher公司；氮化硅窗口購自加拿大Norcada公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將HeLa 細胞培養(yǎng)于MEM 培養(yǎng)基中，其中MEM培養(yǎng)基中加有10%熱滅活FBS，100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素，4 mmol·L-1谷氨酰胺培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2恒溫恒濕細胞培養(yǎng)箱中。每兩天對細胞進行一次傳代，保證細胞穩(wěn)定生長。

2.2 SDS 與Triton X-100 透膜效果比較及透膜條件優(yōu)化

取對數(shù)生長期的HeLa細胞，以105個·mL-1的密度接種500μL 于底部是玻璃的35 mm 共聚焦小皿中，培養(yǎng)8~10 h（過夜），待貼壁后棄去培養(yǎng)液，用1×PBS 洗滌細胞3 次。加入4%多聚甲醛室溫避光固定20 min，再用1×PBS洗滌細胞3次。分別用4%濃度的SDS 或0.25%的Triton X-100 處理細胞2 min、5 min、10 min、15 min，再用1×PBS 洗滌細胞3 次。最后用5 μmol·L-1的DiO 細胞膜染料處理細胞15 min，1×PBS 洗滌后用激光共聚焦對樣品進行熒光成像，選取激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長501 nm。

2.3 表面活性劑對蛋白催化活性的影響

試管內(nèi)催化DAB 聚合反應(yīng)：對照組中0.5 mg·mL-1的DAB溶液中加入30%v/v的H2O2（終濃度為0.06%v/v），再加入5 mg·mL-1辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）蛋白（終濃度為0.05 mg·mL-1）。實驗組組中其中一組HRP 蛋白先用0.25% Triton X-100 處理10 min，再加入的DAB和H2O2。另一組的HRP 蛋白則先用4% SDS 處理10 min，再加入DAB 和H2O2，保持各組中試劑終濃度相同，觀察試管內(nèi)溶液的變化情況。

細胞內(nèi)催化DAB 聚合反應(yīng)：取對數(shù)生長期的HeLa細胞，以105個·mL-1的密度接種500μL于底部是玻璃的35 mm共聚焦小皿中，培養(yǎng)8~10 h（過夜），待貼壁后棄去培養(yǎng)液，用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒mito-APEX2，其中l(wèi)ipo 3000/p 3000/質(zhì)粒的v/v/w為0.75μL∶1μL∶500 ng，在培養(yǎng)箱中孵育24 h。一組用含Mg2+的預(yù)冷2%戊二醛固定細胞40 min，用預(yù)冷的1×PBS洗滌細胞3次，再用預(yù)冷的20 mmol·L-1的甘氨酸猝滅未反應(yīng)的戊二醛5 min，0.25%Triton X-100 對細胞進行透膜，再次用遇冷的1×PBS 清洗細胞，最后用0.5 mg·mL-1新鮮稀釋的DAB 和0.03%v/v的H2O2在預(yù)冷的1×PBS中染色1 min。另一組在甘氨酸反應(yīng)完，換用4%SDS 對細胞進行透膜處理后再進行DAB 染色。最后分別對兩組細胞的DAB染色情況進行共聚焦成像。

2.4 同步輻射X射線成像

選擇最佳的透膜條件對HeLa細胞進行透膜，利用合肥光源BL07W 軟X 射線納米顯微成像線站對透膜前后的細胞形態(tài)進行軟X 射線全場透射成像。軟X射線全場透射成像技術(shù)［12-14］是一種原位無損的成像技術(shù)，能在天然狀態(tài)下對整個完整的含水細胞進行成像，并提供樣本內(nèi)部結(jié)構(gòu)的信息，而無需任何染色、切片、脫水或包埋預(yù)處理［15-16］。合肥光源BL07W線站的光子能量范圍在260~800 eV之間，具有優(yōu)于30 nm 的高空間分辨能力。用SX-700 型單色器對多級扭擺磁體（Wiggler）出射的同步輻射光進行單色化，經(jīng)橢球毛細管聚焦鏡聚焦，直接照射在樣品上。X射線穿過樣品后，通過物鏡波帶片放大，透射信號被CCD探測器接收，從而獲得樣品的二維成像圖。成像視場為9.4 μm，通過運動電機的二維移動實現(xiàn)大樣品的馬賽克掃描和拼接，最終得到整個細胞的高分辨納米顯微圖像。細胞生長在氮化硅窗上，透膜干燥后放入樣品室中，真空環(huán)境下進行成像。成像條件：入射能量520 eV；成像步長9.4 μm×9.4 μm；單幅圖像成像時間1 s；成像尺寸65.8 μm×56.4 μm；單像素點尺寸9.9 nm，成像分辨率優(yōu)于30 nm。

3 實驗結(jié)果

3.1 SDS與Triton X-100透膜效果的比較

用DiO綠色熒光染料對不同處理條件的細胞進行細胞膜染色，根據(jù)熒光成像結(jié)果判斷不同表面活性劑的透膜效果。結(jié)果顯示：0.25%Triton X-100的透膜效果優(yōu)于4%SDS。如圖2（a）所示，用4%多聚甲醛固定細胞后，在不使用透膜試劑時，DiO細胞膜染料成功標記細胞膜，證明本實驗選用的染料能特異性指示細胞膜。用4%SDS 處理細胞后，細胞膜上的熒光呈現(xiàn)斷續(xù)的點狀，且能隱約看到細胞的輪廓位置，表明4% SDS 透膜程度不徹底（圖2（b））。用共聚焦顯微鏡觀察0.25%Triton X-100 處理后的細胞，圖像中僅顯示幾個特別亮的熒光點，看不出細胞的基本輪廓（圖2（c），箭頭標示細胞膜位置），實驗表明，選用4%SDS 和0.25%Triton X-100 對細胞均具有透膜效果，但0.25%Triton X-100的透膜效果顯著優(yōu)于4%SDS。

圖2 不同處理條件下的細胞膜熒光成像結(jié)果(a)4%多聚甲醛處理，(b)4%多聚甲醛和4%SDS處理，(c)4%多聚甲醛和0.25%Triton X-100處理Fig.2 Fluorescence imaging results of cell membrane under different treatment conditions(a)4%paraformaldehyde treatment,(b)4%paraformaldehyde fixation and 4%SDS treatment,(c)4%paraformaldehyde and 0.25%Triton X-100 treatment

3.2 Triton X-100透膜條件的優(yōu)化

為進一步優(yōu)化Triton X-100的最佳透膜條件，我們選擇不同的孵育時間（2 min、5 min、10 min、15 min），用0.25%Triton X-100 處理細胞，DiO 染料染色，通過共聚焦顯微鏡對細胞膜進行熒光成像。如圖3所示，當孵育時間小于10 min時，熒光成像圖中有很多明亮的點圍繞在細胞膜上，表明細胞透膜并未完全。當與細胞共孵育10 min 時，圖像中明亮的點基本消失，表明已達到良好的透膜效果。繼續(xù)增加孵育時間，成像效果并未改善。結(jié)果顯示：0.25%Triton X-100 的最佳透膜條件為與細胞共孵育10 min。

圖3 不同透膜條件下，細胞的共聚焦顯微鏡熒光成像圖，Triton X-100孵育時間分別為2 min(a)、5 min(b)、10 min(c)、15 min(d)Fig.3 Confocal microscopy fluorescence images of cells under different membrane-permeable conditions.The incubation time of Triton X-100,2 min(a),5 min(b),10 min(c),15 min(d)

3.3 SDS 與Triton X-100 對蛋白催化活性的影響

本課題組發(fā)展了一種X 射線遺傳編碼探針，能夠?qū)崿F(xiàn)對細胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)的內(nèi)源標記和原位納米分辨成像［11,17］，我們利用這一探針驗證Triton X-100和SDS 在具體實驗中的透膜效果和差異，并在試管和細胞層面研究了Triton X-100 和SDS 對過氧化物酶催化活性的影響。

在試管層面，選擇常用的辣根過氧化物酶HRP催化DAB聚合并觀察溶液的變化，研究表面活性劑對蛋白催化活性的影響。如圖4（a）所示，在對照組中，HRP可以在H2O2存在的條件下催化DAB單體產(chǎn)生聚合物，加入H2O2后，試管內(nèi)馬上有明顯的顏色變化，顏色由淺粉色變成棕黑色，放置10 min后，有明顯的顆粒狀沉淀產(chǎn)生。Triton X-100 組具有相同的顏色變化和顆粒狀沉淀產(chǎn)生，而SDS 組僅有顏色變化，沒有顆粒狀沉淀產(chǎn)生。結(jié)果表明：Triton X-100沒有改變HRP的催化活性，并成功催化DAB單體聚合產(chǎn)生沉淀，而SDS會使HRP變性而失去了催化活性，無法催化DAB生成明顯的沉淀。

在細胞層面，用轉(zhuǎn)染的mito-APEX2質(zhì)粒特異性靶向線粒體表達過氧化物酶APEX2，使其在細胞內(nèi)催化DAB 聚合并標記線粒體。如圖4（b）所示，用Triton X-100 透膜后的細胞，APEX2 活性很高，催化DAB在線粒體位置發(fā)生聚合反應(yīng)，細胞內(nèi)的線粒體被DAB成功標記。而用SDS透膜后的細胞，細胞內(nèi)未見DAB 聚合物，APEX2 蛋白失活。結(jié)果表明：Triton X-100并不會改變細胞內(nèi)APEX2蛋白的催化活性，而用SDS 進行細胞透膜時，會使蛋白發(fā)生變性失活，進而影響催化活性。

圖4 使用SDS與Triton X-100做表面活性劑對蛋白酶催化活性的影響(a)試管中HRP催化DAB聚合情況，左：對照，中：Triton X-100，右：SDS，(b)細胞中的APEX2催化DAB在線粒體上特異性聚合后的成像圖，左：Triton X-100，右：SDSFig.4 SDS and Triton X-100 used as the surfactants on the catalytic activity of protease(a)HRP catalyzes DAB polymerization in tubes,left:control,middle:Triton X-100,right:SDS,(b)The images of APEX2-catalyzed DAB specific polymerization on mitochondria in cells,left:Triton X-100,right:SDS

3.4 同步輻射X射線成像

為了研究透膜前后的細胞形態(tài)是否發(fā)生變化，我們使用合肥光源的BL07W 軟X 射線納米顯微線站的全場透射成像技術(shù)對透膜前后的細胞形態(tài)進行高分辨成像。如圖5 所示，Triton X-100 透膜處理后，細胞形態(tài)依舊完好，并未發(fā)生明顯變化。結(jié)果表明：Triton X-100透膜不會影響細胞的整體形貌。

圖5 透膜前后細胞的同步X射線成像結(jié)果(a)用4%多聚甲醛固定細胞，(b)用4%多聚甲醛固定細胞，并用0.25%Triton X-100透膜Fig.5 Synchrotron-based X-ray imaging results of cells before and after transmembrane(a)4%paraformaldehyde treatment,(b)4%paraformaldehyde fixation and 0.25%Triton X-100 treatment

4 結(jié)語

本工作研究了SDS 和Triton X-100 對細胞膜通透性的影響。細胞膜染色實驗結(jié)果顯示：0.25%Triton X-100 的透膜效果優(yōu)于4% SDS，且0.25%Triton X-100 與細胞的最優(yōu)共孵育時間為10 min。利用過氧化物酶催化DAB聚合實驗，在試管和細胞層面研究了Triton X-100 和SDS 對過氧化物酶催化活性的影響。結(jié)果顯示：SDS 會影響酶的催化活性進而影響染色效果，而Triton X-100不會影響酶的催化活性，染色結(jié)果很好。同步輻射高分辨成像結(jié)果也表明，用Triton X-100進行透膜不會顯著影響細胞的形態(tài)。這兩種表面活性劑透膜效果具有如此差別，內(nèi)在機制還需后續(xù)實驗進一步研究。本研究將為具體實驗中選擇合適的表面活性劑提供理論和實驗支持。

作者貢獻聲明劉霞：完成實驗主體部分；劉霞、孔華庭：進行同步X射線成像工作；劉霞、張繼超：撰寫文稿；張繼超：設(shè)計和指導實驗；諸穎：構(gòu)思文稿主體思路并全程指導文稿修改。