孫雅嘉， 孫九許， 燕夢云， 丁 凌， 裴凌鵬△

(1.中央民族大學(xué)藥學(xué)院， 北京 100081；2.民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100081)

骨折為常見的創(chuàng)傷性骨科疾病，我國各族人民在長期的生活實(shí)踐中，積累了豐富的關(guān)于骨折治療的中醫(yī)藥經(jīng)驗(yàn)[1，2]。隨著民族醫(yī)藥在國內(nèi)外關(guān)注度的不斷提升，深入挖掘、探索用于骨折治療的特效民族藥成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。水族是一個(gè)主要聚集在貴州、廣西以及云南的少數(shù)民族，已有兩千多年的歷史。水族醫(yī)藥吸收了中醫(yī)、苗醫(yī)、壯醫(yī)、瑤醫(yī)以及布依醫(yī)的醫(yī)藥特點(diǎn)，形成了具有本民族醫(yī)學(xué)特色和云貴高原藥物學(xué)特點(diǎn)的獨(dú)特醫(yī)藥體系[3]。風(fēng)流草又稱壯陽草、接骨草，水族藥名為“罵都領(lǐng)”，為水族習(xí)用治療骨折的特色藥材。其基源植物為豆科植物舞草Desmodiumgyrans(L.)DC.，全草均可入藥。據(jù)《水族骨傷醫(yī)藥》記載，其性味苦、平，歸肝腎經(jīng)，具有祛瘀生新、舒筋活絡(luò)、強(qiáng)壯筋骨的作用，主治風(fēng)濕骨痛、骨折等[4]。本實(shí)驗(yàn)通過測定風(fēng)流草黃酮治療對脛骨骨折大鼠脛骨中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、總膠原蛋白、羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)以及骨鈣骨磷含量的影響，探討風(fēng)流草黃酮對骨折愈合的修復(fù)作用。本研究通過中央民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)(批號ECMUC2019066AA)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級6周齡SD大鼠300只，體質(zhì)量(280±20)g，雌雄各半，購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，許可證號SCXK(京)2019-0011。動(dòng)物飼養(yǎng)于中央民族大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物房，室溫16～22 ℃, 濕度60%～75%, 明暗交替照射12 h/12 h, 不限制水及食物的攝入, 應(yīng)用常規(guī)鼠糧進(jìn)行喂養(yǎng)。

1.2 藥物

風(fēng)流草采自貴州黔南三都水族自治縣都柳江畔，樣本經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生藥系楊瑤珺教授鑒定為豆科植物舞草Desmodiumgyrans(L.)DC.，俗稱為風(fēng)流草。

1.3 主要試劑及儀器

乙腈(上海阿拉丁試劑有限公司,貨號A104442)；甲醇、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司,貨號34860、84082)；大孔吸附樹脂(天津農(nóng)業(yè)股份公司,貨號ADS-17)；ALP、OCN、Hyp、總膠原蛋白檢測試劑盒(南京建成，貨號A059-2-2、H152、A030-2-1、H142-1-1)。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)(日本Shimadzu公司，型號2030)；752分光光度計(jì)(美國Bio-Rad公司，型號Benchmark Plus)；高效液相色譜儀(美國Waters公司，型號E2695)；全自動(dòng)γ免疫計(jì)數(shù)器(上海融坤檢測設(shè)備有限公司，型號FJ-2003PS)。

1.4 風(fēng)流草黃酮制備

1.4.1 索氏提取流程 1 kg風(fēng)流草藥材曬干，粉碎過60目篩，用5 L濃度為70%的乙醇回流提取2次, 每次2 h，離心后過濾，上清經(jīng)大孔樹脂柱吸附分離，先用水洗脫再用乙醇洗脫，經(jīng)減壓濃縮、冰凍干燥后制成干粉。

1.4.2 刺老苞根皮黃酮鑒定 檢測樣品在HPLC中的保留時(shí)間(retention time，Rt)及紫外可見吸收光譜的特征峰峰面積，與一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品對照進(jìn)行鑒定，純度為95%。

1.5 造模、分組及給藥

根據(jù)給藥周期(4 d、7 d、14 d、21 d、28 d)隨機(jī)分為5大組，每大組60只；再將每大組按處理方式隨機(jī)分為對照組、模型組和風(fēng)流草黃酮低、中、高劑量組各12只。

1.5.1 模型建立 除對照組外，各組大鼠腹腔注射濃度為3 %的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，麻醉后固定，左下肢剃毛，皮膚消毒。使用無菌手術(shù)刀片自脛骨結(jié)節(jié)下端沿脛骨走行，對皮膚及皮下筋膜做長1 cm的縱行切口。剝開脛前肌暴露脛骨，在脛骨結(jié)節(jié)下方2 mm處，垂直于脛骨從外到內(nèi)打第1個(gè)孔，直徑0.18 mm，鉆透一側(cè)皮質(zhì)深達(dá)牙腔。再沿脛骨縱軸方向向下依次打2 個(gè)孔，相鄰孔間距為2 mm。經(jīng)無菌的0.9%氯化鈉溶液沖洗，滴1～2滴青霉素(20萬單位/mL)逐層縫合切口。

1.5.2 給藥及取材 風(fēng)流草黃酮高、中、低劑量組每日用風(fēng)流草黃酮灌胃1次，每次灌胃量分別為15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg，對照組和模型組灌服等量的0.9%氯化鈉溶液，分別于4 d、7 d、14 d、21 d和28 d處死大鼠，取出脛骨研磨后用于相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 Elisa法測定ALP活性、Hyp含量以及總膠原蛋白含量 參考Elisa試劑盒說明書方法，分別測定大鼠脛骨中ALP、Hyp和總膠原蛋白的水平[5]。

1.6.2 放射免疫法測定OCN含量 參考OCN檢測試劑盒說明書方法，測定大鼠脛骨中OCN含量。

1.6.3 ICP-MS測定骨鈣、骨磷含量 ICP-MS是以電感耦合等離子體為離子源，以質(zhì)譜儀為檢測器的無機(jī)元素分析技術(shù)。該儀器主要由樣品引入系統(tǒng)、離子源、接口部分、離子聚焦系統(tǒng)、質(zhì)量分析器和檢測系統(tǒng)6部分組成。將待分析的脛骨樣品經(jīng)灰化后制成白色骨粉，精確稱取50 mg用5% Merk級硝酸定重至50 mL PET塑料瓶中混勻，再將氣溶膠形式的樣品消解液引入儀器中進(jìn)行分析，檢測骨鈣、骨磷含量[6]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 骨ALP活性測定結(jié)果

表1示，與對照組比較，模型組大鼠骨ALP活性顯著降低 (P<0.01)。與模型組比較，風(fēng)流草黃酮不同劑量組骨ALP活性于7 d、14 d、21 d、28 d均有明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠脛骨堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性比較

2.2 骨Hyp含量測定結(jié)果

表2示，與對照組比較，模型組大鼠骨Hyp含量顯著降低 (P<0.01)。與模型組比較，風(fēng)流草黃酮不同劑量組骨Hyp含量于14 d、21 d、28 d均有明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠脛骨羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量比較

2.3 骨OCN含量測定結(jié)果

表3示，與對照組比較，模型組大鼠脛骨OCN含量顯著降低 (P<0.01)。與模型組比較，風(fēng)流草黃酮不同劑量組骨OCN含量于14 d、21 d、28 d均有明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠脛骨骨鈣素(osteocalcin,OCN)含量比較

2.4 骨總膠原蛋白含量測定結(jié)果

表4示，與對照組比較，模型組大鼠骨總膠原蛋白含量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，風(fēng)流草黃酮不同劑量組骨總膠原蛋白含量于14 d、21 d、28 d均有明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

表4 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠脛骨骨總膠原蛋白含量比較

2.5 骨鈣、骨磷含量測定結(jié)果

表5、6示，與對照組比較，模型組大鼠骨鈣、骨磷含量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，風(fēng)流草黃酮不同劑量組骨鈣、骨磷含量于14 d、21 d、28 d均有明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

表5 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠脛骨骨鈣含量比較

表6 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠脛骨骨磷含量比較

3 討論

在骨折愈合過程中，機(jī)體通過不同方面調(diào)控骨代謝[7-9]，從而促進(jìn)骨重建，加快骨損傷修復(fù)。骨由細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成。成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨細(xì)胞以及襯細(xì)胞構(gòu)成骨重建的基本多細(xì)胞單位，這些細(xì)胞成分在骨折愈合的骨重建過程中緊密耦聯(lián)，共同發(fā)揮作用，其中成骨細(xì)胞在骨重建過程中發(fā)揮多種重要作用。一方面，所有骨基質(zhì)的有機(jī)成分均由成骨細(xì)胞合成和分泌；另一方面，成骨細(xì)胞還影響骨基質(zhì)的礦化[10，11]，ALP和OCN密切參與這一過程。ALP主要通過水解磷酸酶從而為羥基磷灰石的沉積提供磷酸，同時(shí)可通過水解焦磷酸鹽促進(jìn)骨鹽形成，有利于成骨[12，13]。OCN則通過調(diào)節(jié)骨鈣以及定位羥基磷灰石來影響成骨過程[14]，兩者皆為骨折治療療效評價(jià)的重要指標(biāo)。骨基質(zhì)包括有機(jī)基質(zhì)和沉積其中的無機(jī)礦物質(zhì)，其中有機(jī)基質(zhì)主要由富含Hyp的骨膠原蛋白構(gòu)成，骨礦物質(zhì)則由無定形鈣磷混合物和結(jié)晶鈣磷羥基磷灰石構(gòu)成。骨膠原纖維構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與沉積其中的無機(jī)礦物質(zhì)使得骨基質(zhì)具備結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度上的完整性，骨骼因此呈現(xiàn)堅(jiān)硬的機(jī)械性能。骨折愈合過程中骨礦物元素鈣磷含量的保障，加上膠原蛋白的富集，可以增強(qiáng)骨折部位骨微結(jié)構(gòu)的重塑，將大大提高骨的韌性與抗變能力，從而有效促進(jìn)骨折的愈合[15]。水族醫(yī)藥骨傷理論較為樸素，認(rèn)為骨折愈合是骨折斷端間再連接的自然修復(fù)過程，是一個(gè)祛瘀、新生、骨合的過程[16]，風(fēng)流草為水族醫(yī)藥骨傷治療中較為常用的特色藥物[3]。課題組前期研究表明，風(fēng)流草總醇提物可以通過影響骨代謝，從而改善大鼠因D-半乳糖致衰老所誘發(fā)的骨質(zhì)變化[17]。同時(shí)還證實(shí)，風(fēng)流草總黃酮在體外可降低H2O2攝入而導(dǎo)致的成骨細(xì)胞氧化損傷，提高成骨細(xì)胞活力[18]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，風(fēng)流草黃酮對大鼠骨折愈合過程中的骨質(zhì)變化同樣具有改善作用。風(fēng)流草黃酮在治療大鼠脛骨骨折的過程中，可有效提高骨中總膠原蛋白和Hyp的含量，同時(shí)可通過增加骨中ALP和OCN的表達(dá)，提高骨基質(zhì)中骨鈣與骨磷的含量,提示風(fēng)流草黃酮可通過調(diào)節(jié)骨重建過程中成骨細(xì)胞的活性，從而促進(jìn)骨形成中類骨質(zhì)的形成及其礦化，進(jìn)而對此類骨折愈合修復(fù)產(chǎn)生良好的療效，但其具體分子調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。