李雯潔， 鞏子漢， 黃 穎△， 孫明杰

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心， 北京 100700；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所， 北京 100700)

缺血性卒中約占腦卒中的68%～80%，是全球?qū)е戮用袼劳龊椭職埖闹饕蛑籟1]，目前為我國居民死亡原因之首[2]?；謴?fù)缺血組織血液供應(yīng)是急性缺血性卒中治療的主要措施[3]，然而快速再灌注可損傷血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)，其主要病理機(jī)制為構(gòu)成BBB的重要部分腦微血管內(nèi)皮[4]功能障礙、通透性改變及炎性細(xì)胞因子異常[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Krüppel樣因子(krüppel-like factor，KLF)家族中的KLF2對維持血管內(nèi)皮完整性至關(guān)重要[6]，可以通過調(diào)控內(nèi)皮關(guān)鍵基因和蛋白質(zhì)，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能，因此KLF2被認(rèn)為是一種新型的腦卒中保護(hù)因子[7]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)作為調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮依賴性舒張功能相關(guān)因子，與調(diào)節(jié)凝血功能的血栓調(diào)節(jié)蛋白(Thrombomodulin)在腦缺血再灌注損傷(cerebral ischaemia-reperfusion injury，CIRI)中均發(fā)揮了重要作用[8，9]。研究KLF2及eNOS、Thrombomodulin在CIRI過程中的表達(dá)，對改善BBB功能、治療缺血性卒中具有重要意義。

三化湯出自金元時期劉完素所著《素問病機(jī)氣宜保命集·中風(fēng)論第十》，是治療腦卒中的經(jīng)典方劑，具有較好的臨床療效。三化湯以理氣藥與祛風(fēng)藥相伍，具有升降同調(diào)、內(nèi)外同治、祛風(fēng)理氣之效。方中大黃、厚樸、枳實斡旋中焦氣機(jī)；羌活作為祛風(fēng)藥清揚(yáng)升散、祛風(fēng)通絡(luò)，與大黃、枳實、厚樸相反相成，引導(dǎo)諸藥上行入腦發(fā)揮治療作用。研究證實，三化湯對CIRI大鼠腦組織具有保護(hù)作用[10，11]，可有效減輕缺血再灌注大鼠BBB損傷[12]，但其機(jī)制尚不明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，三化湯能顯著降低缺血再灌注大鼠腦組織梗死面積，對腦組織病理形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)具有改善作用[13]。本研究以血腦屏障通透性、腦微血管內(nèi)皮相關(guān)因子KLF2、Thrombomodulin、eNOS為切入點，闡明三化湯保護(hù)腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制，并進(jìn)一步探討祛風(fēng)藥羌活在三化湯中的配伍作用機(jī)制。本研究通過中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心倫理委員會批準(zhǔn)。

1 材料

1.1 動物

SPF級8周齡雄性SD大鼠150只，體質(zhì)量250～270 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房,溫度20～25 ℃，相對濕度40%～60%，12 h明/12 h暗，動物自由攝食攝水。

1.2 藥物及制備

三化湯由枳實20 g、厚樸20 g、大黃20 g、羌活20 g組成，原藥材均購自北京同仁堂(集團(tuán))有限責(zé)任公司。飲片加水浸泡30 min，武火沸騰后文火繼續(xù)煎煮30 min獲得水煎液，將藥材殘渣加水繼續(xù)煎煮，合并2次水煎液，濃縮至含生藥1 kg/L冷藏備用。三化湯去羌活組(簡稱去羌活組)去除羌活，煎煮方法同上。羌活組用藥為單味羌活，煎煮方法同上。尼莫地平片(國藥準(zhǔn)字H20043915，規(guī)格30 mg×50片，批號1902001)購于天津市中央藥業(yè)有限公司。

1.3 主要試劑及儀器

大鼠MCAO線栓(北京西濃科技有限公司，貨號2838-A4)；伊文思藍(lán)(evans blue，EB，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號E104208)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京索萊科技有限公司，貨號P1200)；一步法快速WB(HRP)試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號CW2029M)；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、mRNA擴(kuò)增試劑盒(普洛麥格生物技術(shù)有限公司，貨號A6002、A6010)；KLF2抗體(美國Raybiotech，貨號144-64418-100)；eNOS抗體(美國Cell Signaling Technology，貨號D9A5L)；Thrombomodulin一抗(英國Abcam，貨號ab187075)；GAPDH抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號bs-10900R)。

CFX Connect型熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)；DYCZ-40D型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；GADPH、KLF2、Thrombomodulin、eNOS引物由上海生工公司合成。

2 方法

2.1 分組與模型建立

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、造模組，造模組大鼠均采用Longa線栓法建立MCAO模型[14]。術(shù)前大鼠禁食不禁水12 h，1%戊巴比妥鈉溶液40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，備皮消毒頸部皮膚，暴露右側(cè)頸動脈三角，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA) 、頸外動脈(external carotid artery，ECA) 和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)。在近心端結(jié)扎CCA、ECA，用小動脈夾暫時夾閉 CCA 遠(yuǎn)心端近分叉部，在 CCA 近心端距分叉部4 mm處剪一小口，將帶有石蠟頭的栓線插入到 CCA，松開小動脈夾，從血管分叉處進(jìn)入 ICA，當(dāng)線栓插入深度距分叉處約18 mm時稍遇阻力即停止，于 CCA 遠(yuǎn)心端用細(xì)線結(jié)扎，用蘸有碘伏的醫(yī)用棉簽對內(nèi)部進(jìn)行消毒，縫合傷口后再消毒。術(shù)后觀察1.5 h，將栓線拔出約1 cm行再灌注。假手術(shù)組除不插入線栓外其余操作均與模型組相同。手術(shù)過程中盡量遵循無菌操作原則，造模后應(yīng)用Zea-Longa法對大鼠進(jìn)行評分，評分在1～3分者視為造模成功，納入后續(xù)實驗。將70只造模成功大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為模型組、尼莫地平組、去羌活組、羌活組、三化湯組，每組14只。

2.2 給藥

術(shù)后24 h，以體表面積比率換算法計算大鼠給藥量，尼莫地平組以尼莫地平溶于0.9%氯化鈉溶液灌胃，給藥劑量為0.0108 g/kg；三化湯組、去羌活組、羌活組分別給予相應(yīng)中藥水煎液灌胃，給藥劑量分別為7.2 g/kg、5.4 g/kg、1.8 g/kg。正常組、假手術(shù)組、模型組大鼠采用與給藥組相同體積的蒸餾水在相同時間點灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃5 d。

2.3 腦組織EB含量測定

末次灌胃后，用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠(40 mg/kg)。每組取8只大鼠，股靜脈注射2%EB溶液(4 mL/kg)，1.5 h后用0.9%氯化鈉溶液左心室灌注至右心耳流出澄清液體，斷頭取右側(cè)半腦梗死區(qū)大腦皮層，稱其濕重后加入甲酰胺中勻漿。離心取上清，用分光光度計檢測630 nm處的吸光度值。通過EB標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出上清液的EB濃度，依據(jù)公式計算腦組織中EB含量[15]。腦組織EB含量(ug/g)=浸泡腦組織的甲酰胺溶液體積(mL)×待測樣品中EB濃度(ug/mL)/腦組織重量(g)。

2.4 Western blot檢測腦梗死區(qū)KLF2、eNOS、Thrombomodulin蛋白的表達(dá)

將每組剩下的6只動物麻醉后斷頭處死，取各組大鼠梗死區(qū)腦組織稱重，正常組、假手術(shù)組參考《大鼠立體定位圖譜》選取視交叉至腦橋?qū)俅竽X中動脈供血區(qū)域取材。取大鼠腦組織100 mg，BCA法檢測總蛋白含量電泳、轉(zhuǎn)膜。采用康為一步法試劑盒進(jìn)行封閉孵育，Blocking Buffer室溫封閉5 min，洗膜后加入稀釋一抗GAPDH(1∶5000)，Thrombomodulin(1∶1000)，eNOS(1∶1000)，KLF2(1∶1000)室溫孵育45 min，洗膜10 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。ImageJ軟件計算各條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值計算樣品目的蛋白相對表達(dá)量。

2.5 熒光定量PCR檢測腦梗死區(qū)KLF2、eNOS及Thrombomodulin mRNA表達(dá)

取各組腦組織約30 mg，按照10∶1比例加入Trizol溶液，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2-△△Ct法計算目的基因相對表達(dá)水平，各檢測指標(biāo)引物由上海生工合成(見表1)。

表1 引物序列表

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠腦組織中EB含量比較

表2示，與正常組比較，模型組大鼠腦組織EB含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，三化湯組、羌活組、尼莫地平組大鼠腦組織EB含量均顯著降低(P<0.05)，去羌活組大鼠腦組織EB含量有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計意義。

表2 各組大鼠腦組織中伊文思藍(lán)(evans blue，EB)含量比較

3.2 各組大鼠腦梗死區(qū)KLF2、Thrombomo-dulin、eNOS蛋白表達(dá)比較

圖1表3示，與正常組比較，模型組大鼠腦組織KLF2表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，Thrombomodulin與eNOS表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型組比較，三化湯組、羌活組大鼠腦梗死區(qū)KLF2表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05，P<0.01)，三化湯組、羌活組和尼莫地平組腦梗死區(qū)Thrombomodulin蛋白、eNOS蛋白表達(dá)均顯著下降(P<0.05，P<0.01)，去羌活組大鼠腦梗死區(qū)各指標(biāo)表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

注：Krüppel樣因子(krüppel-like factor，KLF)-2；內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)；血栓調(diào)節(jié)蛋白(Thrombomodulin，Thbd)圖1 各組大鼠腦梗死區(qū)KLF2、Thrombomodulin及eNOS蛋白條帶圖

表3 各組大鼠腦梗死區(qū)中KLF2、Thrombomodulin及eNOS蛋白表達(dá)比較

3.3 各組大鼠腦梗死區(qū)KLF2、Thrombo-modulin 及eNOS mRNA表達(dá)水平比較

表4示，與正常組比較，模型組大鼠腦組織KLF2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，Thrombomodulin 與eNOS mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，三化湯、羌活組大鼠腦組織KLF2 mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05，P<0.01)，三化湯組、羌活組、尼莫地平組大鼠腦組織Thrombomodulin 與eNOS mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05，P<0.01)；去羌活組大鼠腦組織上述指標(biāo)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 各組大鼠腦梗死區(qū)KLF2、Thrombomodulin及eNOS mRNA表達(dá)水平比較

4 討論

BBB作為血液與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的屏障，具有高度選擇性，可防止血液中有害物質(zhì)進(jìn)入大腦[16]，對于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常運(yùn)作的微環(huán)境至關(guān)重要[17]。CIRI可引起B(yǎng)BB結(jié)構(gòu)和功能損傷，從而引起繼發(fā)性腦損傷[18]。因此，改善CIRI后BBB通透性對保護(hù)神經(jīng)元、維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能具有重要意義。血管內(nèi)皮是構(gòu)成BBB的關(guān)鍵部分，也是CIRI過程中的重要靶器官[19]，維護(hù)其完整性和功能正常對于維護(hù)BBB有重要意義。KLF2作為核轉(zhuǎn)錄因子，可直接影響炎癥及抗血栓等多種調(diào)控途徑，不僅對腦缺血有直接保護(hù)作用[20]，還可通過維持血管內(nèi)皮完整性及調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能[21]改善BBB功能。研究表明，過表達(dá)KLF2可增強(qiáng)內(nèi)皮屏障功能，減少炎癥刺激下的血管滲漏[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，羌活和三化湯均能上調(diào)模型大鼠KLF2 mRNA及蛋白的表達(dá)，提示羌活及三化湯可能通過調(diào)控KLF2表達(dá)，保護(hù)血管內(nèi)皮，從而減輕CIRI后BBB損傷。

eNOS是內(nèi)皮依賴性舒張功能因子，主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞中，催化L-精氨酸合成內(nèi)皮NO[23]。Sanches SC[24]發(fā)現(xiàn)，CIRI期間內(nèi)皮功能受損會產(chǎn)生過量eNOS，核黃素可通過降低eNOS /誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS,iNOS)和NO水平發(fā)揮抗氧化和抗炎作用，從而保護(hù)細(xì)胞免受缺血再灌注損傷。此外研究表明，過量NO的可增加BBB通透性[25，26]，還可能通過抑制三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的合成[27]損傷血管內(nèi)皮，故降低CIRI后eNOS的表達(dá)水平對調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能、保護(hù)血管內(nèi)皮具有積極意義。Thrombomodulin作為存在于人體內(nèi)皮細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，在調(diào)節(jié)凝血級聯(lián)中起關(guān)鍵作用[28]。Tomoda等[29，30]認(rèn)為，Thrombomodulin是內(nèi)皮功能障礙的重要標(biāo)志物，可通過促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖加速動脈硬化。此外，內(nèi)皮細(xì)胞受損時，Thrombomodulin還可釋放入血使游離的凝血酶增多，進(jìn)一步加重BBB損傷[31]。在本研究中，三化湯組、羌活組eNOS、Thrombomodulin表達(dá)較模型組顯著下降，提示三化湯與羌活可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能保護(hù)血管內(nèi)皮，減輕BBB損傷。

三化湯是治療腦卒中的經(jīng)典方劑，在臨床發(fā)揮了較好的治療作用[32，33]。本研究結(jié)果表明，三化湯改善腦缺血再灌注作用與保護(hù)血腦屏障功能密切相關(guān)，其機(jī)制可能為通過上調(diào)KLF2表達(dá)、抑制Thrombomodulin和eNOS表達(dá)以維護(hù)腦微血管內(nèi)皮完整性，從而改善血管內(nèi)皮功能。此外，本研究結(jié)果顯示，羌活能顯著減少EB滲透量，調(diào)節(jié)KLF2、Thrombomodulin和eNOS表達(dá)，提示祛風(fēng)藥羌活在三化湯保護(hù)腦缺血再灌損傷中發(fā)揮了重要作用，可深入探索羌活的作用機(jī)制。