劉 麗，武愫斌

(1.陜西省第二人民醫(yī)院病理科,陜西 西安 710005;2.商洛市中心醫(yī)院胸心外科,陜西 商洛 726000)

肺癌是起源于肺部支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，是目前全球發(fā)病率第二高，病死率第一高的惡性腫瘤[1]。在中國，肺癌的發(fā)病率和病死率均是第一高的惡性腫瘤，并且隨著我國工業(yè)化進程的不斷進展，肺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[2]。根據(jù)組織病理學特點不同，肺癌可分為非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細胞肺癌(Small cell lung cancer,SCLC)，其中NSCLC約占所有肺癌的80%，并且約75%的NSCLC初次診出時已處于疾病中晚期，生存率較低[1-2]。此外，盡管隨著醫(yī)療技術的不斷發(fā)展，肺癌患者的生存率在近年來得到延長，然而由于肺癌的病因尚不明確，所以肺癌患者病死率極高。因此，研究肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，探尋與肺癌患者預后有關的生物標志物對肺癌的臨床治療和提高患者預后意義重大。雙氧化酶成熟因子2(Dioxygenase maturation factor 2,DUOXA2)是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶蛋白家族的重要一員，被證實與人體甲狀腺相關疾病有關[3-4]。近期，一項在結腸癌中的研究[5]表明，DUOXA2在結直腸癌腫瘤組織中表達升高，并且與結直腸癌患者淋巴結轉移和不良預后有關。然而，目前尚無研究報道肺癌腫瘤組織中DUOXA2的表達情況，本研究收集90對肺癌腫瘤組織和癌旁正常組織標本，通過定量PCR、免疫印跡法和免疫組織化學法檢測DUOXA2基因的表達，以研究DUOXA2基因在肺癌患者腫瘤組織中的表達及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月到2018年12月在我院外科進行手術的肺癌患者90例，其中男53例，女37例，年齡42～81歲，平均年齡(55.3±12.0)歲。病例納入標準：①病理確診為肺癌，且TNM分期為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期；②組織標本采集前未接受化療、放療以及生物靶向治療；③年齡不小于18周歲；④年齡、性別、吸煙史以及臨床病理特征資料完整。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②心、肝或腎臟功能異常；③妊娠期或哺乳期婦女；④吸毒或合并其他傳染性疾病患者。所有參與本次研究的患者均對本次研究知情，并簽訂知情同意書。

1.2 定量PCR法檢測DUOXA2 mRNA表達 使用組織/細胞總RNA提取試劑盒(XY1061R，上海信裕生物科技有限公司)提取組織的總RNA。然后使用cDNA逆轉錄合成試劑盒(BLJM9003120，北京杰美生物科技有限公司)合成cDNA，最后根據(jù)熒光定量PCR試劑盒(BL705A，Yojanbio)說明書準備定量PCR反應體系并使用熒光定量PCR儀(FQD-96A，BIOBASE)進行分析。定量PCR反應條件：95 ℃、5 min，40個循環(huán)(95 ℃、30 s，65 ℃、30 s)。PCR引物如下：DUOXA2-F:5’-TCGTAATGATACCCAGAACATAGACA-3’;DUOXA2-R:5’-TTTGCTCCTAGAGGAACCATGGTA-3’。

1.3 免疫印跡法檢測DUOXA2蛋白表達 使用RIPA裂解液(R0010，Solarbio，中國)從細胞中提取總蛋白，然后使用BCA試劑盒(C503021，Sangon Biotech，中國)檢測總蛋白質的濃度。最后，在90 V恒定電壓下，通過10%SDS-PAGE分離50 μg總蛋白。將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。將膜與一抗(抗DUOXA2抗體)(ab230209，abcam，UK)在4 ℃孵育過夜后在室溫下孵育二抗2 h。

1.4 免疫組織化學法檢測DUOXA2蛋白表達 免疫組織化學法檢測肺癌腫瘤組織或癌旁正常組織蛋白表達選用VECTASTAIN?Elite?ABC Kit(Vector Laboratories，美國)進行，具體檢測步驟參照說明書進行。最后，每張切片選擇5個視野拍照，并進行評分：DUOXA2表達在細胞漿，未顯色、黃色、棕黃色以及棕褐色分別記0分、1分、2分和3分；陽性細胞<5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%以及>75%分別記0分、1分、2分、3分和4分。DUOXA2肺癌腫瘤組織及癌旁正常組織表達的免疫組織化學評分=顏色評分×陽性細胞評分。

2 結 果

2.1 DUOXA2在肺癌腫瘤組織中的表達 見表1。DUOXA2 mRNA 在90例肺癌腫瘤組織中的表達水平高于其在癌旁正常組織中的表達水平，DUOXA蛋白在90例肺癌腫瘤組織中的表達水平高于其在癌旁正常組織中的表達水平，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表1 DUOXA2 mRNA和蛋白在肺癌腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達比較

2.2 DUOXA2蛋白表達與肺癌患者臨床病理學參數(shù)的相關性 見表2。DUOXA2蛋白在肺癌腫瘤組織中的表達水平與年齡、性別、病理類型、腫瘤大小和TNM分期無關(均P<0.05)，而與淋巴結是否轉移有關(P<0.05)。

表2 DUOXA2蛋白表達與肺癌患者臨床病理學參數(shù)的相關性

2.3 DUOXA2表達在不同淋巴結轉移狀態(tài)肺癌腫瘤組織中的表達比較 見表3。30例淋巴結轉移肺癌患者腫瘤組織中DUOXA2 mRNA和蛋白表達均高于60例淋巴結未轉移肺癌患者腫瘤組織中DUOXA2 mRNA和蛋白的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。

表3 不同淋巴結轉移狀態(tài)肺癌腫瘤組織中DUOXA2表達比較

2.4 DUOXA2表達與肺癌患者預后相關性分析 見表4。多因素回歸分析顯示，90例肺癌患者預后與肺癌患者年齡、性別和腫瘤分化程度無關(P>0.05)，而腫瘤直徑、淋巴結轉移、TNM分期和DUOXA2表達水平與肺癌患者預后有關(P<0.05)。

表4 肺癌患者預后多因素回歸分析

3 討 論

2020年中國新發(fā)癌癥中，男性肺癌新發(fā)病例539 181例，占男性癌癥新發(fā)病例比例為31.4%；女性肺癌新發(fā)病例276 382例，占女性癌癥新發(fā)病例比例為22.2%。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，80%的肺癌患者為非小細胞肺癌，而約75%非小細胞肺癌患者在初次確診時已處于中晚期，5年生存率為17.6%，而早期肺癌患者經手術切除治療后的5年生存率高達80%以上，但仍存在一部分早期肺癌患者預后不良，這可能與惡性腫瘤的異質性特征有關。

本研究通過定量PCR法檢測DUOXA2 mRNA在肺癌組織和癌旁正常組織中的表達，通過免疫印跡法和免疫組織化學法檢測DUOXA2蛋白在肺癌組織和癌旁正常組織中的表達，結果顯示：DUOXA2基因在肺癌組織中的表達水平顯著高于其在癌旁正常組織的表達水平，這一結果與張雪等[5]的研究結果一致。張雪等[5]研究發(fā)現(xiàn)，DUOXA2基因在75例結腸癌組織中的表達水平顯著高于其在癌旁正常組織中的表達，提示DUOXA2可能參與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展。DUOXA2是NADPH氧化酶蛋白家族的重要成員，其作為DUOX2的激活蛋白，與DUOX2一起可形成決定H2O2生成的復合物[8-9]。近年來，關于DUOX2在腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究越來越多，比如Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，DUOX2可通過調節(jié)AKT信號通路和與RPL3相互作用而促進結直腸癌的進展；Burgueno等[11]的研究則表明，通過激活DUOX2可誘導微生物驅動腫瘤的發(fā)生。

近年來隨著測序技術的不斷進步和生物信息學分析技術的飛速發(fā)展，多個與肺癌細胞遷移有關的分子被鑒定出[12-13]。本文研究發(fā)現(xiàn)，DUOXA2基因在淋巴結轉移的肺癌患者腫瘤組織中的表達水平顯著高于淋巴結未轉移的肺癌患者，表明DUOXA2可能與肺癌細胞的轉移有關，這一結果Cao等[14]的研究結果一致。Cao等[14]通過檢測胰腺癌細胞和組織中DUOX2蛋白的表達發(fā)現(xiàn)，DUOX2蛋白在胰腺癌細胞和組織中表達升高，并且DUOX2被激活后可促進胰腺癌細胞的遷移，而DUOXA2是DUOX2特異性的激活蛋白。此外，本文研究還發(fā)現(xiàn)，DUOXA2蛋白是影響肺癌患者預后的獨立危險因素(P=0.039，95%CI：1.329～5.039)。腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，而長期處于氧化應激環(huán)境中的細胞會引起其內的信號通路異常傳導，這種信號通路的異常傳導可以促進癌癥的進展[15-16]。DUOXA2和DUOX2形成的復合物是H2O2生成的決定因子，而H2O2的增加是惡性腫瘤細胞的主要特征之一[17-18]。H2O2生成的增加不僅會增強腫瘤微環(huán)境的氧化應激狀態(tài)，而且可以通過損傷細胞DNA而促進癌癥的進展[19-20]。

綜上所述，DUOXA2基因在肺癌腫瘤組織中表達升高，并且其表達與肺癌細胞的淋巴結轉移有關，其是影響肺癌患者預后的獨立危險因素，可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，但尚需進一步研究證實。