劉 洋，孫鵬亮，張秋林，陳薈旭，龔學(xué)文，李蓮瑞

（1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；4.阿克蘇興疆牧歌食品股份有限公司，新疆 阿克蘇 843000）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一種急性、高度傳染性腸道疫病，臨床特征為嘔吐、水樣腹瀉和脫水死亡[1]，各個(gè)年齡階段的豬群都會發(fā)病，尤其是5日齡內(nèi)哺乳仔豬感染率最高，病死率也最高，幾乎為100%[2]。

近年來我國多地豬場冬、春季節(jié)發(fā)生豬流行性腹瀉，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失[3]。PEDV毒株對仔豬具有極高的致病性并可急性感染整個(gè)小腸和大腸絨毛上皮細(xì)胞，以空腸和回腸為主。PEDV感染可引起嚴(yán)重的急性萎縮性腸炎和病毒血癥，導(dǎo)致嚴(yán)重的腹瀉和嘔吐，造成廣泛性脫水，最終導(dǎo)致哺乳仔豬死亡[4]。20世紀(jì)70年代，PEDV首先在英國與比利時(shí)被發(fā)現(xiàn)[5-6]，后該病毒流行于歐洲和亞洲多個(gè)國家[7-8]。我國在1980年就有該病發(fā)生的相關(guān)報(bào)道[9]，自2010年來，PED在我國多地區(qū)暴發(fā)[10-12]，2015年又在我國西北地區(qū)暴發(fā)[1]。PEDV給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的防控風(fēng)險(xiǎn)，也給養(yǎng)殖戶及養(yǎng)殖企業(yè)帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。

PEDV屬于冠狀病毒科、α冠狀病毒屬，病毒粒子呈多形性，具有囊膜，其基因組為單股正鏈RNA，全長約28 kb。主要有纖突蛋白S、囊膜糖蛋白E、膜蛋白M和核衣殼蛋白N以及一種由ORF3基因編碼的輔助蛋白。M蛋白是一種跨膜蛋白，該蛋白在病毒粒子的組裝和出芽過程中具有重要作用[13]；另外，冠狀病毒的M蛋白能夠介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生α-干擾素（α-IFN）[14]。M基因比較保守，是研究PEDV遺傳演化的優(yōu)先選擇基因，對PEDV增殖情況的研究以及PED的診斷和防治具有重要意義。

近年來新疆地區(qū)不斷出現(xiàn)PED暴發(fā)的案例，2011—2012年間新疆地區(qū)北疆4家豬場、南疆6家豬場共計(jì)10家豬場發(fā)病[15]，2013—2015年間石河子及周邊地區(qū)29個(gè)豬場發(fā)生腹瀉情況，其中22個(gè)豬場PED檢測陽性[16]，2018—2019年間新疆石河子、五家渠、烏魯木齊6個(gè)不同地區(qū)25個(gè)豬場發(fā)病，采集1 388份樣品，PED檢測陽性率達(dá)到了46.69%[17]。鑒于此，本研究采集阿克蘇地區(qū)某豬場的疑似PEDV感染的豬病料組織，進(jìn)行M基因克隆與分析，為該地區(qū)PED的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 樣品來源

樣品采集于新疆阿克蘇地區(qū)某豬場，采集疑似患有豬流行性腹瀉的7日齡以內(nèi)仔豬的腸道內(nèi)容物，并置于-70 ℃冰箱中保存、備用。2021年3月在塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院進(jìn)行檢測。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒（ER201）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（AE311），購自TransGen Biotech公司；質(zhì)粒小提試劑盒、Gold view核酸染料、DL 2 000 Marker，購自北京天根生化科技有限公司；pMD19-T Vector，購自大連寶生物工程有限公司；氨芐西林，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DC301），購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 主要儀器

小型高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 541 5R）購自Eppendorf科技有限公司；臺式微量高速離心機(jī)（Sorvall Legend Micro 17）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9080）購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器（THZ-S2A）購自常州奧華儀器有限公司；潔凈工作臺（SW-CJ-2ED）購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；PCR儀（TC-5000）購自英國TECHNE公司；水平電泳槽（Thermal cycler Block）購自Thermo Fisher公司；凝集成像系統(tǒng)（Gel DocTM XR+）購自Bio-RAD公司；高壓滅菌鍋（HVE-50）購自日本TOMY KOGYO公司；電子分析天平（AUY220）購自杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品處理與其總RNA的提取

豬腸道內(nèi)容物的總RNA的提取參照TransGen Biotech公司RNA提取試劑盒說明書（ER201）的要求進(jìn)行操作，提取樣品中的總RNA，其逆轉(zhuǎn)錄參照TransGen Biotech公司RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（AE311）進(jìn)行操作，將獲得的cDNA溶液置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

2.2 引物的設(shè)計(jì)

參照NCBI（GenBank登錄號：MN692793）的PEDV序列信息，設(shè)計(jì)PEDV M基因特異性片段鑒定的引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

引物序列為：上游引物5'-GGCGAATTCCGGT TCTATTCCCGTTGATG-3'，下游引物5'-GGCCTCG AGATGAAGCACTTTCTCACTAT-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為663 bp。

2.3 PCR擴(kuò)增目的基因

在PCR管中，加入cDNA 1 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，EasyTaq Super Mix 12.5 μL，用Nuclease-free Water補(bǔ)齊至25 μL；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性300 s；94 ℃變性50 s，56 ℃退火60 s；72 ℃延伸60 s；35個(gè)循環(huán)；72 ℃保護(hù)延伸600 s。PCR結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察目的條帶并對其拍照保存。

2.4 M基因的克隆及測序和序列分析

PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收與純化，連接pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化DH5α，PCR鑒定后的陽性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結(jié)果與GenBank中的30個(gè)PEDV分離株的基因序列進(jìn)行BLAST比對，并使用軟件MEGA 6.0對其構(gòu)建系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹，進(jìn)一步判斷其與國內(nèi)外其它毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系。試驗(yàn)所用參考毒株序列見表1。

表1 參考毒株相關(guān)信息

3 結(jié)果與分析

樣品總RNA的提取參照TransGen Biotech公司RNA提取試劑盒說明書（ER201）的要求進(jìn)行操作，RNA提取結(jié)果如圖1所示。將提取的總RNA參照TransGen Biotech公司RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（AE311）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將獲得的cDNA溶液置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

圖1 樣品RNA基因電泳

3.1 M基因的PCR擴(kuò)增、克隆和測序結(jié)果

以樣品的cDNA為模板，擴(kuò)增M基因，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果顯示：樣品中擴(kuò)增出了大小約為663 bp的基因片段，與預(yù)期片段大小相符，電泳結(jié)果見圖2。PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收與純化，連接pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化DH5α，陽性克隆的鑒定結(jié)果見圖3。PCR鑒定后的陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

圖2 M基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 陽性克隆的PCR鑒定結(jié)果

3.2 PEDV特征基因片段的序列分析結(jié)果（系統(tǒng)進(jìn)化樹分析及同源性比較）

使用MEGA 6.0將該毒株的測序結(jié)果與GenBank中的30個(gè)參考毒株（15個(gè)全基因組毒株，15個(gè)M基因毒株）構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹如圖4所示，從圖4中可以看出，該毒株與國內(nèi)絕大部分毒株（9個(gè)M基因毒株，5個(gè)全基因組毒株），如：2012年河北M基因分離株HBMC2012（GenBank登錄號：JX163295），2012年福建M基因分離株FJ-LY12021（GenBank登錄號：KJ646600），2013年貴州M基因分離株ZY（GenBank登錄號：KF150217），2014年浙江全基因組分離株CH/JXZS-3L（GenBank登錄號：KF840547），2018年甘肅全基因組分離株CH/HNYY/2018（GenBank登錄號：MT090145）等屬于同一個(gè)群（Ⅰ群），親緣關(guān)系較近，處于同一分支；與部分國外毒株（5個(gè)全基因組毒株），如2018年匈牙利分離株S236（GenBank登錄號：MH593900），2019年德國分離株GER/L032205/2019（GenBank登錄號：LR812932），2019年法國分離株FR2019001（GenBank登錄號：MN056942）等屬于同一個(gè)群（Ⅰ群），親緣關(guān)系較近，處于同一分支。該毒株與國內(nèi)外部分毒株（6個(gè)M基因毒株，5個(gè)全基因組毒株），如2007年河南M基因分離株YM-2007（GenBank登錄號：EU302820），2000年韓國M基因分離株KPEDV-9（GenBank登錄號：AF015888），經(jīng)典毒株CV777（GenBank登錄號：AF353511），該豬場所用疫苗株AJ1102（GenBank登錄號：JX188454）等處于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。說明該毒株與2011年后國內(nèi)外主要分離株M基因差異不大，與經(jīng)典毒株CV777、疫苗株AJ1102及國內(nèi)外早期分離株差異較大。

圖4 流行性腹瀉病毒M基因進(jìn)化樹

根據(jù)測序結(jié)果，將該毒株的測序結(jié)果與GenBank中的30個(gè)參考毒株（15個(gè)全基因組毒株，15個(gè)M基因毒株）進(jìn)行同源性分析，結(jié)果如圖5所示。該毒株與進(jìn)化樹中Ⅰ群的同源性較高，同源性為98.8%～99.5%。其中與2012年北京M基因分離株GDZQ-1024（GenBank登錄號：KC294274）、2012年北京M基因分離株TJNH-1023（GenBank登錄號：KC294273）同源性最低，同源性為98.8%；與2012年福建M基因分離株FJ-LY12012（GenBank登錄號：KJ646600）、2014年浙江全基因組分離株CH/JXZS-3L（GenBank登錄號：KF940547）、2019年西班牙全基因組分離株P(guān)EDV-1931-1（GenBank登錄號：MN692784）等同源性最高，同源性為99.5%。該毒株與進(jìn)化樹中Ⅱ群的同源性較低，同源性為96.7%～98.8%。其中與2011年福建M基因分離株FJ/PT/2011（GenBank登錄號：JQ678036）同源性最低，同源性為96.7%；與2004年江蘇M基因分離株JS-2004-2（GenBank登錄號：AY653205）同源性最高，同源性為98.8%；與經(jīng)典毒株CV777（GenBank登錄號：AF353511）的同源性為97.6%；與疫苗株AJ1102（GenBank登錄號：JX188454）同源性為98%。以上結(jié)果均證明該毒株與2011年后國內(nèi)外主要分離株M基因差異不大，與經(jīng)典毒株CV777、疫苗株AJ1102及國內(nèi)外早期分離株差異較大。推測該豬場發(fā)病可能是疫苗株和該場毒株不完全匹配，沒有提供較高保護(hù)力所致。

圖5 不同PED毒株的M基因的同源性分析及比較

4 討論

該案例發(fā)生在2020年10月份，產(chǎn)房仔豬以水樣腹瀉為主，嚴(yán)重脫水，發(fā)病日齡小，14日齡以下死亡率達(dá)到50%。經(jīng)過前期的流行病學(xué)調(diào)查，得知該豬場采用4周批的生產(chǎn)模式，腹瀉苗的免疫對象主要為妊娠母豬和后備豬[18-19]，但在后備豬階段未進(jìn)行系統(tǒng)性的馴化。該豬場PED的妊娠母豬階段免疫程序相對比較完善，自2018年以來就沒再發(fā)生改動，妊娠母豬的免疫分為跟胎免疫和全年普免。跟胎免疫分別是在產(chǎn)前30 d進(jìn)行活苗+滅活苗的免疫，在產(chǎn)前10 d進(jìn)行滅活苗的免疫，總共免疫兩次；全年普免分別是在3月份和6月份各進(jìn)行1次活苗+滅活苗的免疫，總共免疫兩次（中間間隔6個(gè)月）。后備母豬階段免疫程序有所不足，分別在140日齡進(jìn)行活疫苗的免疫和160日齡進(jìn)行滅活苗的免疫。免疫所使用的疫苗均為TGE-PED（WH-1株+AJ1102株）二聯(lián)苗。總體來說PEDV的免疫程序是相對完善的，但該豬場所用疫苗株與該場毒株不是完全匹配，可能存在所使用疫苗不能給豬群提供有效保護(hù)力的情況。另外該豬場在10月份所進(jìn)行生產(chǎn)的母豬群結(jié)構(gòu)是經(jīng)產(chǎn)母豬和后備母豬混合的結(jié)構(gòu)，發(fā)病也多是從后備母豬所生產(chǎn)的仔豬開始。分析認(rèn)為雖然母豬經(jīng)過疫苗免疫，但由于母豬群結(jié)構(gòu)復(fù)雜、后備母豬免疫次數(shù)較少不能給其所產(chǎn)仔豬提供有效的保護(hù)力，更容易感染發(fā)病。這些仔豬發(fā)病后會進(jìn)行排毒，導(dǎo)致豬舍內(nèi)病毒載量突然升高，經(jīng)產(chǎn)母豬所產(chǎn)仔豬雖然能得到一定保護(hù)，但由于豬舍內(nèi)病毒載量過高，導(dǎo)致經(jīng)產(chǎn)母豬所產(chǎn)仔豬也被感染，再次進(jìn)行排毒，周而復(fù)始，使豬舍內(nèi)病毒載量不斷積累升高，進(jìn)而導(dǎo)致整體豬群感染發(fā)病[20]。

通過對豬場疑似豬流行性腹瀉病毒的M蛋白的基因進(jìn)行檢測，檢測到陽性樣本，基因經(jīng)克隆后測序，發(fā)現(xiàn)該基因片段與2011年后國內(nèi)外分離株（CH/HNYY/2018，CH/JXZS-3L，F(xiàn)J-LY12012，C3-HB2017，GER/L03207，GER/L03205，S236，F(xiàn)R2019001，PEDV-1931-1）的同源性均較高，均為99.5%。這說明2011年后國內(nèi)外PEDV的主要分離株M基因差異不大[21]，這與盧冰霞等[22]、張紅壘等[23]、王隆柏等[24]研究結(jié)果基本一致。

除了用M基因分析外，也有不少學(xué)者先后采用ORF3、N基因進(jìn)行PEDV的同源進(jìn)化分析，結(jié)果也不盡相同[25-27]，但由于M基因比較保守，因此仍是研究PEDV遺傳演化的優(yōu)先選擇基因。由于本次分離的PEDV來自已經(jīng)免疫過豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎二聯(lián)疫苗的豬場，因此，有必要繼續(xù)深入研究這些流行毒株的生物學(xué)特性和免疫特性。

豬流行性腹瀉的治療目前無特效方案，控制該疫病以預(yù)防為主。主要從生物安全、疫苗免疫、飼養(yǎng)管理防控3個(gè)方面入手進(jìn)行防控。目前，市面上的TGE-PED二聯(lián)苗有一定預(yù)防效果，但變異病毒用疫苗預(yù)防效果差，現(xiàn)有的疫苗無法對新的變異毒株產(chǎn)生較好的保護(hù)，是本病難以得到有效防控的重要原因之一。因此該豬場還需要制定出系統(tǒng)性的可實(shí)施的有效方案，來加強(qiáng)后備豬的馴化管理，使后備母豬能給其所產(chǎn)的仔豬提供有效的保護(hù)，防止豬群再次發(fā)病[27]。通過本次試驗(yàn)可以得出阿克蘇某豬場采集的疑似發(fā)病樣本存在豬流行性腹瀉病毒感染，為該豬場在豬流行性腹瀉病毒的檢測、免疫和防控方面提供理論依據(jù)及指導(dǎo)。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該豬場毒株和湖北分離株C3-HB2017親緣關(guān)系最近，在進(jìn)化樹上同處于一個(gè)小分支，且同源性為99.5%，但仍存在3個(gè)堿基位點(diǎn)的突變；與2011年以后國內(nèi)外主要分離株M基因親緣關(guān)系較近，在進(jìn)化樹上雖不處于同一分支，但都屬于同一個(gè)大群（Ⅰ群），同源性為98.8%～99.5%。但與經(jīng)典毒株CV777和疫苗株AJ1102（2012年湖北分離株）親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，在進(jìn)化樹上既不處于同一分支，也不屬于同一個(gè)群；該毒株與經(jīng)典株CV777同源性為97.6%，存在16個(gè)堿基位點(diǎn)的突變，與疫苗株AJ1102同源性為98%，存在13個(gè)堿基位點(diǎn)的突變。說明該場豬流行性腹瀉流行毒株可能為變異毒株。