李 婭，汪 蓉，李凱鋒，王秀芳

(昆明學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650214)

黃芪中的重要成分是多糖類和黃芪苷，其中黃芪苷又可以細(xì)分為黃芪Ⅰ、黃芪Ⅱ、黃芪Ⅳ，黃芪苷中生物化學(xué)活性最高的部位為黃芪Ⅳ，亦稱黃芪甲苷.黃芪甲苷(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)為環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物，是黃芪專屬性活性成分，其作為黃芪質(zhì)量控制指標(biāo)被歷版《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)所收載[1].黃芪甲苷對(duì)人體具有良好的機(jī)體免疫調(diào)控、抗炎、耐藥、抗病毒、器官保護(hù)[2]和神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)等功能[3-4].其不僅完全具備其他黃芪植物多糖的特殊功效，而且還具有一些新的特點(diǎn)使它擁有其他常規(guī)黃芪植物多糖中所無(wú)法與之相比較的強(qiáng)大功效，其中所具有的抗病毒功效和抗菌作用反應(yīng)強(qiáng)度大約相當(dāng)于其他多種常規(guī)藥用黃芪植物多糖的2倍多，對(duì)于多種病毒的抗菌作用更是其他常規(guī)黃芪植物多糖的30倍多，由于它的成分含量少，效果好，因此使它擁有“超級(jí)黃芪多糖”的美譽(yù).黃芪甲苷的含量測(cè)定檢驗(yàn)方法最常見(jiàn)的有薄層掃描法、近紅外波譜法[5]、高效液相色譜法、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法等.

參子安胎片是昆明市中醫(yī)醫(yī)院制劑室研制生產(chǎn)的中藥制劑，原名保產(chǎn)達(dá)生片，主要由當(dāng)歸、黃芪等藥材組成.具有養(yǎng)氣血、益陰精、充盈胞脈沖任、強(qiáng)健母體的功效[6].由于該樣品為院內(nèi)制劑，在《中國(guó)藥典》中沒(méi)有關(guān)于參子安胎片的黃芪甲苷含量測(cè)定的記錄，為此，本研究建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射(HPLC-ELSD)聯(lián)用法對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，以期為參子安胎片中黃芪甲苷的含量測(cè)定提供參考.

圖1 黃芪甲苷結(jié)構(gòu)式

1 試劑和儀器

分析純?cè)噭┵?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜純?cè)噭┵?gòu)于Fisher Chemical；黃芪甲苷對(duì)照品(純度96.9%)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；參子安胎片的產(chǎn)源來(lái)自昆明市中醫(yī)藥制劑中心(編號(hào):200825，200827，200828).HPLC-ELSD儀(Agilent 1260，安捷倫科技有限公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品 0.005 421 g 于 25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，配制成每 1 mL 中含 0.216 8 mg 的溶液，即得黃芪甲苷對(duì)照品溶液.

2.1.2 供試品溶液的制備

取參子安胎片粉末 9 g，精密稱量其質(zhì)量，置于 250 mL 的具塞錐形瓶中，用量筒量取甲醇 100 mL 加入其中，放置在水浴鍋上冷凝回流 1.5 h.取出放冷，取上清液過(guò)濾，過(guò)濾后的濾紙重新放入錐形瓶中，再加入50 mL甲醇于該錐形瓶中，然后放入超聲波清洗機(jī)中，100 W 超聲 20 min.放冷后再次取上層清液過(guò)濾，濾紙重新放入錐形瓶中，加入 50 mL 甲醇，再放入同一臺(tái)超聲波清洗機(jī)中超聲.合并甲醇提取液于蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上蒸發(fā)至近干，加入 25 mL 熱水溶解，用玻璃棒將溶解后所得的溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇溶解提取4次，每次 40 mL，合并正丁醇提取液.再用氨試液洗滌正丁醇提取液2次，每次 50 mL，棄去氨試液，合并正丁醇溶液.合并后的正丁醇溶液在水浴鍋上蒸發(fā)至近干，用甲醇溶解殘?jiān)迫?10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用 0.45 μm 有機(jī)濾膜和注射器緩慢推入液相小瓶里，搖勻，即得到供試品溶液.

2.1.3 陰性樣品的制備

參子安胎片陰性樣品指參子安胎片中除沒(méi)有黃芪成分外，其他成分都不變的樣品.稱取 9 g 左右的參子安胎片陰性樣品，精密稱量，其他步驟與“2.1.2”項(xiàng)下的步驟一致.

2.1.4 色譜條件

色譜柱為安捷倫SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫 30 ℃，流動(dòng)相V(乙腈)∶V(水)=32∶68，工作流速為 0.8 mL/min，霧化器工作溫度 40 ℃，蒸發(fā)管工作溫度 90 ℃，氣體流速 1.6 L/min，運(yùn)行時(shí)間 45 min.

2.2 測(cè)定方法

分別精密吸取 20 μL 的供試品溶液以及3，10 μL 對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀中，則可得到其色譜圖.以外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，即可得到供試品的含量.

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

取陰性樣品，按照“2.1.3”項(xiàng)下陰性樣品的制備工藝制成陰性供試品溶液.精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各 20 μL，分別注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖.從圖2～圖4可以看出，在與對(duì)照品的色譜峰共同相應(yīng)曝光位置上，供試品溶液同樣具有與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的曝光時(shí)間和相同的色譜峰，而陰性樣品溶液則在此處對(duì)應(yīng)的位置上無(wú)任何色譜峰.

圖2 參子安胎片陰性樣品色譜圖

圖3 黃芪甲苷對(duì)照品色譜圖

圖4 參子安胎片供試品色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察

精密吸取配制好的對(duì)照品溶液3，6，10，15，20，25，30 μL，分別注入高效液相色譜儀中，按照“2.1.4”色譜條件測(cè)定峰面積.以lgρ(進(jìn)樣量)為橫坐標(biāo)，lgS為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=1.790 7x+1.691 6，R2=0.999 8.測(cè)定結(jié)果顯示，進(jìn)樣量在 0.630 3～6.303 3 μg 的范圍內(nèi)具有非常高的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1與圖5.

表1 線性范圍考察結(jié)果

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為200825的樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備工藝方法進(jìn)行制備，然后精密吸取 20 μL 的供試品溶液，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2.RSD為0.93%，表明所檢測(cè)的數(shù)據(jù)精密度良好.

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為200827的供試品，按照“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備工藝方法進(jìn)行制備，分別在規(guī)定時(shí)間配制后0，4，8，12，16 h，按照規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3.結(jié)果顯示，供試品溶液在 16 h 內(nèi)穩(wěn)定.

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取批號(hào)為200827的樣品，并按照“2.1.2”項(xiàng)下供試品的制備工藝方法，平行制備6份實(shí)驗(yàn)用的供試品溶液，然后用相同方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，得到平均含量為 0.117 4 mg/g，RSD為1.73%.表明所采用方法的測(cè)定工藝具有較高的重復(fù)性.

2.3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取200827批號(hào)中已知含量的參子安胎片樣品6份(其中黃芪甲苷的含量為 0.117 4 mg/g)，分別在樣品中準(zhǔn)確加入黃芪甲苷對(duì)照品適量，按照“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備工藝方法混合成供試品溶液，用相同方法進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)計(jì)算樣品的回收率，得到平均回收率為99.54%，RSD為2.58%(n=6).結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 定量限和檢出限實(shí)驗(yàn)

1)定量限.取 9.005 5 g 供試品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，依次取 1 mL 的對(duì)照品溶液定容至 5 mL 的容量瓶中，搖勻.用 0.45 μm 的有機(jī)濾膜和注射器緩慢推入液相小瓶中，進(jìn)樣 20 μL，測(cè)定其峰面積，結(jié)果見(jiàn)表5.

2)檢出限.取 9.005 5 g 供試品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，依次取 0.5 mL 對(duì)照品溶液，用甲醇定容至 5 mL 的容量瓶中，搖勻.然后用 0.45 μm 的有機(jī)濾膜和注射器將其緩慢推入液相小瓶中，進(jìn)樣 20 μL，測(cè)定其峰面積，結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 定量限和檢出限

2.4 樣品含量測(cè)定

取3個(gè)批號(hào)的參子安胎片，并按照“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備工藝方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液 20 μL，注入高效液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)計(jì)算黃芪甲苷的含量.從表6可以看出，不同批號(hào)的參子安胎片中黃芪甲苷的含量不同，其平均值為 0.087 8 mg/g.

表6 黃芪甲苷的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

3.1 討論

3.1.1 溶劑的選擇

在溶劑的選擇方面，本研究分別使用甲醇和80%甲醇考察參子安胎片樣品的處理效果.結(jié)果表明，用80%甲醇處理的樣品所得結(jié)果在本檢測(cè)條件下均出現(xiàn)不同程度的干擾，且所測(cè)得的含量較低，因此最終選擇使用甲醇溶液處理樣品.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法提取效率高、分離速度快，測(cè)定時(shí)無(wú)明顯的干擾，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均能夠滿足分析的要求.值得注意的是，正丁醇萃取液合并在一起后應(yīng)再采用氨試液萃取2次，以提高其檢測(cè)含量，降低目標(biāo)峰的干擾.

3.1.2 色譜柱的選擇

本研究分別考察了Agilent SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)和XBridge C18(5 μm，4.6 mm×250 mm) 兩種色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)兩種色譜柱均可對(duì)樣品進(jìn)行有效的分離，但相較于XBridge C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，Agilent SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)的分離效果更加明顯，分離度更高，最終采用Agilent SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱.

3.1.3 流動(dòng)相的選擇

參考《中國(guó)藥典：一部》(2015年修訂版)中黃芪含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下的方法，采用乙腈-水為流動(dòng)相，考察了V(乙腈)∶V(水) =32∶68[7]、V(乙腈)∶V(水) =30∶70、V(甲醇)∶V(水)=80∶20這3種流動(dòng)相.結(jié)果顯示，供試品溶液在采用V(乙腈)∶V(水) =32∶68的色譜測(cè)定體系中能有效地洗脫黃芪甲苷后充分取出，且能夠達(dá)到很好的基線分離，因此選擇V(乙腈)∶V(水)=32∶68作為流動(dòng)相.

3.2 小結(jié)

本研究建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射(HPLC-ELSD)聯(lián)用法對(duì)參子安胎片中黃芪甲苷的含量進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果表明，HPLC-ELSD法能夠有效測(cè)定參子安胎片中黃芪甲苷的含量，方法準(zhǔn)確可靠.