陸 娟，昂玉潔，王 萍，屈長(zhǎng)青,2

(1.阜陽(yáng)師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，阜陽(yáng) 236037；2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，阜陽(yáng) 236037)

有絲分裂(mitosis)是高等生物體細(xì)胞增殖的主要方式，根據(jù)染色體的形態(tài)與動(dòng)態(tài)變化可以將分裂過程分為前期、中期、后期和末期。為了方便觀察有絲分裂各期分裂相，就必須選擇細(xì)胞分裂較旺盛且易取的組織作為實(shí)驗(yàn)材料。大蒜生根率較高，幾乎不受季節(jié)限制，且染色體數(shù)目較少(2n=16)，顯微鏡下易于觀察，所以它是學(xué)生實(shí)驗(yàn)材料的首選[1]。有絲分裂實(shí)驗(yàn)不僅是現(xiàn)行中學(xué)生物學(xué)教材中必做的實(shí)驗(yàn)之一，也是大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的選做實(shí)驗(yàn)之一，但是按照中學(xué)教材中所述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)成功率很低[2]，大學(xué)的實(shí)驗(yàn)教材也未提及具體的改善方法。

趙東利等[3]發(fā)現(xiàn)10-9mol/L吲哚乙酸(IAA)最利于大蒜根生長(zhǎng)發(fā)育，較低濃度促進(jìn)大蒜根的生長(zhǎng)，較高濃度抑制生長(zhǎng)。吲哚-3-乙酸是生長(zhǎng)素在植物體內(nèi)主要的存在形式，生長(zhǎng)素通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分裂以及細(xì)胞特異性的分化等生理功能參與一系列生長(zhǎng)發(fā)育過程[4]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中IAA常用于誘導(dǎo)植物生根和繁育無(wú)籽番茄。

目前還沒有關(guān)于吲哚乙酸對(duì)大蒜根尖有絲分裂周期性影響的報(bào)道。本文研究用10-9mol/L IAA培養(yǎng)的大蒜根尖在上午8點(diǎn)至下午4點(diǎn)的有絲分裂情況，為植物細(xì)胞有絲分裂實(shí)驗(yàn)更好地開展提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

大蒜(AlliumsativumL.)。0.1%龍膽紫染液、0.1%番紅染液和改良的苯酚品紅染液。

1.2 方法

1.2.1 材料的處理

剝?nèi)ニ忸^的膜質(zhì)鱗葉，再去掉蒜瓣的外包薄膜，放于托盤中，分別加入水和10-9mol/L IAA，使蒜瓣浸入水中，28 ℃恒溫培養(yǎng)，每天換水或IAA溶液一次。當(dāng)大蒜根長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)進(jìn)行剪取，置于Carnoy固定液(體積比95%乙醇∶冰醋酸=3∶1)中固定2 h以上，棄固定液，加入保存液(75%乙醇)，4 ℃冰箱中保存。

1.3 大蒜根尖細(xì)胞有絲分裂裝片的制備

將固定的大蒜根尖取出，去除伸長(zhǎng)區(qū)，僅留下乳白色分生區(qū)(約0.15 cm)，放入解離液(1 mol/L鹽酸)中解離10 min進(jìn)行軟化，水洗3次；將軟化后的根尖放入載玻片上的染液液滴中，用解剖針將根尖壓碎、染色；用鉛筆輕敲蓋玻片，使細(xì)胞分散均勻、除去氣泡，用吸水紙吸干蓋玻片周圍的染液。顯微鏡下觀察。

1.4 染色液的選擇

將保存的大蒜根尖經(jīng)軟化、壓碎后分別用龍膽紫染液、番紅染液和改良的苯酚品紅染液進(jìn)行染色，壓片后鏡檢觀察。

1.5 IAA對(duì)大蒜根尖有絲分裂相的影響

2021年3月中旬將大蒜剝皮后分別用水和10-9mol/L IAA進(jìn)行培養(yǎng)，于8：00、9：00、10：00、11：00、12：00、13：00、14：00、15：00和16：00剪取大蒜根尖，固定、保存。經(jīng)軟化、搗碎、改良的苯酚品紅染液染色，壓片后鏡檢觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

選取40倍鏡下細(xì)胞分布均勻、染色效果較好的視野進(jìn)行觀察，每個(gè)根尖選取5個(gè)視野，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取5個(gè)根尖共25個(gè)視野。統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間點(diǎn)大蒜有絲分裂相的數(shù)目和有絲分裂指數(shù)，總細(xì)胞數(shù)是觀察的間期細(xì)胞和分裂期細(xì)胞(前期、中期、后期和末期)的總和；其中，中后期比例=(中期細(xì)胞數(shù)+后期細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100%，有絲分裂指數(shù)=分裂期細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色液的選擇

大蒜根尖分別用龍膽紫、番紅和改良的苯酚品紅等3種染液染色后進(jìn)行鏡檢觀察(圖1)。結(jié)果表明，龍膽紫和番紅著色力較強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)不同程度地被染成相應(yīng)的顏色，影響染色體的觀察和計(jì)數(shù)。雖然使用改良的苯酚品紅染液染色時(shí)間(8～10 min)較其他染色液長(zhǎng)(龍膽紫3～5 min、番紅3～5 min)，卻可使細(xì)胞質(zhì)幾乎不著色或著色較淺，將染色體染成清晰的淡紫色。

(a)0.1%龍膽紫；(b)0.1%番紅；(c)改良的苯酚品紅。圖1 不同染料處理的大蒜根尖細(xì)胞(10×40)Figure 1 The garlic tip cells stained by three dyes(10×40)

2.2 IAA對(duì)大蒜根尖有絲分裂相的影響

將分別用水和10-9mol/L IAA培養(yǎng)、固定保存的大蒜根尖進(jìn)行軟化、染色、壓片后鏡檢，統(tǒng)計(jì)分析40倍鏡下25個(gè)視野中的有絲分裂指數(shù)和中后期分裂相比例。

由表1和表2可以看出：水培的大蒜根尖在8：00—16：00有絲分裂存在高峰期，14：00時(shí)出現(xiàn)了最高峰期(分裂指數(shù)為3.68%)，10：00時(shí)出現(xiàn)了一個(gè)次高峰期(分裂指數(shù)為2.95%)；并且有絲分裂指數(shù)為1.91%～3.68%，細(xì)胞分裂的中、后期細(xì)胞所占比例為0.38%～1.47%。10-9mol/L IAA培養(yǎng)的大蒜根尖在8：00—16：00有絲分裂也存在高峰期，8：00時(shí)有絲分裂指數(shù)最高(9.11%)，隨后分裂指數(shù)幾乎呈現(xiàn)為降低的趨勢(shì)，到16：00時(shí)兩種方法培養(yǎng)的大蒜根尖有絲分裂指數(shù)持平(1.91%)，并且有絲分裂指數(shù)為1.91%～9.11%，細(xì)胞分裂的中后期細(xì)胞所占比例為0.80%～3.55%。

表1 水培養(yǎng)的大蒜根尖有絲分裂各期細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)表Table 1 Statistical table of each mitotic stage cell number of garlic tips cultured in water

表2 IAA培養(yǎng)的大蒜根尖有絲分裂各期細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of each mitotic stage cell number of garlic tips cultured in indoleacetic acid solution (10-9 mol/L)

3 討論

迄今為止，許多研究工作者已經(jīng)對(duì)植物根尖有絲分裂的實(shí)驗(yàn)開展了研究，他們發(fā)現(xiàn)植物的有絲分裂指數(shù)與根尖長(zhǎng)度、培養(yǎng)溫度等條件有關(guān)。李愛玲等[1]發(fā)現(xiàn)8：00至14：00尤其是上午8：00至10：00可以獲得大量的有絲分裂中后期分裂相細(xì)胞(根長(zhǎng)1.5～3 cm)；李今等[2]發(fā)現(xiàn)大蒜的最佳培養(yǎng)溫度為4 ℃、最佳培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)(根長(zhǎng)2～3 cm)有絲分裂指數(shù)較高，且1 g/L的番紅染液比改良的苯酚品紅染液染色效果好。肖桂芝等[5]發(fā)現(xiàn)大蒜根尖有絲分裂指數(shù)與根尖長(zhǎng)度、取材時(shí)間有關(guān)，一般根長(zhǎng)為2～4 cm。另外，肖桂芝等[6]和曹芳等[7]研究也發(fā)現(xiàn)低溫(4 ℃)處理可以提高大蒜的有絲分裂指數(shù)；李志超等[8]也發(fā)現(xiàn)溫度和取材時(shí)的根長(zhǎng)度及它們之間的交互作用對(duì)大蒜和洋蔥根尖有絲分裂指數(shù)有顯著影響。除此以外，王玉清等[9]對(duì)實(shí)驗(yàn)材料的選擇、取材的時(shí)間、解離、漂洗及染色液的選擇等方面進(jìn)行了綜述，并提出了改進(jìn)意見。趙廣宇等[10]對(duì)利用紅蔥根尖觀察有絲分裂提出了優(yōu)化方案，并探究了廢電池浸出液對(duì)紅蔥根尖分生區(qū)有絲分裂的影響。

各種實(shí)驗(yàn)教材中關(guān)于壓片法制備植物有絲分裂標(biāo)本的方法除染色劑不同(Schiff試劑、苯酚品紅或改良的苯酚品紅)外，其它大體相同，只是有的先搗碎根尖再染色[11]，而有的先染色再搗碎根尖[12-14]。在本試驗(yàn)中采用的是先搗碎根尖再進(jìn)行染色，并用解剖針輕輕攪拌，根尖細(xì)胞染色較均一。

姚世鴻等[15]研究表明，大蒜根尖細(xì)胞在一晝夜中存在有絲分裂最高峰期和幾個(gè)次高峰期。雖然本試驗(yàn)沒有研究夜間根尖細(xì)胞的有絲分裂情況，但在白天8：00—16：00水培養(yǎng)的大蒜根尖就存在高峰期(14：00)和次高峰期(10：00)，而10-9mol/L IAA培養(yǎng)的大蒜根尖僅存在高峰期(8：00)。10-9mol/L IAA培養(yǎng)的大蒜根尖與水培養(yǎng)得到的大蒜根尖相比，有絲分裂指數(shù)大大提高，由1.91%～3.68%增加到1.91%～9.11%，并且中、后期細(xì)胞由0.38%～1.47%增加到0.80%～3.55%。IAA不僅可以改變大蒜有絲分裂的高峰期，還可以增加有絲分裂指數(shù)、提高中后期細(xì)胞的比例，這可能與IAA的生理功能有關(guān)。因此，為了提高有絲分裂實(shí)驗(yàn)成功率和實(shí)驗(yàn)效果，建議大蒜根尖培養(yǎng)時(shí)，添加10-9mol/L IAA，并于早晨8：00(根長(zhǎng)2～3 cm)取材為宜。