董洪鋼，劉春立，劉秀霞，李 業(yè)，楊艷坤，白仲虎

(1.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，無錫 214122;2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122;3.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，無錫 214122)

甲羥戊酸是合成萜類化合物的重要前體化合物，萜類化合物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、香料和著色劑等方面，是甲羥戊酸代謝途徑中間代謝產(chǎn)物[1]。甲羥戊酸途徑存在于原核細胞和高等植物葉綠體中[2]。如圖 1所示，甲羥戊酸代謝途徑上游途徑：乙酰輔酶 A在乙酰輔酶 A硫解酶和HMG-CoA 合成酶催化下縮合生成3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)。接著，HMG-CoA在HMG-CoA還原酶作用下生成甲羥戊酸 (MVA)。下游途徑：MVA 經(jīng)焦磷酸化和脫羧作用形成異戊二烯焦磷酸(IPP)，經(jīng)異構(gòu)化轉(zhuǎn)化為二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)。且上游甲羥戊酸中間代謝產(chǎn)物HMG-CoA大量積累會影響細胞生長[3]。

圖1 甲羥戊酸途徑Figure 1 Biosynthetic pathways of mevalonate

復(fù)雜代謝途徑在引入異源宿主時，原本存在宿主中的天然調(diào)節(jié)系統(tǒng)常常會丟失，這可能導(dǎo)致相關(guān)外源代謝途徑產(chǎn)生代謝物失衡，或者造成異源代謝途徑中有毒中間代謝產(chǎn)物積累，抑制細胞生長[4]。研究人員受自然細胞組織啟發(fā)，利用蛋白質(zhì)及核酸在細胞體內(nèi)構(gòu)建不同種類人工區(qū)室化系統(tǒng)，以提高異源代謝途徑效率[5-9]。Dueber等[10]通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用在大腸桿菌中構(gòu)建蛋白質(zhì)區(qū)室系統(tǒng)，引入甲羥戊酸合成途徑，甲羥戊酸產(chǎn)量提高77倍。Müller等[11]將葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根過氧化物酶(HRP)通過與DNA支架固定化，與無支架酶相比，兩種支架系統(tǒng)反應(yīng)效率均得到提高。Delebecque等[12]將RNA支架區(qū)室系統(tǒng)應(yīng)用于氫氣生產(chǎn)中，大幅提高氫氣產(chǎn)量?，F(xiàn)已將RNA支架系統(tǒng)設(shè)計為離散0維(0D)RNA支架，1維(1D)RNA支架和2維(2D)RNA支架。0D RNA支架具有共聚集代謝通路中的酶、減少有毒中間代謝產(chǎn)物積累和高產(chǎn)目標化合物的潛力[8,13-14]。RNA支架系統(tǒng)理論上包含兩個模塊：模塊一為表達RNA支架；模塊二為表達RBDs及代謝通路中的酶。

研究利用RNA支架系統(tǒng)提高大腸桿菌甲羥戊酸產(chǎn)量。首先，設(shè)計0D PP7 RNA支架系統(tǒng)。通過RNA凝膠遷移實驗(RNA-EMSA)體外驗證RNA適配體和其相對應(yīng)RBDs是否存在相互作用。隨后，構(gòu)建RBDs與熒光蛋白融合表達的菌株以評估0D RNA支架系統(tǒng)效率。最后，構(gòu)建異源MVA途徑生產(chǎn)甲羥戊酸工程菌，并應(yīng)用0D PP7 RNA支架系統(tǒng)以提高其甲羥戊酸產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

研究中大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)分別應(yīng)用于質(zhì)?？寺〖叭毎呋Ｙ|(zhì)粒pACYCDuet-1、pETDuet-1用于異源基因表達及0D PP7 RNA支架系統(tǒng)構(gòu)建。合成基因及引物均來自金唯智(蘇州)；所用菌株及質(zhì)粒如表 1所示。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 The strains and plasmids used in this study

續(xù)表1(Continued Table 1)

1.1.2 試劑和儀器

主要包括島津高效液相色譜LC-20A；島津氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS-QP2020 SYSTEM)；蛋白純化儀AKTA purifier UPC10(美國通用電氣公司)。所用其他材料及設(shè)備參照文獻[15]。

1.1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。用于培養(yǎng)大腸桿菌。M9培養(yǎng)基：33.7 mmol/L Na2PO4,22.0 mmol/L KH2PO4,8.55 mmol/L NaCl,9.35 mmol/L NH4Cl,1 mmol/L MgSO4,0.3 mmol/L CaCl2,1 mg/L生物素,1 mg/L維生素B1,0.134 mmol/L EDTA,31 mmol/L FeCl3·6H2O,6.2 mmol/L ZnCl2,0.76 mmol/L CuCl2·2H2O,0.42 mmol/L CoCl2·2H2O,1.62 mmol/L H3BO3,0.081 mmol/L MnCl2·H2O,3 g/L酵母提取物和20 g/L葡萄糖。用于甲羥戊酸生產(chǎn)。所有培養(yǎng)基中氨芐青霉素和氯霉素終濃度為100 mg/L和30 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建

使用引物對BamH Ⅰ-mvaE-F/PstⅠ-mvaE-R、BamH Ⅰ-mvaS-F/PstⅠ-mvaS-R、BamH Ⅰ-ΔPP7-mvaE-F/PstⅠ-mvaE-R，以實驗室前期構(gòu)建的質(zhì)粒為模板擴增基因mvaS、mvaE、ΔPP7mvaE，在pACYCDuet-1的第一個多克隆位點通過BamH Ⅰ和PstⅠ雙酶切連接插入基因片段，得到質(zhì)粒pACYCEH、pACYCSH、pACYCPEH。

使用引物對PET-PP7-F/PET-PP7-R線性化載體pETANTIPB，使用T4 PNK酶磷酸化PCR片段，通過T4連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒pETANTIP。引物對PP7-EGFP-F/PP7-EGFP-R和EGFP-PP7-F/EGFP-PP7-R融合基因GFP及ΔPP7。隨后以pACYCDuet-1為模板骨架,通過同源重組構(gòu)建質(zhì)粒pACYCPGFP。以質(zhì)粒pACYCPGFP為模板，使用引物對PP7-EGFP-F/pACYC-GFP-R線性化載體，使用T4 PNK酶磷酸化片段后通過T4連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒pACYCGFP。柔性蛋白接頭連接mvaS和mvaE，并通過同源重組以質(zhì)粒pACYCPGFP模板擴增骨架構(gòu)建重組質(zhì)粒得到pACYCPES。以質(zhì)粒pACYCPES為骨架通過線性化構(gòu)建質(zhì)粒pACYCES。

表2 研究所用引物Table 2 Primes used in this study

1.2.2 RNA-EMSA實驗

經(jīng)超聲破碎后胞內(nèi)蛋白樣品通過AKTA purifier純化儀進行純化。PP7 RNA探針由金唯智(蘇州)合成，引物序列為rGrGrCrArCrArGrArArGrArUrArUrGrGrCrUrUrCrGrUrGrCrC，RNA-EMSA試劑盒購自賽默飛世爾，實驗方法參考說明書(https:∥assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0011686_LightShift_Chemiluminescent_RNA_EMSA_UG.pdf)。

1.2.3 表達熒光蛋白菌株培養(yǎng)條件

平板上隨機挑選3個菌落PCR驗證為陽性克隆，接種至LB種子培養(yǎng)基于37 ℃，220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。次日轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基LB中，當(dāng)OD600至0.6～0.8添加 0.5 mmol/L IPTG 并降溫至30 ℃誘導(dǎo)熒光蛋白表達。24、48 h取1 mL樣品檢測細胞密度及熒光強度。

1.2.4 熒光強度檢測

樣品稀釋至適當(dāng)濃度后，于F97 PRO熒光分光光度計和759S紫外可見分光光度計進行熒光和細胞密度的測定。單細胞熒光強度通過FACSArica III(BD Bioscience，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，USA)測定。

1.2.5 甲羥戊酸發(fā)酵及樣品制備和測定

發(fā)酵實驗：在平板上隨機挑選3個菌落PCR驗證為陽性克隆，接種至LB種子培養(yǎng)基于37 ℃，220 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日按發(fā)酵液體積1%轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基M9中，OD600至0.6～0.8添加0.5 mmol/L IPTG并降溫至30 ℃誘導(dǎo)蛋白表達發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸。24、48 h取1 mL樣品檢測細胞密度和甲羥戊酸產(chǎn)量。

樣品制備及測定：取280 μL發(fā)酵液上清液與70 μL 300 mmol/L HCl和過量無水硫酸鈉混合，將甲羥戊酸從酸形式轉(zhuǎn)化為內(nèi)酯形式。向每個樣品中添加350 μL乙酸乙酯并在漩渦儀上以最大速度振蕩3 min，離心取有機層。對上層乙酸乙酯層甲羥戊酸內(nèi)酯含量采用GC/MS分析測定，色譜條件見參考文獻[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 0D PP7 RNA 支架設(shè)計

RNA支架系統(tǒng)由表達RNA支架和表達融合RBDs及代謝通路中的酶組成。RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域源自PP7病毒外殼蛋白，RBDs與其相應(yīng)RNA適體緊密結(jié)合[17-18]?？梢酝ㄟ^簡單互補配對原則對核酸二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。RNA適配體PP7二級結(jié)構(gòu)由RNAfolds(http:∥rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfolds.cgi)預(yù)測，見圖2(a)。0D PP7RNA支架理論模型如圖2(b)所示：藍色線條代表這兩段序列前后可以通過堿基之間互補配對原則形成二聚體，而RNA支架適配體理論上可以與RBDs相互作用募集RBDs。代謝通路中的酶與RBDs融合表達時，RNA支架系統(tǒng)通過RNA適配體與RBDs相互作用實現(xiàn)酶在空間上共聚集。

圖2 0D PP7 RNA支架的示意圖Figure 2 Schematic overview of the artificial 0D PP7 RNA scaffolds

2.2 RNA-EMSA體外驗證適配體和RBDs相互作用

構(gòu)建表達mvaE，mvaS，ΔPP7mvaE菌株(方法見1.2.1)，分別使用引物對BamH Ⅰ-mvaE-F/T7Terminator Primer(2770bp)；BamH Ⅰ-mvaS-F/PstⅠ-mvaS-R(1152bp)；BamH Ⅰ-ΔPP7-mvaE-F/T7Terminator Primer(3180bp)以平板中的單菌落為模板進行菌落PCR驗證，挑選條帶大小正確的克隆送測序，獲得正確克隆，菌落PCR驗證圖見圖3(a)和(b)。RNA-EMSA實驗結(jié)果如圖3(c)。泳道1確認探針位置。相比泳道1，泳道2和4均無遷移，而泳道3呈現(xiàn)遷移。說明PP7適配體與蛋白MVAS、MVAE之間無相互作用，與ΔPP7之間存在相互作用。

2.3 應(yīng)用熒光蛋白GFP評估RNA支架系統(tǒng)效率

質(zhì)粒pETDuet-1與質(zhì)粒pACYCPGFP、pACYCGFP及質(zhì)粒pACYCduet-1共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，得到3個重組菌株(BLCCG、BLCPG、Control)，以評估RBDs對GFP表達的影響程度。發(fā)酵實驗(方法見1.2.3)結(jié)果如圖4所示：IPTG誘導(dǎo)48h后，相比對照菌株BLCCG，表達RBDs菌株BLCPG的GFP相對強度提高129%[圖4(b)]；質(zhì)粒pETANTIP和pACYCGFP共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組菌株(BLPCG)以評估RNA支架對GFP表達影響程度。相比對照菌株BLCCG，表達RNA支架的菌株BLPCG的GFP相對強度提高126%[圖4(b)]；將表達RNA支架質(zhì)粒pETANTIP與pACYCPGFP共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，得到重組菌株BLPPG。相比對照菌株BLCCG，表達0D PP7RNA支架系統(tǒng)菌株BLPPG的熒光強度提高375%[圖4(b)]；同時，細胞綠色熒光蛋白強度也進行流式細胞儀檢測，由實驗結(jié)果可知：BLCCG中熒光強度平均值為15021，細胞占65.4%[圖4(c)]。表達RBDs菌株BLCPG熒光強度平均值為34768，細胞占92.9%見[圖4(d)]；表達RNA支架菌株BLPCG熒光強度平均值為48471，細胞占86.7%[圖4(e)]。表達RNA支架系統(tǒng)菌株BLPPG熒光強度平均值為69634，細胞占99.0%[圖4(f)]。

2.4 構(gòu)建異源途徑合成甲羥戊酸

克隆來源于Enterococcusfaecalis(E.faecalis)編碼乙酰輔酶A硫解酶/HMG-CoA還原酶基因mvaE及3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)合酶基因mvaS[19]。通過(GGGGS)3蛋白接頭融合蛋白MVAE和MVAS，克隆得到pACYCDuet-1。菌落PCR驗證見圖5(a)經(jīng)測序確認得到重組質(zhì)粒pACYCES。將質(zhì)粒pACYCES轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，獲得異源MVA途徑合成甲羥戊酸工程菌BLCES。隨后進行發(fā)酵實驗，通過GC/MS檢測發(fā)酵液中甲羥戊酸，樣品制備和測定見1.2.5。實驗結(jié)果如圖5所示：(b)～(d)分別為1g/L 甲羥戊酸標樣，對照菌株及菌株BLCES發(fā)酵液上清液GC檢測結(jié)果。(e)和(f)為甲羥戊酸內(nèi)酯質(zhì)譜圖。甲羥戊酸內(nèi)酯保留時間為13.27min，圖5(d)保留時間為13.27min出峰，且信號強度顯著高于對照菌株，特征離子與甲羥戊酸內(nèi)酯一致。以上結(jié)果表明異源MVA代謝途徑已成功構(gòu)建。

(a)菌落PCR驗證結(jié)果，1～10為質(zhì)粒 pACYCEH轉(zhuǎn)化子菌落PCR條帶，11～19為質(zhì)粒 pACYCSH轉(zhuǎn)化子菌落PCR條帶，M1為DL10000 Maker；(b)菌落PCR驗證結(jié)果，1～6為質(zhì)粒pACYCPEH轉(zhuǎn)化子菌落PCR條帶，M1為DL10000 Maker；(c)1～4分別為PP7 probe、PP7 probe &MVAE、PP7 probe &ΔPP7MVAE和PP7 probe &MVAS。圖3 RNA-EMSA 體外驗證適配體和RBDs的相互作用Figure 3 In vitro validation of the binding of aptamers to RBDs by RNA-EMSA

(a)評估0D PP7 RNA支架系統(tǒng)效率菌株構(gòu)建示意圖；(b)BLCCG、BLCPG、BLPCG、BLPPG相對GFP熒光強度；(c)～(f)BLCCG、BLCPG、BLPCG和BLPPG流式細胞儀熒光定量結(jié)果。圖4 熒光蛋白GFP評估RNA支架系統(tǒng)效率Figure 4 Evaluation of RNA scaffold system efficiency by fluorescent protein GFP

2.5 應(yīng)用0D RNA支架系統(tǒng)提高甲羥戊酸產(chǎn)量

共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pACYCES、pACYCPES、pETANTIP和pETDuet-1，得到4個菌株(BLCES、BLPES、BLCPES和BLPPES)，進行發(fā)酵實驗(方法見1.2.5)?；谇捌陬A(yù)實驗，IPTG誘導(dǎo)24h取完待測樣后，補加終濃度為10g/L葡萄糖。

反應(yīng)原理圖如圖6(a)所示，上圖示意無支架系統(tǒng)胞內(nèi)反應(yīng)理論模型，下圖示意存在RNA支架系統(tǒng)胞內(nèi)反應(yīng)理論模型。甲羥戊酸產(chǎn)量如圖6(b)，IPTG誘導(dǎo)48h后，相比對照菌株BLCCES，表達RNA支架菌株BLPCES甲羥戊酸產(chǎn)量提高了47%，達2.49g/L。表達RBDs菌株BLCPES甲羥戊酸產(chǎn)量略有提升，提高了14%，達1.95g/L。表達RNA支架系統(tǒng)菌株BLPPES甲羥戊酸產(chǎn)量增加了84%，達3.13g/L。

細胞密度如圖7(a)所示，OD600為3～6。碳源消耗如圖7(b)所示，IPTG誘導(dǎo)24h后，不同菌株發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛冉档?g/L左右。補充碳源后，相應(yīng)碳源消耗量與相對應(yīng)甲羥戊酸產(chǎn)量吻合，菌株BLPPES碳源消耗最多，甲羥戊酸產(chǎn)量最高。

3 討論

研究在大腸桿菌中引入0D PP7RNA支架系統(tǒng)，基于上游MVA途徑外源基因，構(gòu)建生成甲羥戊酸工程菌。相比對照菌株BLCCES，表達0D PP7RNA支架系統(tǒng)工程菌BLPPES提高甲羥戊酸發(fā)酵濃度至3.13g/L。首先設(shè)計0D PP7RNA支架系統(tǒng)，并通過RNA-EMSA體外證明RNA支架系統(tǒng)中適配體與RBDs存在相互作用。以GFP評估0D PP7RNA支架系統(tǒng)效率，結(jié)果表明：與對照相比，表達RNA支架系統(tǒng)菌株BLPPG熒光強度提高了375%。利用0D RNA支架系統(tǒng)提高大腸桿菌生產(chǎn)甲羥戊酸的研究發(fā)現(xiàn)，表達RNA支架菌株甲羥戊酸產(chǎn)量比對照略有提升，與使用GFP評估RNA支架系統(tǒng)效率結(jié)果趨勢一致。表達0D PP7RNA支架系統(tǒng)菌株甲羥戊酸產(chǎn)量最高，說明RNA支架系統(tǒng)可提高大腸桿菌生產(chǎn)甲羥戊酸的產(chǎn)量。因此，RNA支架系統(tǒng)有潛力應(yīng)用于復(fù)雜代謝途徑(如異戊二烯合成途徑)提高目標化合物產(chǎn)量。

(a)菌落PCR驗證結(jié)果；標樣(b)、對照(c)以及重組菌株BLES的GC檢測結(jié)果(d)；(e)(f)甲羥戊酸內(nèi)酯質(zhì)譜圖。圖5 異源MVA途徑菌株構(gòu)建驗證Figure 5 Construction and verification of heterologous MVA pathway strains

(a)有無RNA支架反應(yīng)示意圖；(b)甲羥戊酸產(chǎn)量。圖6 表達RNA支架系統(tǒng)對合成甲羥戊酸的影響Figure 6 Effect of expression RNA scaffold system on synthesis of mevalonate

(a)菌株細胞密度；(b)發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛群图琢u戊酸產(chǎn)量。圖7 細胞生長及碳源消耗情況Figure 7 Cell growth and carbon source consumption