李春春,王曉琴,王功伍,4,曹 軍

(1.云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物能源持續(xù)開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心和云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2.云南師范大學(xué) 體育學(xué)院，昆明 650500；3.云南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院 云南省植物繁殖適應(yīng)與進(jìn)化生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500；4.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院國(guó)家衛(wèi)健委毒品依賴和戒治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032)

嗎啡(morphine,MOP) 等阿片類藥物作為麻醉鎮(zhèn)痛藥，臨床用量大，長(zhǎng)期使用易致耐受和成癮[1]。成癮藥物可致腦功能異常，停藥后會(huì)出現(xiàn)戒斷癥狀，引發(fā)渴求和復(fù)吸。如何避免復(fù)吸則是成癮治療研究的關(guān)鍵。根據(jù)條件反射學(xué)說(shuō)，在條件反射(即記憶)建立后，若反復(fù)僅給條件刺激而不給非條件刺激，可使該條件反射減弱甚至消失，即消退(extinction)。消退雖非原記憶的遺忘，是新記憶的形成，但消退記憶的建立可抑制原成癮記憶的提取，并有望用于藥物成癮復(fù)吸的治療[2-4]。有研究證明前額葉(prefrontal cortex,PFC)在成癮記憶表達(dá)和消退中發(fā)揮的重要作用[2,5-6]，并試圖通過(guò)各種手段刺激腹內(nèi)側(cè)PFC治療非物質(zhì)成癮[7]。腦電圖(electroencephalograph,EEG)功率譜是研究腦功能狀態(tài)的重要手段。急、慢性給MOP均可使猴[8-10]或大鼠[11-12]PFC的EEG-γ頻段活動(dòng)受到抑制，而阿片類受體拮抗劑納洛酮(naloxone,NLX)可阻斷這種效應(yīng)[11]。和曉明等[13]發(fā)現(xiàn)，NLX處理可使已建立條件位置偏愛(ài)(conditioned place preference,CPP)的MOP成癮大鼠PFC下邊緣(infralimbic,IL)亞區(qū)θ和γ頻段功率提高。潘群皖實(shí)驗(yàn)室的系列研究[14-17]表明，在大鼠MOP或海洛因成癮戒斷或消退中PFC前邊緣(prelimbic,PL)和IL兩亞區(qū)EEG功率譜特定頻段功率等指標(biāo)發(fā)生事件相關(guān)性改變。但MOP成癮記憶已消退動(dòng)物PFC的EEG功率譜狀態(tài)尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于PFC在藥物成癮中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)在MOP-CPP成癮小鼠模型的基礎(chǔ)上，探討訓(xùn)練消退(training extinction,TE)和NLX干涉對(duì)PFC-EEG功率譜的影響，為闡明阿片類藥物成癮消退的電生理機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明小鼠40只，雌雄各半，由遼寧長(zhǎng)生生物提供，許可證：SCXK(遼)2015—0001；實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)為5周齡，體重為38～46 g。動(dòng)物房濕度約55%±5%，溫度20 ℃～24 ℃，12 h/12 h明暗交替。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲食，實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)1周，每天抓握、撫摸，以減少應(yīng)激效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)流程如圖1(a)所示，所有操作均遵照國(guó)家和云南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 CPP實(shí)驗(yàn)

CPP實(shí)驗(yàn)分為適應(yīng)、篩選、訓(xùn)練、測(cè)試等階段，詳見(jiàn)文獻(xiàn)[18]。使用動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)(北京天鳴宏遠(yuǎn)，Xeye Aba V3.2)記錄15 min內(nèi)動(dòng)物在各箱的活動(dòng)時(shí)間。適應(yīng)2 d。將小鼠分為MOP-自然消退(natural extinction,NE)組、MOP-訓(xùn)練消退(training extinction,TE)組、SAL-NE組和SAL-TE組(均n=10)。訓(xùn)練以時(shí)間較短一側(cè)為伴藥箱，間隔24 h交替給鹽酸嗎啡(沈陽(yáng)第一制藥廠)或生理鹽水SAL (h.)。MOP為劑量遞增給藥(10、15、20、25和30 mg/kg)，注射后放入CPP箱，訓(xùn)練10 d后，進(jìn)行第1次測(cè)試(Test 0)。嗎啡劑量和給藥方式參照文獻(xiàn)[19-21]。CPP分?jǐn)?shù)=伴藥箱時(shí)間/(伴藥箱時(shí)間+非伴藥箱時(shí)間)×100%。

(a)CPP行為學(xué)和EEG記錄實(shí)驗(yàn)流程圖；(b)記錄電極尖端的位置。CPP：條件位置偏愛(ài)；SAL：生理鹽水；MOP：?jiǎn)岱?；NLX：納洛酮；mPFC：內(nèi)側(cè)前額葉；NE：自然消退；TE：訓(xùn)練消退。圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖及EEG記錄電極在小鼠腦中的位置Figure 1 Timeline of behavioral and EEG experiment and position of EEG recording electrodes in mouse brain

1.2.2 MOP-CPP消退

CPP建立后即進(jìn)行消退(5 d)。MOP-TE組和SAL-TE組動(dòng)物均在SAL注射后將動(dòng)物置于偏好箱中，其他同訓(xùn)練期。每天TE結(jié)束6 h后測(cè)試。MOP-NE組和SAL-NE組在MOP-CPP建立和測(cè)試后不做任何處理，5 d后再測(cè)試1次(Test 5)。

1.3 EEG信號(hào)采集和功率譜數(shù)據(jù)處理

行為實(shí)驗(yàn)完成后，戊巴比妥鈉(60 mg/kg,i.p.)麻醉小鼠，常規(guī)備皮后固定于腦定位儀(深圳瑞沃德)中，暴露顱骨，鉆孔并插入絕緣不銹鋼電極(Φ150 μm，尖端裸露300 μm)，參考電極位于嗅球上方。根據(jù)小鼠腦圖譜[22]，以前囟為原點(diǎn)確定記錄電極坐標(biāo)(mm):AP+1.5，ML±0.5，DV-2.6。使用生理信號(hào)采集系統(tǒng)(RM6240，成都儀器廠)記錄EEG，待信號(hào)穩(wěn)定10 min(基線)后，注射NLX(5 mg/kg,i.p.,上海源葉生物)，再連續(xù)記錄60 min，每10 min取10 s EEG數(shù)據(jù)，經(jīng)FFT變換為功率譜數(shù)據(jù)，計(jì)算總功率(1～100 Hz)及δ(1～4 Hz)、θ(4～8 Hz)、α(8～12 Hz)、β(12～30 Hz)、γ1(30～45 Hz)和γ2(55～100 Hz)功率。相對(duì)功率=(絕對(duì)功率-基線功率)/基線功率×100%。

1.4 組織學(xué)檢查

EEG記錄結(jié)束后，通過(guò)電極向腦內(nèi)通正向直電流(6 V,10 s)。然后麻醉處死動(dòng)物，灌流SAL和4%甲醛溶液(含1%亞鐵氰化鉀)固定，取腦后再固定7 d，振動(dòng)切片(100 μm)，焦油紫染色，鏡檢電極位置。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 組織學(xué)檢查

組織學(xué)檢查表明，多數(shù)動(dòng)物電極位于內(nèi)側(cè)前額葉(mPFC)中央?yún)^(qū)域，見(jiàn)圖1(b)。將電極位置不對(duì)的數(shù)據(jù)排除后，每組有8只動(dòng)物用于數(shù)據(jù)分析。

2.2 CPP建立及消退

CPP建立。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)表明，兩給藥組基線CPP分?jǐn)?shù)差異不明顯(T21.358=-0.865,P=0.397)，而CPP訓(xùn)練后MOP組分?jǐn)?shù)顯著高于SAL組(T26=-6.905,P=0.000)。配對(duì)樣本t檢驗(yàn)也表明，SAL組經(jīng)10 d訓(xùn)練，其CPP分?jǐn)?shù)仍與基線無(wú)差異(T14=1.281,P=0.221)；而MOP組則較基線增加(T12=-9.047,P=0.000)，說(shuō)明MOP-CPP模型建立成功(表1)。

表1 小鼠MOP-CPP測(cè)試及訓(xùn)練消退CPP分?jǐn)?shù)Table 1 Mouse MOP-CPP score of test and training extinction

CPP消退。GLM-RM分析表明，MOP-TE組和MOP-TE組具有明顯的時(shí)間主效應(yīng)(均F2,14≥22.495,P=0.000)，但MOP-NE組經(jīng)自然消退(NE)5 d后CPP分?jǐn)?shù)仍高于基線(GLM-RM配對(duì)比較：P=0.001)，說(shuō)明NE不能使MOP-CPP完全消退。而MOP-TE組CPP分?jǐn)?shù)隨訓(xùn)練消退(TE)天數(shù)增加而逐漸下降，5 d后已降至基線/SAL組水平(P≥0.494)，低于MOP-NE組(P=0.043)，提示TE處理能有效促進(jìn)MOP-CPP消退。

2.3 EEG功率

2.3.1 線性總功率

絕對(duì)總功率。功率譜曲線如圖2所示，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3(a)所示，方差分析表明，注射NLX前各組間存在差異(F3,18=3.473,P=0.038)；多重比較表明，MOP-TE組總功率低于SAL-TE組和MOP-NE組(均P≤0.030)，而其余3組間無(wú)差異(均P≥0.335)。注射NLX后，各時(shí)段均有組間差異(均F3,20≥4.913,P≤0.011)。GLM-RM組內(nèi)效應(yīng)分析表明，絕對(duì)總功率存在時(shí)間主效應(yīng)(F2.361,37.777=40.876,P=0.000)，說(shuō)明其隨NLX處理時(shí)間延長(zhǎng)而升高。時(shí)間×藥物、時(shí)間×消退和時(shí)間×消退×藥物交互效應(yīng)均不明顯(均F2.361,37.777≤3.014,P≥0.053)，提示絕對(duì)總功率隨時(shí)間增加的趨勢(shì)受藥物和消退處理的影響均較弱，主要是NLX的獨(dú)立效應(yīng)。GLM組間比較提示，EEG總功率組間差異主要受藥物和消退方式兩種因素共同影響，故藥物×消退交互所致組間差異顯著(均F1,16≥10.253,P≤0.006)，說(shuō)明藥物和消退方式可相互作用而非獨(dú)立影響因素。藥物和消退處理雖對(duì)總功率單獨(dú)影響較小，但兩者交互作用可使MOP-TE組功率降低。

(a)～(d) δ-β,1～30 Hz;(e)～(h) γ1-2,30～100 Hz;(a)和(e) SAL-NE;(b)和(f) SAL-TE;(c)和(g) MOP-NE;(d)和(h) MOP-TE。圖2 MOP-CPP消退和NLX處理小鼠的PFC-EEG功率譜代表性曲線Figure 2 Representative curves of mouse PFC-EEG power spectrum treated by MOP-CPP extinction manners and NLX

(a)絕對(duì)功率；(b)相對(duì)功率。* 為P<0.05；** 為P<0.01，單因素方差分析。BL：基線；SAL：生理鹽水；MOP：?jiǎn)岱?；NE：自然消退；TE：訓(xùn)練消退；NLX：納洛酮。圖3 不同消退方式和NLX處理對(duì)小鼠PFC-EEG總功率的影響Figure 3 Effect of different extinction treatments and NLX on the total EEG power in the mouse PFC

相對(duì)總功率。如圖3(b)所示，單因素方差分析表明，NLX注射后10～40 min時(shí)間段組間差異較小(均P≥0.215)，僅50 min和60 min存在組間差異(均F3,14≥5.364,P≤0.011)，多重比較表明該時(shí)間段MOP-NE組相對(duì)總功率降低(均P≤0.010)。GLM-RM組內(nèi)效應(yīng)分析表明，相對(duì)總功率也具有時(shí)間主效應(yīng)(F5,55=23.095,P=0.000)，即EEG總功率在NLX注射后隨時(shí)間上升，與絕對(duì)總功率表現(xiàn)相似。時(shí)間×藥物和時(shí)間×消退交互效應(yīng)均不明顯(均F5,55≤1.684,P≥0.154)，說(shuō)明NLX所致相對(duì)總功率的增長(zhǎng)不受MOP藥物和消退方式的單獨(dú)影響；藥物×消退交互效應(yīng)對(duì)NLX提高有較強(qiáng)影響(F5,55=4.609,P=0.001)，提示NLX雖與藥物或消退的交互效應(yīng)不強(qiáng)，但相對(duì)總功率仍受時(shí)間×藥物×消退三因素交互作用影響。GLM-RM組間效應(yīng)分析表明，相對(duì)總功率的組間差異不明顯 (均F1,11≤3.527,P≥0.087)。

2.3.2 線性功率譜成分

基線功率譜。方差分析表明，θ、α、β和γ1的基線功率存在組間差異(均F1,18≥3.343,P≤0.042;圖4)，其中MOP-TE組功率降低，而其他3組相似。θ、α、β基線組間差異主要來(lái)自消退處理(θ、α、β:F1,18≥5.766,P≤0.027)；γ1基線差異可能部分來(lái)自藥物處理(MOP-CPP,P=0.027)。這些頻段基線的組間差異應(yīng)是總功率基線組間差異的主要來(lái)源。

NLX對(duì)EEG功率譜的影響。GLM-RM組內(nèi)效應(yīng)分析表明，注射NLX后，各頻段功率在整體上均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，具有時(shí)間主效應(yīng)(均F≥13.760,P=0.000)。其中時(shí)間×藥物交互效應(yīng)主要影響θ和γ2頻段(均F≥3.717,P≤0.019)；時(shí)間×消退交互效應(yīng)主要影響θ頻段(F2.686,48.355=11.867,P=0.000)；時(shí)間×藥物×消退三因素交互效應(yīng)主要影響δ和θ頻段(均F≥4.729,P≤0.007)。GLM組間效應(yīng)分析表明，δ和α組間差異來(lái)自藥物和消退兩獨(dú)立因素；θ組間差異來(lái)自藥物、消退和消退×藥物交互作用3種情形；β組間差異受消退和消退×藥物交互作用影響；而γ1組間差異來(lái)自藥物和消退×藥物交互作用的影響(均F≥5.767,P≤0.027)。各頻段具體表現(xiàn)如圖4、圖5所示。

(a)δ；(b)θ；(c)α；(d)β；(e)γ1；(f)γ2。* 為P<0.05,** 為P<0.01，單因素方差分析。BL：基線；SAL：生理鹽水；MOP：?jiǎn)岱龋籒E：自然消退；TE：訓(xùn)練消退；NLX：納洛酮。圖4 MOP-CPP消退和NLX處理對(duì)小鼠PFC-EEG功率譜各頻段成分功率的影響Figure 4 Effect of MOP-CPP extinction and NLX treatment on the PEC EEG power spectrum in mice

(a)δ；(b)θ；(c)α；(d)β；(e)γ1；(f)γ2。* 為P<0.05,** 為P<0.01，單因素方差分析。BL：基線；SAL：生理鹽水；MOP：?jiǎn)岱?；NE：自然消退；TE：訓(xùn)練消退；NLX：納洛酮。圖5 MOP-CPP消退和NLX處理后小鼠PFC-EEG功率譜各頻段成分功率的變化Figure 5 Effect of MOP-CPP extinction and NLX treatment on the PEC EEG power spectrum in mice (Δ%)

3 討論

3.1 TE處理對(duì)MOP-CPP成癮小鼠PFC-EEG功率譜的影響

阿片類藥物成癮戒斷后易復(fù)吸，尋找可有效消除復(fù)吸的方法一直是研究熱點(diǎn)。CPP模型主要用于檢測(cè)動(dòng)物在特定情境下對(duì)獎(jiǎng)賞物的成癮記憶[23]。研究以MOP隔日劑量遞增方式處理10 d后，小鼠CPP分?jǐn)?shù)較SAL組及自身基線明顯提高，MOP-CPP模型建成。以此為基礎(chǔ)，經(jīng)5 d消退，TE組CPP分?jǐn)?shù)已降至基線水平，而NE組CPP分?jǐn)?shù)仍較高(表1)。該結(jié)果與以往采用恒定劑量(10 mg/kg)造模和TE處理效果[24-26]一致，證明TE處理可有效促進(jìn)MOP-CPP的消退。我國(guó)學(xué)者也據(jù)此創(chuàng)造性提出成癮記憶的提取-消退法去解決復(fù)吸問(wèn)題[3-4]。但人類成癮記憶線索眾多，僅靠消退記憶不能完全抑制復(fù)吸[27-28]，研究則提示成癮消退動(dòng)物與正常動(dòng)物在PFC-EEG功率方面仍有區(qū)別。

PFC是成癮記憶表達(dá)和消退的關(guān)鍵腦區(qū)[2,6]。早期研究發(fā)現(xiàn)MOP等阿片類藥物急、慢性處理可影響大鼠或猴PFC-EEG活動(dòng)狀態(tài)，抑制PFC-γ振蕩[8-12]，而NLX則對(duì)MOP急性處理或CPP大鼠PFC-θ/γ功率有改善作用[11,13]。研究則首次探討了MOP成癮記憶已消退動(dòng)物PFC-EEG功率譜狀態(tài)和NLX的影響，發(fā)現(xiàn)MOP-TE組PFC-EEG總功率降低，而NLX有改善作用。這說(shuō)明MOP不僅可急性抑制EEG功率，也可在MOP成癮記憶形成后發(fā)揮長(zhǎng)久影響，即便成癮記憶消退，抑制性影響依然存在，提示成癮消退動(dòng)物的PFC功能異常，有復(fù)吸可能。值得注意的是，MOP-CPP未消退的MOP-NE動(dòng)物，其PFC-EEG功率卻與SAL組接近，提示TE或消退記憶可能對(duì)MOP成癮動(dòng)物PFC-EEG有抑制作用。MOP-NE組的成癮記憶未見(jiàn)消退，這可能在一定程度上維持了較高的PFC-EEG功率，使其基線水平接近SAL組。MOP-CPP和TE單獨(dú)處理組(MOP-NE和SAL-TE)EEG功率相近，但受兩因素疊加作用的MOP-TE組總功率和θ、α、β及γ1等頻段功率均降低，這也許是TE處理消除了MOP成癮記憶的影響所致。

3.2 NLX處理對(duì)MOP-CPP成癮消退小鼠PFC-EEG功率譜的影響

研究發(fā)現(xiàn)，NLX雖可使PFC-EEG功率總體呈增加趨勢(shì)，但功率譜成分的改變有組間差異。SAL-NE組δ、θ和α頻段功率在NLX處理后迅速提高，而SAL-TE組與MOP-NE組則增速較緩，提示這些EEG頻段受消退影響。但也可能是由于SAL-TE處理程序與MOP-TE相同，重復(fù)注射SAL有痛覺(jué)刺激卻無(wú)MOP的麻醉鎮(zhèn)痛作用，從而使動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激所致。另外，MOP-TE組雖然各頻段基線功率較低，但其θ、α和γ2頻段在NLX處理后的增速高于MOP-NE，這提示TE處理對(duì)成癮動(dòng)物PFC-EEG功率譜有正性調(diào)控，但TE影響阿片類藥物成癮的具體機(jī)制及其與復(fù)吸的關(guān)系仍有待深入研究。

4 結(jié)論

研究首次發(fā)現(xiàn)TE處理可使MOP-CPP消退小鼠PFC-EEG總功率和θ、α、β和γ1頻段功率降低，而NLX可以促進(jìn)EEG功率譜功率提高。研究基于以往研究結(jié)果[13]，進(jìn)一步證明，PFC-EEG功率譜，特別是θ、α和γ頻段功率是PFC參與阿片類藥物成癮及其消退的重要電生理指標(biāo)。