童鑫怡，韋 錚，陳 梅，程 鴻，黃先智，丁曉雯,

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.重慶市巴南區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，重慶 401320；3.西南大學科技處，重慶 400716）

氧化應激是機體遭受不利刺激時，體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性分子，但由于抗氧化系統(tǒng)成分未能完全進行清除，氧化物的產(chǎn)生和清除失衡，從而導致組織功能受到嚴重損傷[1-2]。氧化應激能引起多種組織包括心肌組織、肝組織、肺組織、腎組織、腦組織、脊髓等的損傷[3]。

腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是代謝最活躍的器官，其特征是需氧量較高[4]但抗氧化能力相對較低。NADPH氧化酶是活性氧生成的關鍵部位，腦血管對NADPH氧化酶類功能和活性敏感性較全身動脈系統(tǒng)更強[5-6]，因此，大腦可能更易受到氧化應激影響[7]。腦組織作為支配人的行為、接受各種信息的組織，對人的正常生活十分重要，腦組織長期受到損傷，可能會致殘和致死[8-9]，人體健康受到威脅。若早期對氧化應激進行干預，可以顯著改善腦組織的損傷[3]。因此，控制腦組織的氧化應激，對保持腦組織的健康具有重要意義。

茶葉除了具有清熱降火、祛風解暑的多種傳統(tǒng)養(yǎng)生食療藥理功效，還被證明具有降糖降脂等功能[10]。在對腦組織氧化損傷的保護方面，目前相關研究成果較多的一種茶葉活性成分主要是茶多酚，研究表明茶多酚對受到氧化損傷的腦組織具有保護作用，其機制與降低氧化應激反應有關，在干預氧化應激反應中，茶多酚對自由基的形成有抑制作用，并對改善抗氧化酶活性有良好效果[11-12]。茶多糖作為茶葉中重要的功能成分之一，被證實了其具有較強抗氧化性和生物活性，可清理多種活性自由基[13-14]，但關于茶多糖的相關研究成果報道相對較少。目前，在氧化應激損傷方面的科學研究中，生物大分子受到的活性氧化應激損傷一直是重要的研究熱點領域，活性自由基在攻擊生物大分子時會造成生物蛋白質(zhì)、DNA 分子結構和功能的改變、脂質(zhì)過氧化[15]等，并伴有疾病的發(fā)生。因此，本研究旨在探究茶多糖-茶多酚混合成分對生物大分子和抗氧化酶的氧化損傷干預探究其對腦組織氧化損傷的改善作用，從食療方面干預調(diào)節(jié)腦組織的氧化應激，為相關功能性食品的開發(fā)奠定理論基礎。同時，茶多糖經(jīng)模擬胃腸消化后仍具有較強的抗氧化能力[16]，為動物試驗及功能性評價提供了有利依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

基礎飼料、SPF 級的4 周齡（平均質(zhì)量20 g 左右）雄性昆明小鼠84 只 重慶醫(yī)科大學實驗動物中心（許可證號SCXK（渝）2018-0003）提供；茶多糖-茶多酚（茶多糖含量為56.93%，茶多酚含量為19.37%，蛋白質(zhì)含量為0.096%，水分含量為9.67%，灰分含量為13.21%）湖南華城生物資源股份有限公司生產(chǎn)；D-Gal、PBS 緩沖液（0.01mol/L，pH7.2～7.4）北京索萊寶科技有限公司；蛋白質(zhì)羰基（PCO）、晚期蛋白氧化產(chǎn)物（AOPP）、3-硝基酪蛋白（3-NT）、丙二醛（MDA）、8-異前列腺素（8-iso-PG）、8-羥基脫氧鳥嘌呤（8-OHdG）、5-羥基胞嘧啶（5-OH-DG）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）酶聯(lián)免疫分析試劑盒 廈門嘉慧生物科技有限公司（LOT 202011）。

Symergy H1 酶標儀 美國基因公司；Allegra X-22R 型高速離心機 由貝克曼庫爾特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物飼養(yǎng)、造模及分組 按西南大學實驗動物保護和使用規(guī)則進行實驗飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為相對濕度40%～60%，室溫23±2 ℃，12 h 明暗交替，自由飲水，飼喂基礎飼料。84 只昆明種雄鼠隨機分籠，每籠5 只，適應性飼養(yǎng)1 周后，用苦味酸對小鼠個體進行標記，分出12 只小鼠為正常飼養(yǎng)對照組，一直繼續(xù)喂飼基礎飼料；其余小鼠每天同一時間腹腔注射0.1 mL/10 g·bw 的10%D-半乳糖[17-18]，持續(xù)45 d，建立小鼠氧化應激損傷模型。造模組和正常組小鼠血清的MDA 含量是否存在顯著性差異，判斷造模是否成功。如果不成功，繼續(xù)喂飼D-半乳糖直到造模成功。

將造模成功后的小鼠隨機分成模型對照組（灌胃與實驗組同劑量的生理鹽水）、陽性藥物對照組（灌胃還原型谷胱甘肽，200 mg/kg·bw）、茶多酚對照組（灌胃50 mg/kg·bw）、茶多糖-茶多酚低劑量組（灌胃40 mg/kg·bw）、中劑量組（灌胃100 mg/kg·bw）、高劑量組（灌胃250 mg/kg·bw），每天同一時間段灌胃1 次，灌胃體積為0.1 mL/10 g·bw，持續(xù)45 d，實驗劑量以及灌胃周期均按照預實驗有完善結果確定。

1.2.2 腦組織樣本采集及制備 灌胃45 d，小鼠停止飼喂飼料不禁水12 h，取血后的小鼠采用頸椎脫位法處死，解剖，取出小鼠腦組織，用冰冷的生理鹽水進行沖洗去除表面多余血水，濾紙吸干表面水分，液氮進行速凍，于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

準確稱取小鼠的腦組織樣本0.2 g，加入PBS 緩沖液1.8 mL 勻漿，將勻漿液于4 ℃、3000 r/min 離心15 min，取出上清液于-80 ℃保存、備用。

1.2.3 相關指標測定 腦組織中PCO、AOPP、3-NT、8-iso-PG、8-OHdG、5-OH-DG、MDA、SOD、GPX水平測定，均按照試劑盒內(nèi)說明書操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 茶多糖-茶多酚對小鼠腦組織生物大分子氧化損傷的影響

2.1.1 對小鼠腦組織蛋白質(zhì)氧化損傷的影響 研究表明，ROS 易攻擊蛋白質(zhì)，直接或間接導致蛋白質(zhì)結構和活性遭到破壞[19-20]。氧化應激會產(chǎn)生包括可逆和不可逆修復的各種蛋白質(zhì)功能損傷，不可逆修復的蛋白質(zhì)功能損傷包括羰基化合物的形成[21]，蛋白質(zhì)羰基含量與某些疾病的可能發(fā)生程度具有密切相關性，因此蛋白質(zhì)羰基含量通常是衡量蛋白質(zhì)氧化損傷的標志[22]。AOPP 是氧化損傷產(chǎn)生的含二氫鳥氨酸的交聯(lián)蛋白質(zhì)產(chǎn)物[23]，是一種評估交聯(lián)蛋白質(zhì)產(chǎn)物氧化功能損傷的重要標志。3-NT 是硝化應激的關鍵產(chǎn)物，是一種蛋白質(zhì)受到氧化損傷的特異性產(chǎn)物[24-25]，3-NT 水平也可以用于判定蛋白質(zhì)氧化損傷程度。考察茶多糖-茶多酚混合功能成分作用下，實驗小鼠腦組織上述3 個蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物水平，結果見表1。

表1 茶多糖-茶多酚對小鼠腦組織PCO、AOPP、3-NT 水平的影響Table 1 Effects of tea polysaccharides-tea polyphenols on PCO,AOPP and 3-NT in brain of mice

表1 顯示，和正常組比較，模型組小鼠腦組織的PCO、AOPP、3-NT 水平分別增加了36.66%、15.94%、20.61%（P＜0.05），表明模型組小鼠發(fā)生了蛋白質(zhì)氧化損傷；與模型組比較，茶多酚組小鼠腦組織的PCO、AOPP、3-NT 水平分別降低了19.69%、13.66%（P＜0.05）、12.39%（P＞0.05），實驗劑量的茶多酚未能使3-NT 完全恢復到正常組水平，可使其他2 個指標與正常組呈現(xiàn)不顯著差異（P＞0.05），表明茶多酚單獨作用時對蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生的硝化產(chǎn)物恢復力不夠；茶多糖-茶多酚中、高劑量組小鼠腦組織的PCO 水平分別減少29.19%、22.95%（P＜0.05），AOPP 水平分別減少13.17%、15.23%（P＜0.05），3-NT 水平分別減少15.36%、15.29%，均與模型組形成顯著性差異（P＜0.05），且恢復至正常組水平（P＞0.05）；與茶多酚組比較，茶多糖-茶多酚高劑量組使PCO、AOPP、3-NT 水平分別降低了4.06%、1.81%、4.96%（P＞0.05），總體趨勢較茶多酚組是下降的，恢復力更強。上述結果表明，茶多糖-茶多酚高劑量組能有效使模型小鼠腦組織的PCO、AOPP、3-NT 水平下降并且恢復至正常水平，對小鼠腦組織蛋白質(zhì)氧化損傷具有恢復作用，且作用效果優(yōu)于同劑量茶多酚組。

2.1.2 對小鼠腦組織脂質(zhì)過氧化的影響 許多生物大分子因受到氧化應激從而產(chǎn)生過量活性分子和生物大分子的嚴重的損傷，其中包括脂質(zhì)[26]。MDA 是脂質(zhì)氧化的最終代謝產(chǎn)物，其含量表現(xiàn)抗氧化系統(tǒng)的活性。8-iso-PG 是一種特異的通過花生四烯酸的自由基介導的非酶促過氧化產(chǎn)生的化合物，是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化最具體的標志[27]，測定其水平用以精確評估脂質(zhì)氧化損傷程度。考察茶多糖-茶多酚混合功能成分作用下，實驗小鼠腦組織脂質(zhì)過氧化指標水平的變化，結果見表2。

表2 茶多糖-茶多酚對小鼠腦組織MDA、8-iso-PG水平的影響Table 2 Effects of tea polysaccharides-tea polyphenols on MDA and 8-iso-PG in brain of mice

表2 顯示，和正常組比較，模型組小鼠腦組織的MDA、8-iso-PG 水平分別增加了46.16%、42.61%（P＜0.05），表明模型組小鼠發(fā)生了脂質(zhì)過氧化。與模型組相比，茶多酚組小鼠腦組織的MDA、8-iso-PG 水平分別降低16.81%（P＞0.05）、20.44%（P＜0.05），而與正常組相比，實驗劑量的茶多酚使8-iso-PG 恢復至正常水平，而未能使MDA 完全恢復至正常水平，表明茶多酚對脂質(zhì)過氧化的修復能力不足；茶多糖-茶多酚中、高劑量組的MDA 水平分別降低17.68%、25.23%（P＜0.05），8-iso-PG 水平分別降低32.06%、23.15%，均與模型組形成顯著性差異（P＜0.05）且恢復到正常組水平（P＞0.05）；與茶多酚組比較，茶多糖-茶多酚高劑量組使MDA、8-iso-PG 水平分別降低了10.12%、3.40%（P＞0.05），差異雖然不顯著，但總體趨勢是下降的，恢復力更強。上述結果表明，茶多糖-茶多酚高劑量組能有效使模型小鼠腦組織的MDA、8-iso-PG 水平下降恢復至正常水平，對小鼠腦組織脂質(zhì)氧化損傷具有改善作用，且效果優(yōu)于同劑量茶多酚組。

2.1.3 對小鼠腦組織DNA 氧化損傷的影響 DNA受到氧化，將產(chǎn)生大量堿基修飾產(chǎn)物[28]，8-OHdG、5-OH-DG 就是重要產(chǎn)物，測定其水平可以評價DNA氧化損傷的程度，結果見表3。

表3 茶多糖-茶多酚對小鼠腦組織8-OHdG、5-OH-DG水平的影響Table 3 Effects of tea polysaccharides-tea polyphenols on 8-OHdG and 5-OH-DG in brain of mice

表3 顯示，和正常組比較，模型組小鼠腦組織的8-OHdG、5-OH-DG 水平分別增加了49.15%、33.79%（P＜0.05），表明模型組小鼠DNA 發(fā)生了氧化損傷。和模型組比較，茶多酚組小鼠腦組織的8-OHdG、5-OH-DG 水平分別降低14.18%（P＞0.05）、18.44%（P＜0.05），而與正常組相比，實驗劑量的茶多酚使5-OHDG 恢復至正常水平，但未能使8-OHdG 恢復至正常水平（P＜0.05），表明茶多酚對DNA 氧化損傷修復能力不足；茶多糖-茶多酚中、高劑量組小鼠腦組織的8-OHdG 水平分別降低36.59%、32.36%（P＜0.05），5-OH-DG 水平分別減少19.92%、28.63%，均與模型組形成顯著性差異（P＜0.05）；與茶多酚組相比較，茶多糖-茶多酚高劑量組小鼠腦組織的5-OH-DG、8-OHdG 水平分別降低了12.50%（P＞0.05）、21.19%（P＜0.05），形成顯著性差異。上述結果表明，茶多糖-茶多酚高劑量組能有效使模型小鼠腦組織的8-OHdG、5-OH-DG 水平下降且恢復至正常水平，對小鼠腦組織DNA 氧化損傷具有修復作用，其作用效果比同劑量茶多酚組更優(yōu)。

2.2 茶多糖-茶多酚對小鼠腦組織酶類抗氧化劑的影響

SOD 是主要的抗氧化復合酶，其復合酶體系對氧自由基的大量清除抑制作用顯著[29]，從而維持著體內(nèi)氧化平衡。GPX 是調(diào)節(jié)活性氧水平的關鍵酶，使組織免受氧化損傷[30]，測定SOD、GPX 水平可以反映茶多糖-茶多酚作用下機體酶促抗氧化系統(tǒng)的抗氧化能力水平。結果見表4。

表4 茶多糖-茶多酚對小鼠腦組織SOD、GPX 濃度的影響Table 4 Effects of tea polysaccharides-tea polyphenols on SOD and GPX in brain of mice

表4 顯示，和正常組比較，模型組小鼠腦組織的SOD、GPX 濃度分別增加了29.00%、27.12%（P＜0.05），表明模型組小鼠發(fā)生了酶類抗氧化系統(tǒng)的損傷。和模型組比較，茶多酚組小鼠腦組織的SOD、GPX 濃度分別增加48.02%、29.35%（P＜0.05），且使SOD 恢復至正常組水平（P＞0.05），但未能使GPX 恢復至正常組水平（P＜0.05），表明茶多酚對抗氧化酶的抗氧化能力的恢復力不足；茶多糖-茶多酚中、高劑量組SOD 濃度分別增加34.63%、71.15%（P＜0.05），GPX 濃度分別增加28.60%、36.90%，均與模型組形成顯著性（P＜0.05）差異，與茶多酚組相比，茶多糖-茶多酚高劑量組小鼠腦組織的SOD、GPX 濃度分別增加15.63%（P＞0.05）、5.84%（P＜0.05）。上述結果表明，茶多糖-茶多酚高劑量組能有效使模型小鼠腦組織的SOD、GPX 濃度上升恢復至正常水平，對恢復小鼠腦組織酶類抗氧化系統(tǒng)抗氧化能力具有顯著效果，且作用效果優(yōu)于茶多酚組。

3 討論與結論

腦是人體內(nèi)結構復雜、功能完善、調(diào)節(jié)人體生理活動的重要器官，耗氧量大但清除自由基能力不足[2]，機體在受到外界有害刺激[31]，如缺氧、出血、中毒等，易造成自由基積累，大量的活性自由基將損傷腦細胞的結構[32]，使腦細胞內(nèi)外環(huán)境失衡，甚至造成腦細胞凋亡。體內(nèi)自由基和其他化學有害基團產(chǎn)生過多時，會直接導致細胞線粒體功能受損[33]，促進生物大分子氧化損傷以及炎癥發(fā)生。氧化應激會造成急性腦卒中、腦缺血、衰老等[34]疾病，腦組織長期受到損傷，會造成不可逆的后果。因此，控制并修復腦細胞的氧化損傷具有重要意義。

對保護腦組織損傷的研究[35]中證實，抗氧化劑通過清除過量的活性氧和降低生物大分子氧化產(chǎn)物水平改善氧化應激水平，從而對腦組織損傷起到修復作用。在對抗氧化酶抗氧化能力的研究中表明，抗氧化酶濃度越高，抗氧化能力越強[36]，本實驗探究SOD和GPX 抗氧化酶指標水平的變化來反映茶多糖-茶多酚干預后抗氧化酶抗氧化能力的變化，結果中顯示茶多糖-茶多酚復合物作用后，抗氧化酶SOD 和GPX濃度升高，對活性氧的清除能力提高，清除由于氧化應激反應產(chǎn)生的過量ROS，恢復其動態(tài)平衡，從而對氧化損傷具有一定的改善作用。

過量的ROS 通過一系列反應不斷攻擊生物大分子，包括蛋白質(zhì)的修飾氨基酸以及肽鍵，使其發(fā)生變性[37]，脂質(zhì)過氧化反應以及破壞DNA 鏈或改變DNA 空間構象[4]，導致DNA 功能喪失。實驗中選取蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 氧化產(chǎn)物作為考察指標，通過其水平的變化反映茶多糖-茶多酚作用效果。結果表明，茶多糖-茶多酚藥物干預后，均能使小鼠腦組織蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物PCO、AOPP、3-NT 水平，脂質(zhì)過氧化物MDA、8-iso-PG 水平以及DNA 氧化產(chǎn)物8-OHdG、5-OH-DG 水平顯著降低，表明生物大分子氧化損傷得到改善。這可能與茶多糖-茶多酚干預后，提高抗氧化酶活力，降低體內(nèi)由于氧化應激引起的活性氧的產(chǎn)生和清除失衡產(chǎn)生的過多活性氧水平，減少對生物大分子的損傷[38]，從而改善氧化應激反應對機體造成的傷害。

本實驗基于茶多糖在體內(nèi)保持其抗氧化活性這一基礎[16]，探究茶多糖-茶多酚混合物對生物大分子及酶類抗氧化系統(tǒng)氧化損傷的改善作用，結果發(fā)現(xiàn)，中、高劑量的茶多糖-茶多酚干預蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 的氧化和抗氧化酶抗氧化能力，其效果優(yōu)于茶多酚單獨作用的抗氧化效果，推測茶多糖和茶多酚協(xié)同抗氧化，其機理還需后續(xù)進一步實驗研究。

綜上所述，茶多糖-茶多酚協(xié)同對實驗小鼠腦組織氧化應激損傷具有改善作用，達到100 mg/kg·bw的中劑量后，其對腦組織生物大分子的氧化和抗氧化酶活力有很強的保護作用，能使測定的指標回到正常。本實驗結果為后續(xù)深度開發(fā)利用以茶多糖-茶多酚為主的混合功能成分的保健食品、減輕腦受氧化損傷導致的一系列損傷以及改善健康水平狀況具有重要意義。