彭丹丹，劉丹陽, ，李麗娜，劉澤陽，魯丁強,2,，龐廣昌,2,

（1.天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134；2.天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

近年來，隨著功能性食品和涉及使用過敏原蛋白的食品制造技術的出現(xiàn)，食物引起的過敏性病癥在逐步增加，食物過敏已經(jīng)成為引發(fā)食品安全和公共衛(wèi)生應急問題的主要原因[1-2]。目前尚無徹底根治食物過敏的措施，最為常見的避免食品過敏的方法是通過標簽上的過敏原標識，來減少患者對易致敏食品的接觸[3]，因此對各種食品基質中的過敏原進行靈敏檢測和適當?shù)臉撕炓?guī)則變得越來越重要。2019 年美國隨機調查了40443 人，研究發(fā)現(xiàn)大約10.8%的人群受到食物過敏的威脅[4]，其中兒童的發(fā)病率遠高于成年人，并且發(fā)病率仍在遞增[5]。牛乳蛋白是造成兒童過敏的最常見過敏原之一[6]，一旦誤食，會產(chǎn)生蕁麻疹、血管性水腫、嘔吐或急性特應性皮炎等早期反應或遲發(fā)性的胃腸道反應，例如腹痛、腹瀉等[7]。過敏問題嚴重影響著大眾健康和日常生活。早在2012 年國家就頒布相應法規(guī)要求對肉、蛋、奶、水產(chǎn)品等八類食品中常見過敏原進行檢測和標識以減少消費者因誤食而導致的過敏[8]。生物傳感器檢測作為一種新興技術，由多種學科交叉融合，具有易操作、響應快速及樣品用量少等特性[9]，用來監(jiān)控食品加工或臨床診斷將具有較大的優(yōu)勢[10]。因此，開發(fā)快速、高通量、高靈敏度的過敏原檢測方法對實施過敏原標識標準，避免食物過敏，保障大眾安全具有重要現(xiàn)實意義。

當前用于牛乳過敏原檢測技術主要包括拉曼光譜技術[11]、酶聯(lián)免疫法[12-13]、電化學傳感器技術[14-15]以及高效液相色譜法[16-17]等。酶聯(lián)免疫法在免疫反應的技術中，用于過敏原的檢測和定量，但存在不可避免的交叉反應，而且會出現(xiàn)假陽性；高效液相色譜法具有高靈敏度、高準確度的優(yōu)點，但儀器昂貴，檢測成本高，需要專業(yè)人員進行操作，不利于大量檢測。其中，電化學傳感技術響應快速、靈敏度高、成本低、操作簡便，被廣泛應用。采用電化學傳感技術檢測食物中的過敏原，多以過敏原的特異性單克隆抗體、多克隆抗體或適配體作為其生物識別元件，當待測物中有過敏原被生物識別元件捕獲并發(fā)生結合時，分子間的相互作用產(chǎn)生的化學信號被換能器接收并轉換為光電信號，而光電信號被信號處理系統(tǒng)進一步放大，從而實現(xiàn)對過敏原的定性和定量分析。Cao等[18]構建了一種基于金納米粒子和精氨酸/多壁碳納米管復合膜的電化學免疫傳感器，用于測定牛乳中的酪蛋白，線性范圍為102～104ng/mL。Eissa 等[19]在石墨烯修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極表面鍍一層4-氨基苯膜，然后在膜表面共價固定牛乳β-乳球蛋白抗體，建立的夾心型伏安電化學免疫方法檢測β-乳球蛋白，其線性檢測檢測范圍為1 pg/mL～100 ng/mL。

本研究基于電化學生物傳感技術，以殼聚糖為橋聯(lián)劑，結合納米金及辣根過氧化物酶電化學信號放大系統(tǒng)，并以FcεRI 受體蛋白為通用分子探頭吸附抗牛乳α-酪蛋白抗體IgE，構建了一種可用于食品中過敏原牛乳α-酪蛋白檢測的電化學納米免疫傳感器，傳感器在一定程度上模擬了體內(nèi)帶有FcεRI 受體的肥大細胞在接觸到變應原后所產(chǎn)生的超敏反應過程，為變應原診斷、食物變應原檢測、消除過敏原工藝和效果評價等提供了新的研究方法和思路。本研究所研制傳感器可以獲得Ka 等動力學參數(shù)，進行變應原所產(chǎn)生的變應動力學研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

FcεRI 受體蛋白、IgE 抗體 本實驗室制備；硫堇醋酸鹽 天津西典化學科技有限公司；無水乙酸山東辛格化工有限公司；殼聚糖 山東奧康生物科技有限公司；氯金酸 沈陽市金科試劑廠；檸檬酸鈉 青島銳洋生物科技有限公司；牛乳α-酪蛋白（Bos d 10，25 kD）美國Sigma 公司；所有試劑均為分析純。

JA1003P 電子分析天平 上海圣科儀器設備有限公司；UV-5100 紫外-可見光分光光度計 上海元析儀器有限公司；Talos L120C 透射電子顯微鏡 北京歐波同光學技術有限公司；CHI660E 型電化學工作站 常州九朝新能源科技有限公司；工作電極-玻碳電極（Φ=3 mm）、對電極-鉑絲電極、參比電極-Ag/AgCl 電極 天津艾達恒晟科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金納米粒子溶膠制備及表征 金納米粒子溶膠的制備采用檸檬酸鈉還原氯金酸法，具體操作如下[20]：以體積比1:25 將檸檬酸鈉溶液和中性氯金酸溶液混合，用碳酸鉀和碳酸鈉調節(jié)溶液的pH 為7.0，隨后將溶液放入微波爐中，用中火加熱10～15 min，觀察溶液的顏色變化，當溶液變成透亮的酒紅色時停止加熱，表明成功配制納米金粒子溶膠。然后將三角燒瓶用錫箔紙包裹，儲存于4 ℃黑暗環(huán)境中。

用紫外-可見分光光度計對450～700 nm[21]可見光范圍內(nèi)對新制備的納米金粒子溶膠進行全波長掃描；納米金溶膠顆粒的形狀、尺寸和分散度通過透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM）進一步表征。

1.2.2 電極預處理和電化學表征 玻碳電極預處理采用常規(guī)鋁粉打磨方法，具體操作如下：將直徑為4 mm的玻碳電極（glassy carbon electrode,GCE）按順序在廘絨面Al2O3的1.0、0.3 和0.05 μm 的粒徑進行拋光處理，每一次拋光后在超聲水浴中清洗約30 s，復清洗三次。最后將樣品沖洗干凈，用1:1 的HNO3，無水乙醇和超純水依次沖洗。清洗徹底后，采用掃描范圍為-0.1～1.0 V，掃描速率為100 mV/s 的循環(huán)伏安法，在1 moL/L H2SO4溶液中，激活電極，直至產(chǎn)生穩(wěn)定的循環(huán)伏安法曲線。然后采用循環(huán)伏安法（掃描范圍-0.1～0.6 V，掃描速率50 mV/s）表征電極預處理情況，反應底液為1 mmol/L K3Fe（CN）6+0.20 mol/L KNO3[22]。

1.2.3 電極組裝和電化學表征 納米金修飾IgE-FcεRI電化學免疫傳感器的制備參考文獻[23-24]方法并略有改進，如圖1 所示，具體過程如下：在預處理后的玻碳電極表面滴加硫堇-殼聚糖混合溶液，37 ℃光照培養(yǎng)箱干燥1 h；將上述電極置于0.5 mol/L NaOH溶液浸潤約5 min，隨后用超純水反復洗滌電極；將上述電極浸入裝有辣根過氧化物酶-納米金混合溶液[22]的1.5 mL 離心管中4 ℃自組裝過夜；取出上述電極，待37 ℃干燥30 min 后，滴加1 mg/mL FcεRI 受體蛋白溶液，37 ℃自組裝2 h，超純水潤洗；取含IgE的大鼠血清（＞100 ng/ml）滴加于上述干燥后電極，37 ℃孵育2 h 自組裝，超純水潤洗；將上述電極置于0.5%牛血清白蛋白溶液中37 ℃條件下孵育1 h，對非特異性位點進行封閉；得到納米金修飾的FcεRI-IgE 電化學納米免疫傳感器。

圖1 納米金修飾IgE-FcεRI 電化學納米免疫傳感器制備示意圖Fig.1 Schematic diagram of preparation of IgE-FcεRI electrochemical nano immunosensor

1.2.4 測定電壓優(yōu)化 采用時間-電流法對制備的生物傳感器在-0.5～-0.25 V 不同電位條件下進行測定，以超純水作為空白對照，實驗組以10-6mol/Lα-酪蛋白溶液的測試底液為例，不同電位對生物傳感器響應效果的影響用加入10-6mol/Lα-酪蛋白溶液前后的電流變化率來衡量。

1.2.5 檢測方法與原理 采用三電極檢測系統(tǒng)，以制備的IgE-FcεRI 納米傳感器為工作電極，Pt 絲為對電極，Ag/AgCl 為參比電極，空白對照為超純水。采用時間-電流曲線法，在優(yōu)化電壓下測定不同濃度的牛乳α-酪蛋白溶液的響應電流，以電流變化率對牛乳α-酪蛋白濃度作圖，如公式（1）為響應電流變化率計算方程：

式中：I1、I2分別代表牛乳α-酪蛋白測量前后同一時間點的響應電流，單位為A。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016 軟件進行處理，使用Origin 2018 進行分析作圖。

2 結果與分析

2.1 納米金粒子的表征

利用紫外-可見光分光光度計對所制備納米金溶膠吸光度進行掃描（400～700 nm），根據(jù)文獻[21]報道，光吸收性膠體金在可見光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，且光吸收峰的波長在510～550 nm 波長范圍內(nèi)隨膠體金顆粒的大小而變化，最大吸收波長為518 nm時，膠體金粒徑為15 nm；最大吸收波長為522 nm時，膠體金粒徑為24.5 nm。圖2A 所示，在波長520 nm左右有一個單一吸收峰，其粒徑可粗略估算約為15～20 nm；圖2B 透射電鏡（TEM）對納米金粒子表征結果顯示，其結構分布均勻，無聚集現(xiàn)象，呈球形顆粒狀，粒徑約為15～25 nm。

圖2 納米金溶膠的紫外可見光譜（A）和TEM 圖（B）Fig.2 UV-vis absorption spectrum (A) and TEM image (B) of nano gold sol

2.2 納米金修飾IgE-FcεRI 電化學免疫傳感器的電化學表征

根據(jù)循環(huán)伏安圖中氧化還原峰大小可粗略判斷電極表面生物分子修飾情況，如圖3A 所示，玻碳電極預處理后，氧化還原峰明顯升高，峰電位差△E=65 mV，峰電流之比Ip,a/Ip,c 約為1，表明電極表面已處理光滑干凈。

圖3 納米金修飾IgE-FcεRI 電化學免疫傳感器循環(huán)伏安法表征Fig.3 Cyclic voltammetry curve of IgE-FcεRI nanobiosensor assembly process

如圖3B 所示為電極組裝修飾過程，因為殼聚糖膜阻礙了電子傳遞，預處理的電極表面（曲線a）滴加硫堇-殼聚糖（曲線b）后，峰電流迅速下降，這是由于殼聚糖膜阻礙了電子傳遞，說明硫堇-殼聚糖復合膜成功組裝到電極表面。上述電極組裝納米金-辣根過氧化物酶復合膜后（曲線c），氧化還原峰電流迅速增大，這是因為納米金高電子密度及介電特性提高了電子傳遞效率且其作用遠遠超過辣根過氧化物酶對電子傳輸?shù)淖璧K作用，同時也表明成功組裝納米金-辣根過氧化物酶復合膜。與曲線c 相比，自組裝FcεRI受體蛋白后（曲線d）氧化還原峰電流略有降低，這是因為納米金可通過Au-S 鍵共價結合FcεRI 受體蛋白中含巰基氨基酸（甲硫氨酸、半胱氨酸[25]），蛋白大分子的存在阻礙了電極表面的電子傳遞，表明FcεRI受體蛋白成功修飾到電極表面[26]。當進一步修飾血清抗體IgE 于電極表面后，氧化還原峰電流進一步降低，表明電極成功自組裝吸附了抗體IgE 分子。在電極表面滴加牛血清白蛋白，進而封閉非特異性位點，傳感器即構建成功[24]，將組裝成功的電極置于磷酸緩沖液上方4 ℃保存，備用。

2.3 測定電壓優(yōu)化

采用時間-電流法對制備的生物傳感器在不同電位條件下進行測定，響應結果表明，電流值最大時電壓為-0.38 V。如圖4 所示，故選用恒定電位-0.38 V進行該生物傳感器對目標物質響應特性的研究。

圖4 傳感器在不同電壓下的電流變化率Fig.4 Current change rate of the sensor under different voltages

2.4 IgE-FcεRI 納米免疫傳感器與牛乳α-酪蛋白的作用規(guī)律

組裝好的電極用時間-電流法進行測定，縱軸為響應電流變化率，橫軸為牛乳α-酪蛋白濃度取對數(shù)lg（C）進行作圖。如圖5 所示，在10-12～10-10mol/L的濃度范圍內(nèi)，響應電流的變化率和α-酪蛋白的濃度線性相關。隨牛乳α-酪蛋白濃度的增加，響應電流變化率逐漸升高并成拋物線趨勢，當濃度達到10-5mol/L 時，響應電流變化率達到最大，表明IgE抗體分子被抗原蛋白大量結合。

圖5 牛乳α-酪蛋白在檢測濃度范圍內(nèi)的電流變化率Fig.5 Current change rate of α-casein in the detection concentration range

2.5 IgE-FcεRI 納米免疫傳感器與牛乳α-酪蛋白作用的動力學曲線

如圖6 所示，在10-12～10-10mol/L 牛乳α-酪蛋白濃度范圍的基礎上進一步細分，縱坐標為響應電流變化率，橫坐標為牛乳α-酪蛋白濃度進行作圖，受體配體反應方程如下：

圖6 α-酪蛋白在10-12～10-10 mol/L 濃度范圍內(nèi)的電流變化率Fig.6 Current change rate of α-casein in the concentration range of 10-12～10-10 mol/L

當受體飽和時：

[R]為受體濃度；[L]為配體濃度；[RL]為受體配體結合物的濃度；Kd為受體配體反應的常數(shù)；如果把[RT]設定為受體的初始濃度，則[R]=[RT]-[RL]；如果[LT]是總配體濃度，則[L]=[LT]-[RL]；將[L]=[LT]-[RL]與[R]=[RT]-[RL]代入方程（3）后，得到新式：

公式（4）是存在一個未知數(shù)的雙曲二次方程，變量為[RL]；當[RT]/Kd是固定值時，[RL]隨著[LT]的改變而發(fā)生變化，在開始時會快速上升，然后逐漸達到水平，這是受體-配體相互作用的飽和曲線。該方程式表明受體-配體結合具有配體飽和作用，類似于酶-底物相互作用，底物飽和效應是酶催化的標志。因此，本研究可以用類似于米氏常數(shù)（Km）的常數(shù)（Kd）來評價IgE-FcεRI 與牛乳α-酪蛋白的作用動力學。本研究將此常數(shù)稱為聯(lián)動變構常數(shù)（Ka）。

圖6 曲線用Origin 9.0 軟件進行雙曲線擬合可得如圖7 所示曲線。

如圖7 所示，當待測物變應原的濃度增加時，電流變化率也在隨之變大，表明受體還沒有達到飽和狀態(tài)，在隨著變應原濃度增加但電流變化率不再改變或變化很小時，表明此時受體已經(jīng)達到飽和狀態(tài)。上述過程和雙曲線擬合的結果及得出的擬合公式（表1）共同表明了該傳感器所反映的不僅是簡單的IgE 與牛乳α-酪蛋白的結合，而且還模擬了體內(nèi)受體與配體互作之后信號的傳導。

圖7 α-酪蛋白在10-12～10-10 mol/L 濃度范圍內(nèi)的響應曲線擬合Fig.7 Fitting the response curve of α-casein in the concentration range of 10-12～10-10 mol/L

表1 α-酪蛋白在10-12～10-10 mol/L 濃度范圍內(nèi)的響應曲線擬合參數(shù)Table 1 Response curve fitting the response curve of α-casein in the concentration range of 10-12～10-10 mol/L

2.6 IgE-FcεRI 納米免疫傳感器與牛乳α-酪蛋白作用的聯(lián)動變構常數(shù)

對公式（4）進行變形可以得到：

公式（5）是以縱軸為1/[RL]，橫軸為1/[L]的雙倒數(shù)方程；Kd/[RT]為直線的斜率，-1/Kd為橫軸截距，1/[RT]是縱軸截距。根據(jù)上述推導，橫軸為不同濃度的變應原溶液的倒數(shù)，縱軸以電流變化率的倒數(shù)進行作圖，得到圖8、表2。

表2 雙倒數(shù)法對α-酪蛋白（F）在10-12～10-10 mol/L濃度范圍內(nèi)作圖Table 2 Double reciprocal method to plot α-casein(F) in the concentration range of 10-12～10-10 mol/L

根據(jù)上述推導可得擬合的線性回歸方程為：

圖8 和擬合方程表明，牛乳α-酪蛋白-受體相互作用的規(guī)律符合雙倒數(shù)方程，由上述方程可知來源于牛乳（Bos domesticus）的α-酪蛋白的聯(lián)動變構常數(shù)Ka（Kd）值為4.096×10-12mol/L。

圖8 雙倒數(shù)法對α-酪蛋白（F）在10-12～10-10 mol/L濃度范圍內(nèi)作圖Fig.8 Double reciprocal method to plot α-casein(F) in the concentration range of 10-12～10-10 mol/L

3 討論

在本研究以自組裝的IgE-FcεRI 納米免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl 為參比電極，Pt 為對電極的三電極系統(tǒng)測定牛乳α-酪蛋白，從而進一步研究牛乳α-酪蛋白與IgE-FcεRI 納米免疫傳感器之間的傳感動力學，以實現(xiàn)對變應原的快速高效檢測。

測定變應原有不同的方法和目的[27]，主要分為以下兩個方面。一方面是測定食品中是否含有過敏原、有哪些過敏原[28]，目前的測定方法是酶聯(lián)免疫吸附實驗半定量測定方法，如表3 所列，趙凱等[29]通過使用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法來測定小麥球蛋白，最低檢測限為10 ng/mL。張宏立[30]使用蛋白芯片技術在IgE 的水平上測定變應原，該方法具有高通量測定的優(yōu)點，但易出現(xiàn)假陽性，對食品加工中奶粉的過敏物質[31]和保健品[32]的測定也同理。另一方面是在臨床診斷方面的應用，例如：在過敏原未知的情況下測定過敏癥狀由哪種過敏原引起的。當前較為常用的是皮膚點刺試驗方法（The skin prick test，SPT）[33]，但該方法靈敏度較低，為500 ng/mL，且SPT 結果呈陽性不一定代表患者對該食物過敏，如果沒有明確的病史和確定的口服激發(fā)實驗結果，SPT 陽性結果僅為無關的假陽性反應[34]。極低濃度的變應原也會引起過敏反應是當前食品行業(yè)和過敏臨床診斷最為亟待解決的問題。現(xiàn)在迫切需要一種具有高靈敏檢測特點的方法對過敏原進行測定，而納米免疫傳感器可以達到這種要求，可對低濃度的變應原進行檢測。

表3 變應原檢測方法比較Table 3 Comparison of allergen detection methods

本研究制作的IgE-FcεRI 納米免疫傳感器制作的第一步是通過固定應用廣泛的生物聚合物殼聚糖分子實現(xiàn)的，因為殼聚糖膜良好的生物相容性及富含-NH3+基團的三維化網(wǎng)狀結構可以用來固定大量的納米金粒子[34]，而后具有較大比表面積和良好導電性的納米金可以通過Au-S 鍵又可吸附大量FcεRI 受體蛋白；接下來在受體抗體特異性識別的背景下結合IgE，然后再組裝具有良好導電性和氧化還原特性的硫堇殼聚糖，最后利用辣根過氧化物酶的高效催化性將信號放大，通過采用電化學工作站位換能器和時間-電流法測定過敏原及其動力學。通過分析電流變化率可得出不同的過敏原與IgE-FcεRI 受體的作用規(guī)律符合雙曲線擬合標準（R2≧0.95），進而可計算出來源于牛乳（Bos domesticus）的α-酪蛋白的聯(lián)動變構常數(shù)Ka 值為4.096×10-12mol/L。本實驗方法在不依賴于組織或細胞系統(tǒng)的前提下使用一種新的信號轉導系統(tǒng)模擬胞內(nèi)信號傳遞過程，表現(xiàn)出良好的性能，并且具有測定靈敏度高，重復性和穩(wěn)定性好的優(yōu)點，證明本方法制備的納米免疫傳感器可以用于過敏原的檢測。

4 結論

本研究采用自組裝技術研制了一種基于殼聚糖-硫堇-納米金-FcεRI 和過氧化物酶信號放大系統(tǒng)的新型高靈敏納米傳感器，并且通過時間-電流曲線以牛乳α-酪蛋白為例進行了驗證，經(jīng)過分析電流變化率得出牛乳α-酪蛋白和FcεRI 受體的作用規(guī)律，結果符合雙曲線擬合標準R2≥0.95，利用雙倒數(shù)法得到α-酪蛋白的親和變構常數(shù)為4.096×10-12mol/L，本研究研發(fā)的生物傳感器可結合變應原的特異性IgE 并實現(xiàn)對過敏原的超敏感檢測，且其測定結果靈敏度相比目前最靈敏的方法還要高至少1 個數(shù)量級，該傳感器的研發(fā)為過敏原的臨床診斷、食品過敏原的安全檢測、過敏原消除技術和效果評估提供了新的研究方法和思路。

本研究使用新的電極組裝方法和高靈敏定量化測定過敏原的方法來模擬體內(nèi)帶有FcεRI 受體的肥大細胞在接觸到變應原后所產(chǎn)生的超敏反應過程，與蛋白質芯片技術相比，更加接近人體內(nèi)產(chǎn)生的過敏機制。