付瑞青，王 娟，郭衍銀,，王玉江，黃 雪

（1.山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東淄博 255049；2.淄博市數(shù)字農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展中心，山東淄博 255000）

羊肚菌（Morchella）隸屬于子囊菌門（Ascomycota）、盤菌綱（Pezizomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）[1]，是一種珍稀名貴的食、藥用菌，因其菌蓋表面凹凸不平、菌傘褶皺形似羊肚而得名[2-3]。羊肚菌味道鮮美，不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦質(zhì)元素，而且具有保肝、降血脂、增強免疫力、抗腫瘤、消食、抗疲勞、抗菌、抗氧化等保健功能[4-7]，受到廣大消費者青睞。

煲湯在我國具有悠久的歷史，中國古代南北朝時期的《食珍錄》一書中，記載“謝傳有湯法”[8]。人們一般認為，煲湯時間越長越好，使湯呈現(xiàn)濃郁、粘稠狀態(tài)，且營養(yǎng)豐富[9]。是否煲湯時間越長越好，不同學(xué)者依不同原料具有不同看法。武蘇蘇等[10]認為煮制鹵制雞肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在90 min 之后趨于穩(wěn)定，在120 min 時有下降趨勢；郭磊等[11]研究發(fā)現(xiàn)，隨著煮制時間的延長牛肝菌湯中谷氨酸和天門冬氨酸含量不斷減少，說明煮制時間過長對牛肝菌湯的營養(yǎng)風(fēng)味不利。

作為一種新興且主要作為湯料的食材，目前對羊肚菌風(fēng)味研究不多，僅蘭秀華[12]通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法研究了羊肚菌的主要成分。但羊肚菌在煮制過程中其營養(yǎng)物質(zhì)溶出規(guī)律如何，其作為煲湯材料時適宜煮制時間如何確定，尚未見報道。本實驗通過感官評價、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）和氨基酸自動分析儀對不同煮制時間的羊肚菌菌湯進行分析，確定了不同煮制時間對羊肚菌菌湯的感官、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及游離氨基酸的影響，以期為羊肚菌制湯及適宜時間的確定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌（干品）由山東和生菌業(yè)科技有限公司提供；2-辛醇 色譜純，上海源葉生物科技有限公司；17 種混合氨基酸標準溶液 質(zhì)量分數(shù)≥99%，Sigma公司；水合茚三酮、苯酚、氫氧化鈉、檸檬酸鈉 分析純，國藥集團試劑公司。

5977B 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）美國Agilent 公司；65 μm PDMS/DVB 萃取纖維頭美國Supelco 公司；LA8080 高速氨基酸分析儀 日本日立公司；電磁爐 九陽股份有限公司；GL-20G-2 臺式高速冷凍離心機 上海安亭儀器制造廠；AL-1D4 精密分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設(shè)計及樣品制備 將干品羊肚菌分為4 組，每組10 g。對于每組羊肚菌，用少量蒸餾水浸泡清洗后，放入到盛有800 g 蒸餾水的鍋中，然后將鍋置于電爐上加熱至沸騰，沸騰后調(diào)節(jié)電磁爐功率至300 W 使湯呈微沸狀態(tài)并計時。參考郭磊等[11]的研究，將4 組的微沸時間分別設(shè)為20、40、60 和120 min，到達時間后立即對湯進行稱重并取樣用于相應(yīng)指標分析和測定。

1.2.2 感官評價 采用感官評價的方法對湯樣進行感官評價并給出分數(shù)，由接受過感官評價培訓(xùn)且具有感官評價能力的13 人組成測評小組，對不同湯樣進行整體的感官評價，取平均分。感官評價的內(nèi)容及得分標準見表1。

表1 感官評價的評分標準Table 1 Scoring criteria for sensory evaluation

1.2.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

1.2.3.1 固相微萃取條件 取5 mL 煮好的羊肚菌湯加入樣品瓶中，并加入質(zhì)量濃度為100 mg/L 的2-辛醇溶液5 μL 作為內(nèi)標物，擰緊瓶蓋。將老化后的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，放于水浴鍋中60 ℃吸附30 min，將吸附后的萃取頭取出并插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，用于GC-MS 分析檢測。

1.2.3.2 GC-MS 檢測條件 參照Tietel[13]的實驗條件進行。

色譜條件：色譜柱：HP-5MS 毛細色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm，J&W Scientific,Folsom,CA,USA）；程序升溫：初始溫度40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min的速率升至70 ℃，保持1 min，以7 ℃/min 升至120 ℃，以13 ℃/min 升至250 ℃，保持1 min；載氣：純度大于99.99%的氦氣（He），流量：1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；不分流進樣。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃；四級桿溫度為180 ℃；電子能量70 eV；掃描方式為全掃描；掃描質(zhì)量范圍為35～350 m/z。

1.2.3.3 定性與定量方法 利用安捷倫GC-MS 軟件標準譜庫NIST17.L 對得到的譜圖數(shù)據(jù)進行串連檢索和人工解析[14]，選擇篩選匹配度大于80%的物質(zhì)。采用內(nèi)標法和面積歸一法進行定量分析。

根據(jù)內(nèi)標物和各物質(zhì)間的峰面積求出各揮發(fā)性物質(zhì)的含量，羊肚菌湯中各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量按照羊肚菌單位質(zhì)量計算。

1.2.4 游離氨基酸檢測 取10 mL 羊肚菌湯進行4000 r/min 離心10 min。按照GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》[15]的方法用氨基酸分析儀進行測定，平行測定三次。羊肚菌湯中各氨基酸總量按照羊肚菌單位質(zhì)量計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3 次，采用Excel 和SPSS 25.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin 2021 軟件進行作圖，采用鄧肯法進行顯著性分析，P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同煮制時間羊肚菌湯的感官評價結(jié)果

由表2 可知，在煮制40 min 時，羊肚菌湯的色澤、氣味、滋味得分分別為27.31、27.85 和38.23，總分為93.39，均顯著高于其他處理（P＜0.05）。隨著煮制時間的進一步延長，羊肚菌湯的感官評價得分反而降低，煮制時間60 和120 min 的評價總分僅為78.23 和65.45。這與蔣方國等[16]的研究結(jié)果一致。

表2 不同煮制時間的羊肚菌湯的感官評價分數(shù)Table 2 Sensory evaluation scores of Morchella soup at different cooking time

2.2 不同煮制時間對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化的影響

2.2.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的成分變化 不同煮制時間羊肚菌湯樣的GC-MS 的圖譜如圖1 所示。根據(jù)GC-MS 定性軟件鑒定分析，并剔除一些含硅氧烷類等柱流失物質(zhì)[17]，得到不同煮制時間羊肚菌湯的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分及含量（如表3 所示）。

圖1 不同煮制時間羊肚菌湯揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS 譜圖Fig.1 GC-MS spectra of volatile flavor compounds in Morchella soup at different cooking time

如表3 所示，羊肚菌湯樣中共鑒定出49 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括17 種酯類、6 種醛類、5 種烴類、4 種酸類、4 種唑類、2 種酮類、2 種醇類、2 種疊氮類、2 種環(huán)氧類、2 種噻吩類、3 種其他類物質(zhì)。其中煮制20、40、60 和120 min 的羊肚菌湯分別鑒定出22 種、35 種、31 種、27 種。煮制40 min 時揮發(fā)性物質(zhì)最多，再增加煮制時間反而減少，消失的物質(zhì)包括檸檬醛、2-丁基-2-乙基-5-甲基己-3,4-二烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、乙酸蘇合香酯、碳酸丙-1-烯-2-基十一烷基酯、三氯乙酸十一烯基酯、6,6-二甲基-2-乙烯基雙環(huán)[3.1.1]庚烷、1-疊氮辛烷、2,3-二氮雜雙環(huán)[2.2.1]hept-2-烯-5-乙烯基-4,7,7-三甲基、1,2-氧雜噻烷-6-十二烷基-,2,2-二氧化物、3-丙酰氧基十三烷、2,6-二甲基-4 氨基吡啶，這可能與揮發(fā)性物質(zhì)的揮發(fā)、沉淀或分解有關(guān)[18-19]。

表3 不同煮制時間羊肚菌湯中揮發(fā)性物質(zhì)成分及含量Table 3 Volatile flavor components and content of Morchella soup at different cooking time

續(xù)表 3

2.2.2 不同煮制時間對羊肚菌湯揮發(fā)性風(fēng)味成分總量的影響 不同煮制時間羊肚菌湯中00 不同種類物質(zhì)的總量如圖2 所示，醛類、酸類、酯類和烴類物質(zhì)的總量隨著煮制時間的延長先增加后減少，煮制40 min 時顯著高于其他煮制時間（P＜0.05），分別達到171.93、163.52、245.89 和34.35 mg/g；醇類、酮類和環(huán)氧類物質(zhì)的總量隨著煮制時間的延長先增加后減少，煮制60 min 時顯著高于其他煮制時間，分別達到9.10、58.93 和23.28 mg/g；而含氮類、含硫類和唑類物質(zhì)的總量隨著煮制時間的延長而減少，在煮制20 min 時顯著高于其他煮制時間（P＜0.05），分別達到49.72、95.59 和36.98 mg/g。

圖2 不同煮制時間對羊肚菌湯中不同種類物質(zhì)的總量變化Fig.2 Changes of the total mass of different substances in Morchella soup at different cooking times

醛類、酮類、醇類物質(zhì)是由于不飽和脂肪酸的熱氧化、氨基酸降解或美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的[20]，酯類物質(zhì)主要由醇類物質(zhì)和游離脂肪酸反應(yīng)生成[21]，這也是煮制過程中這些物質(zhì)產(chǎn)生的主要原因。但是，這些物質(zhì)一般具有揮發(fā)特性[22]，長時間煮制極易導(dǎo)致其從湯中揮發(fā)出去，進而含量減少乃至消失。Li、貢慧等[23-24]研究結(jié)果表明，長時間加熱會導(dǎo)致低級醛類物質(zhì)進一步氧化成酮類物質(zhì)，酮類物質(zhì)與其他物質(zhì)進一步反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，這可能是煮制時間過長致使羊肚菌湯中揮發(fā)性物質(zhì)減少的主要原因。

酯類物質(zhì)總量多，種類多但單種物質(zhì)含量低且都是長鏈酯類物質(zhì)對整體風(fēng)味其協(xié)同作用，賦予果香味[25]。壬醛和癸醛的閾值很低[26]，且各組分的含量高，賦予香味能力強，有著脂肪的香氣，是主要的特征風(fēng)味。酮類種類少且閾值較高[27]，對整體風(fēng)味其增強作用。

各樣品中均沒有檢測出1-辛烯-3-醇等普遍存在食用菌中的揮發(fā)性八碳化合物（C8H16O）[28]，這可能該類化合物穩(wěn)定性較差，在羊肚菌干制和煮制過程中導(dǎo)致破壞過多，使得該類物質(zhì)沒有檢出，這與謝麗源等[29]檢出結(jié)果一致。與蘭秀華等[12]的研究結(jié)果不同的是，羊肚菌中含量最多的揮發(fā)性物質(zhì)不是醇類、醛類和酮類物質(zhì)，而是酸類和酯類物質(zhì)，可能是煮制過程發(fā)生了反應(yīng)，生成了更多的酯類物質(zhì)，使羊肚菌湯的風(fēng)味更加豐富。

2.3 不同煮制時間對羊肚菌湯各種氨基酸含量及總量的影響

2.3.1 不同煮制時間對羊肚菌湯氨基酸組成及含量的影響 氨基酸不僅是參與人體新陳代謝的重要物質(zhì)，且對食品呈味具有重大貢獻[30]。如表4 所示，煮制40 min 時氨基酸種類最多，煮制40 min 時檢測出17 種氨基酸，包括呈鮮味的天冬氨酸和谷氨酸，呈甜味的蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸，呈苦味的纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸，不呈味的酪氨酸和半胱氨酸；煮制20 min 時檢測出15 種氨基酸，未檢出異亮氨酸和酪氨酸；煮制60 min 時檢測出14 種氨基酸，未檢出酪氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸。由表4 所示，不同煮制時間所得的羊肚菌湯樣中氨基酸比例差距不大，谷氨酸最高，脯氨酸和精氨酸含量次之，這與Gao 等[31]的研究結(jié)果一致，而高含量的谷氨酸可有效提高羊肚菌湯鮮味[32]。呈鮮味氨基酸的含量占比在煮制40 min 時顯著高于其他煮制時間（P＜0.05），達到31.43%；呈甜味氨基酸的含量占比在煮制60 min 時顯著高于其他煮制時間（P＜0.05），達到40.56%；而呈苦味氨基酸的含量占比在60 min 時最少，為26.28%，之后迅速增加。

2.3.2 不同煮制時間對羊肚菌湯各類氨基酸總量的影響 由圖3a 所示，呈鮮味氨基酸和呈甜味氨基酸的總量隨著煮制時間的延長先增加后降低然后趨于穩(wěn)定，在煮制40 min 時總量顯著高于其他煮制時間（P＜0.05），分別達到21.54 和25.40 mg/g；呈苦味氨基酸的總量在40 min 顯著高于其他煮制時間（P＜0.05），之后迅速降低，最高總量達到21.03 mg/g，60 min 降低了54.43%，但120 min 稍有升高。說明煮制40 min 是氨基酸溶出的高峰時期。

圖3 不同煮制時間羊肚菌湯中各類氨基酸總量和呈味氨基酸總量Fig.3 Changes of the total mass of flavored amino acids and total mass of various amino acids in Morchella soup at different cooking time

由圖3b 可見，總氨基酸量、必需氨基酸和非必需氨基酸總量隨著煮制時間的延長先增加后減少然后趨于穩(wěn)定，在煮制40 min 時總量顯著高于其他煮制時間（P＜0.05），分別達到70.20、11.54 和.66 mg/g，煮制60～120 min 氨基酸總量趨于穩(wěn)定。產(chǎn)生這種先升高后降低的現(xiàn)象的原因是，煮制過程中，蛋白質(zhì)與多肽熱解反應(yīng)和美拉德反應(yīng)使湯中產(chǎn)生大量游離氨基酸[33-34]。但是，隨著煮制時間的延長，熱解反應(yīng)和美拉德反應(yīng)速率下降[35]，同時伴隨著游離氨基酸脫氫，脫羧等氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為醛、胺等揮發(fā)性物質(zhì)[36]，使羊肚菌湯中游離氨基酸含量降低。

3 討論與結(jié)論

中國煮湯有個習(xí)慣認識，認為煮湯時間越長營養(yǎng)越豐富[37]。但根據(jù)本實驗結(jié)果，羊肚菌湯微沸煮制40 min 時揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類（35 種）最多，氨基酸分析也表明，總氨基酸（70.20 mg/g）、鮮味（21.54 mg/g）和甜味氨基酸（25.40 mg/g）最高總量也出現(xiàn)在40 min，因此，就羊肚菌煮湯而言，并非煮制時間越長越好，以微沸后煮制40 min 為宜。

中藥對煎制時間有著很嚴格的要求，徐宏偉[38]以八味地黃湯為研究對象，以其煎煮時間為變量，對湯劑的質(zhì)量進行有效檢測，并分析其藥汁與藥渣成分，結(jié)果表明：不同的煎煮時間所產(chǎn)生的藥汁、藥渣中物質(zhì)的種類和含量均有不同。因此，根據(jù)本實驗微沸煮制40 min 羊肚菌湯品質(zhì)最好的研究結(jié)果，如果想要獲得具有最佳羊肚菌風(fēng)味的雞、魚等湯，建議在煮制結(jié)束前40 min 添加羊肚菌為宜。

總之，本實驗對不同煮制時間羊肚菌湯的感官、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和氨基酸含量進行了分析，發(fā)現(xiàn)在煮制40 min 時羊肚菌湯的感官評分最高，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和氨基酸種類及含量也最高，隨著煮制時間的延長，羊肚菌湯的各種指標呈下降趨勢。因此，在使用羊肚菌煮湯時，應(yīng)以沸騰后微沸煮制40 min 為宜，不宜超過60 min。本研究確定了不同煮制時間對羊肚菌菌湯的感官、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及游離氨基酸的影響，以期為羊肚菌湯調(diào)味料的研究提供一定的理論基礎(chǔ)，為羊肚菌菌湯工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。此外，針對羊肚菌在煮制過程中游離氨基酸與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)間轉(zhuǎn)化的內(nèi)在機理及食鹽對羊肚菌游離氨基酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)釋放的影響還值得深入探討。