冉 丹，羅蘇蘇，張可欣，肖玥惠子，王淑霞，徐思敏，李 萌

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410007）

合成著色劑又稱合成色素，是一種重要的食品添加劑，可以改善食品色澤，較天然色素具有成本低、著色力好等優(yōu)勢，因而廣泛被應(yīng)用于食品工業(yè)[1-3]。在食品抽檢過程中發(fā)現(xiàn)，合成著色劑在蜜餞產(chǎn)品中應(yīng)用較多，如口味姜、獼猴桃果脯、楊梅涼果、芒果干等，一些蜜餞產(chǎn)品合成著色劑超標(biāo)情況頻頻出現(xiàn)。而合成著色劑作為一種化工產(chǎn)品，長期食用對人體存在一定的潛在危害[4-6]。因此，為保障食品安全，蜜餞中合成著色劑的檢測仍然是工作重點(diǎn)。

目前適用于測定蜜餞中合成色素的標(biāo)準(zhǔn)方法為GB 5009.35-2016[7]，該方法在蜜餞測定過程中存在諸多方面的問題[8-9]。該標(biāo)準(zhǔn)采用液液分配法和聚酰胺粉吸附法分別測定赤蘚紅和其他6 種合成著色劑，操作繁瑣、耗時(shí)長，不利于實(shí)現(xiàn)批量檢測。此外蜜餞樣品在抽提過程中，其殘?jiān)鼧O容易堵塞垂融漏斗，造成抽提困難，實(shí)驗(yàn)難以進(jìn)行。聚酰胺粉吸附法操作不當(dāng)，難以保證較好的回收率。

根據(jù)GB 2760-2014 規(guī)定[10]，我國允許在食品中添加的有機(jī)合成色素有11 種，分別為檸檬黃、日落黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、亮藍(lán)、赤蘚紅、酸性紅、誘惑紅、靛藍(lán)、喹啉黃。就現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法來看[7,11-13]，均只覆蓋部分產(chǎn)品類別和部分色素項(xiàng)目，難以滿足實(shí)際檢測需要。值得重視的是，和歐盟及其他國家法規(guī)相比較[14-16]，我國在合成著色劑方面的監(jiān)管還存在滯后情況，例如我國專利藍(lán)V、橙黃、麗春紅S 等還并未納入監(jiān)管范疇，也沒有相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)和方法，而在歐盟及其他國家已被允許應(yīng)用于食品工業(yè)。國外一些關(guān)于此類新型色素已屢有報(bào)道，如2019年6 月輸日食品違反日本食品衛(wèi)生法的情況，通報(bào)了源產(chǎn)地為俄羅斯的點(diǎn)心專利藍(lán)Ⅴ非法添加[17]；2020年12 月3 日，歐盟發(fā)布條例（EU）2020/1819，修訂（EC）No 1333/2008 附件Ⅱ中關(guān)于在鮭魚替代品中的色素使用規(guī)定[18]，其中就包含了橙黃和麗春紅S。由此可見，面對品類繁多的新型合成著色劑，我國相應(yīng)的法律法規(guī)及市場監(jiān)管亟待完善。

目前關(guān)于色素的分析研究，已有很多文獻(xiàn)報(bào)道，如劉珈伶[19]固相萃取法測定冰淇淋中6 種合成色素，唐一秋[20]采用色素專用柱測定茶飲料中9 種合成著色劑，夏宗艷等[21]采用90%丙酮作為提取劑，固相萃取法測定食品中8 種色素，高家敏等[22]采用高效液相色譜法同時(shí)測定飲料中12 種水溶性合成著色劑。但現(xiàn)有的文獻(xiàn)基本都是基于特定的樣品基礎(chǔ)，選擇性對部分色素類別進(jìn)行研究，沒有基于合成色素結(jié)構(gòu)特性，開發(fā)具有普適性的檢測方法。本研究旨在以蜜餞為樣品基礎(chǔ)，建立一個(gè)具有普適性的，可以檢測同類型合成著色劑的方法，并可以擴(kuò)展應(yīng)用到其他食品類別。同時(shí)對前處理各關(guān)鍵影響因素進(jìn)行探索研究，優(yōu)化色譜條件，以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)樣品中合成色素準(zhǔn)確、高效、高通量的檢測分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)品：檸檬黃（CAS 1934-21-0，0.5 mg/mL）、新紅（CAS 220658-76-4，1.0 mg/mL）、莧菜紅（CAS 915-67-3，0.5 mg/mL）、日落黃（CAS 2783-94-0，0.5 mg/mL）、胭脂紅（CAS 2611-82-7，0.5 mg/mL）、亮藍(lán)（CAS 3844-45-9，0.5 mg/mL）、赤蘚紅（CAS 16423-68-0，純度86.0%）、酸性紅（CAS 3567-69-9，純度87.4%）、誘惑紅（CAS 25956-17-6，純度86.0%）、酸性橙2（CAS633-96-5，純度80.8%）、靛藍(lán)（CAS 860-22-0，1.0 mg/mL）、麗春紅S（CAS 6226-79-5，純度91.4%）、喹啉黃（CAS 8004-92-0，純度90.5%）、專利藍(lán)Ⅴ（CAS 3536-49-0，純度89.7%）、酸性紅44（CAS 2766-77-0，純度85.0%）、食品紅1（CAS4548-53-2，純度90.5%）、橙黃1（CAS 523-44-4，純度88.3%）、酸性橙8（CAS 5850-86-2，純度99.9%）、亮藍(lán)G（CAS 6104-58-1，純度91.4%）、酸性紅50（CAS 5873-16-5，純度60.6%）均購于上海安譜公司。

乙酸銨、無水乙醇、氨水（分析純），甲醇、乙腈（色譜純）國藥集團(tuán)；Inspire C18色譜分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）迪馬科技有限公司；聚酰胺柱Cleanert PA（1 g/6 mL）天津博納艾杰爾科技有限公司；混合型強(qiáng)陰離子反相固相萃取柱 ProElut PXA（150 mg/6 mL）、混合型弱陰離子反相固相萃取柱ProElut PWA（150 mg/6 mL）、混合型弱陰離子反相固相萃取柱ProElut PWA-2（150 mg/6 mL）迪馬科技有限公司；混合型弱陰離子反相固相萃取柱Cleanert PWAX 柱（150 mg/6 mL）天津博納艾杰爾科技有限公司；混合型弱陰離子反相固相萃取柱CNW poly-sery PWAX（150 mg/6 mL）、CNW polysery 色素專用固相萃取柱（500 mg/6 mL）上海安譜公司；樣品材料口味姜、甜心金桔干、獼猴桃干、金梅姜等 源于抽檢殘余樣品及市場采購。

島津LC-20A 高效液相色譜儀（配DAD 檢測器）島津（中國）有限公司 ；Milli-Q 超純水儀 德國默克密理博公司；VGT 超聲波振蕩儀 廣東固特公司；M37610-33 渦旋振蕩器 賽默飛世爾公司；SHZ-W 恒溫水浴鍋 常州萬順儀器制造有限公司；TD-6 高速離心機(jī) 萬和儀器制造公司；HPD 24 位固相萃取裝置 色譜科儀器公司；MTN-2800W 氮吹濃縮儀 天津奧特賽恩斯儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 樣品取可食部分，經(jīng)充分粉碎后混合均勻，稱取5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL 具塞比色管中，加入20 mL 提取劑（甲醇:氨水=10:1，v/v），渦旋混勻后超聲10 min，重復(fù)提取兩次，上清液水浴蒸發(fā)至近干，3～5 mL 水少量多次溶解轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，加入100 μL 甲酸混勻，待凈化。依次用5 mL甲醇、5 %甲酸水溶液活化混合型弱陰離子反相固相萃取柱ProElut PWA-2，將待凈化液轉(zhuǎn)移至萃取小柱，控制流速每秒1 滴，再依次用5 mL 5 %甲酸、甲醇淋洗，棄去淋洗液，用6 mL 5 %氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，氮吹濃縮至近干，流動相（甲醇:20 mmol/L乙酸銨=2:8，v/v）溶解定容至1 mL，過PTFE 膜，待測。

1.2.2 液相色譜參考條件 島津LC-20A 高效液相色譜儀（配DAD 檢測器）；色譜柱：Inspire C18色譜分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：254 nm/428 nm/509 nm/625 nm；流速：1.0 mL/min；流動相A 為甲醇，流動相B 為20 mmol/L 乙酸銨溶液，梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液 稱取固體標(biāo)準(zhǔn)品各5.0 mg（按純度折算后的質(zhì)量），水定容至10 mL 容量瓶，配制濃度為0.5 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，新紅、靛藍(lán)液體標(biāo)準(zhǔn)品直接稀釋至0.5 mg/mL，分別準(zhǔn)確移取0.01、0.1、0.2、0.4、1.0、2.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50 mL 容量瓶中，水定容至刻度，配得濃度為0.1～20 μg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。按1.2.2 進(jìn)行分析測定，記錄線性方程及相關(guān)系數(shù)。

1.2.4 方法學(xué)考察 選擇空白基質(zhì)樣品，分別加入不同濃度水平的標(biāo)液，每個(gè)水平重復(fù)分析測定6 次，進(jìn)行加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)。以供試液響應(yīng)最低項(xiàng)目的3 倍信噪比及10 倍信噪比確定檢出限與定量限。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過與島津LC-20A 儀器配套的Labsolution色譜處理軟件完成數(shù)據(jù)采集分析，采用 Excel 軟件進(jìn)行圖形繪制及處理，結(jié)果統(tǒng)計(jì)為 3 次平 行測定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

提取是分析檢測的第一步，也是關(guān)鍵步驟，如果提取溶劑選擇不當(dāng)，會直接影響目標(biāo)物回收率。有文獻(xiàn)提出采用水溶液超聲提取[23]、亞鐵氰化鉀-乙酸鋅-水溶液沉淀提取[24]、丙酮/水溶液提取[21]、乙醇/氨水/水溶液提取[25]、乙腈/氨水溶液提取[26]、甲醇/氨水溶液提取[27]等方法提取著色劑。本研究就以上各種提取溶劑進(jìn)行了比較，以檸檬黃、胭脂紅、日落黃、酸性橙2 四種極性有差異的合成著色劑為監(jiān)測指標(biāo)，以蜜餞加標(biāo)樣品作為分析對象，研究其提取效果及回收率，回收率為統(tǒng)計(jì)3 次平行試驗(yàn)結(jié)果值，如表2。

表2 不同提取溶劑的提取效果及回收率比較Table 2 Comparison of extraction effect and recovery rate with different extraction methods

以上結(jié)果表明，采用乙醇/氨水/水、甲醇/氨水兩種提取溶劑時(shí)回收率較高、便于操作。通過分析合成著色劑分子結(jié)構(gòu)式，發(fā)現(xiàn)除靛藍(lán)外，赤蘚紅為苯甲酸鈉結(jié)構(gòu)，其他合成著色劑均為苯磺酸鈉結(jié)構(gòu)，而含此類酸性基團(tuán)的色素更容易被堿性提取溶劑提取。采用乙腈/氨水提取，雖然回收率高，但因某些蜜餞樣品可能會添加氯化鈉、山梨酸鉀、苯甲酸鈉、焦亞硫酸鈉及糖類，產(chǎn)生鹽析和糖析現(xiàn)象，應(yīng)用范圍存在局限。為進(jìn)一步探索比較乙醇/氨水/水、甲醇/氨水兩種提取方式，選取口味姜絲、芒果干及甜心金桔三種樣品類型分別進(jìn)行比較研究。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在檢測分析甜心金桔干樣品時(shí)，采用乙醇/氨水/水、甲醇/氨水兩種提取溶劑，日落黃、酸性橙2 回收率差異不大，但乙醇/氨水/水提取，檸檬黃、胭脂紅回收率很低，平行性很差，高低相差近10 倍，測試結(jié)果見表3。所以本研究提取液采用甲醇/氨水作為優(yōu)化選擇的樣品提取液。

表3 不同提取劑對不同樣品的色素回收率比較（%）Table 3 Comparison of colorant recovery rate of different extractants for different samples (%)

通過對不同比例甲醇/氨水進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)氨水比例越高，提取效果越好，結(jié)果見圖1。但甲醇/氨水比例到達(dá)20:1 后，增加氨水比例，回收率影響并不明顯，考慮到某些樣品本身可能含有天然酸性物質(zhì)，會中和少量堿，所以提取溶劑宜增大氨水使用比例。當(dāng)甲醇/氨水比例為5:1 時(shí)，增加后續(xù)蒸發(fā)濃縮時(shí)長。故最終本文選擇的甲醇/氨水比例為10:1。

2.2 固相萃取柱選擇

現(xiàn)有國標(biāo)多采用聚酰胺吸附法凈化合成著色劑，該法成本低，但過程繁瑣耗時(shí)，不利于實(shí)現(xiàn)批量檢驗(yàn)。固相萃取技術(shù)是目前常用的凈化手段，能有效提取目標(biāo)物，在檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。也有文獻(xiàn)對固相萃取柱在合成著色劑方便的應(yīng)用進(jìn)行了探索，如劉秀娟等[28]采用HLB 柱凈化餅干中合成著色劑；任榮軍等[29]采用Cleanert-PWAX 柱凈化中成藥中合成著色劑；劉珈伶等[19]采用Oasis WAX 柱凈化冰淇淋中合成著色劑。由于合成著色劑多為苯磺酸、苯甲酸類有機(jī)酸，若采用C18、HLB 硅膠基質(zhì)SPE 柱，保留較弱，難以吸附，或在淋洗階段被洗脫。結(jié)合色素結(jié)構(gòu)特性，選擇陰離子交換模式較為適宜，市面上陰離子交換柱類型較多，本試驗(yàn)選擇國產(chǎn)3 個(gè)品牌7 種固相萃取小柱進(jìn)行比較研究，分別為聚酰胺柱：Cleanert PA（1 g/6 mL），混合型強(qiáng)陰離子反相固相萃取柱：ProElut PXA（150 mg/6 mL），混合型弱陰離子反相固相萃取柱：ProElut PWA（150 mg/6 mL）、ProElut PWA-2（150 mg/6 mL）、Cleanert PWAX 柱（150 mg/6 mL）、CNW poly-sery PWAX（150 mg/6 mL），CNW poly-sery 色素專用柱（500 mg/6 mL）。本實(shí)驗(yàn)通過對同一加標(biāo)樣品加入甲醇/氨水進(jìn)行提取，蒸發(fā)濃縮后加入甲酸，以保證待凈化液偏酸性，再采用相同的淋洗和洗脫條件進(jìn)行SPE 凈化處理（見1.2.1），以測試7 種固相萃取柱對不同色素的回收率，統(tǒng)計(jì)3 次平行測試結(jié)果如下表4。試驗(yàn)表明聚酰胺柱Cleanert PA 對麗春紅S、胭脂紅、酸性紅等保留性強(qiáng)難以洗脫；混合型強(qiáng)陰離子反相柱ProElut PXA 對所有色素有極強(qiáng)吸附保留作用；混合型弱陰離子反相柱ProElut PWA 比ProElut PWA-2 保留性更強(qiáng)，部分色素回收率偏低；CNW poly-sery 色素專用柱對亮藍(lán)、專利藍(lán)Ⅴ、亮藍(lán)G 保留性較弱，在甲醇淋洗階段被部分洗脫，回收率偏低。洗脫液氨水比例從5%提升到20%，聚酰胺柱和混合型強(qiáng)陰離子反相柱對部分色素仍有強(qiáng)保留，因此不適宜色素分析。不同的弱陰離子反相柱可能最優(yōu)淋洗和洗脫條件有所差異，在本試驗(yàn)條件下，ProElut PWA-2、cleanert PWAX、CNW polysery PWAX 性能相當(dāng)，各色素均有較好的回收。本實(shí)驗(yàn)建立的方法選擇ProElut PWA-2 作為凈化SPE 柱。

表4 不同固相萃取柱回收率比較（%）Table 4 Comparison of recovery rate with different solid phase extraction columns (%)

2.3 針式過濾器及色譜分析柱的選擇

針式過濾器是實(shí)驗(yàn)室最為常見的、使用頻率很高的耗材，多用于上機(jī)前最后一步凈化處理。然而某些材質(zhì)的針式過濾器對目標(biāo)物可能存在吸附作用，直接影響最終回收率。目前市面上主要濾膜材質(zhì)分為6 種，具體分類及性能如下表5 所示。為研究6 種濾膜（均選用0.45 um）對合成著色劑是否吸附作用，選用濃度為2.0 μg/mL 的混合標(biāo)樣進(jìn)行測試。結(jié)果表明，尼龍膜對合成著色劑吸附作用最為明顯，其他膜對赤蘚紅存在一定吸附，PTFE 膜對合成色素基本無吸附作用。

表5 不同濾膜材質(zhì)類型及使用性能Table 5 Different material types of filter membrane and its application performance

色譜分析柱如選擇不當(dāng)，容易導(dǎo)致檸檬黃與新紅分離度較差，通過優(yōu)化條件也難以改善。本研究選用Inspire C18色譜分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）作為色譜分析柱，以甲醇-20 mmol/L 乙酸銨為流動相體系，通過優(yōu)化條件，按表1 條件梯度洗脫，20 種合成色素30 min 可以完成很好分離，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Standard solution chromatography

2.4 檢測波長的選擇

目前國家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)方法檢測波長多選用254 nm，但實(shí)際檢測中發(fā)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)樣品中大部分干擾物在254 nm 均有吸收，容易干擾積分判斷。此外亮藍(lán)、靛藍(lán)、專利藍(lán)Ⅴ在紫外區(qū)靈敏度很低，往往定量不準(zhǔn)，難以滿足實(shí)際檢測需要。本實(shí)驗(yàn)采用可見波長進(jìn)行定量分析，二極管陣列檢測器（DAD）對20 種色素在200～800 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，各種合成著色劑最大吸收波長見表6，綜合考慮檢測器通道的限制，最終選擇428、509、625 nm 為定量波長。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性范圍、檢出限、定量限 將1.2.3 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合。結(jié)果可知，20 種合成色素在0.1～20 μg/mL 內(nèi)均呈良好的線性，相關(guān)系數(shù)符合GB/T 27404-2008 中附錄F.2 要求，不同種類合成著色劑的最大吸收波長、定量波長、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表6。在本試驗(yàn)條件下對供試液進(jìn)行稀釋，以單位濃度峰面積響應(yīng)最低的靛藍(lán)3 倍信噪比確定檢出限，10 倍信噪比確定定量限，結(jié)果如下表6。本方法檢出限均可以達(dá)到GB5009.35-2016 檢出限（0.5 mg/kg）要求。

表6 20 種合成著色劑最大吸收波長、定量波長、線性方程、檢出限及定量限Table 6 Maximum absorption wavelength,quantitative wavelength,linear equation,detection limit and quantitative limit of 20 synthetic colorants

2.5.2 加標(biāo)回收率、精密度 選擇一未添加色素的口味姜作為空白基質(zhì)，按三個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)，分別為1.0、5.0 和50 mg/kg，每個(gè)水平重復(fù)分析測定6 次，計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果如表7。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，20 種合成色素在1.0 mg/kg 添加水平回收率為84.0%～101.7%，RSD 為1.6%～4.4%；5.0 mg/kg 添加水平回收率為90.1%～104.3%，RSD為1.3%～4.9%；50 mg/kg 添加水平回收率為90.2%～104.5%，RSD 為1.4%～5.3%?；厥章始熬芏确螱B/T 27404-2008 中附錄F.1、F.3 要求。

表7 20 種合成著色劑不同添加水平的回收率和精密度（n=6）Table 7 Recovery and precision of 20 synthetic colorants with different additive levels (n=6)

續(xù)表7

2.5.3 實(shí)際樣品分析 目前適用于檢測蜜餞中合成著色劑的標(biāo)準(zhǔn)為GB5009.35-2016。為驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)方法，并進(jìn)一步與標(biāo)準(zhǔn)檢測方法進(jìn)行比較分析，選擇添加有合成著色劑的甜心金桔干、獼猴桃干和金梅姜作為分析對象，按步驟1.2 進(jìn)行檢測分析，結(jié)果如表8。試驗(yàn)結(jié)果表明，甜心金桔干檢出胭脂紅和日落黃，胭脂紅超出GB2760-2014 限量標(biāo)準(zhǔn)0.05 g/kg；獼猴桃干檢出檸檬黃和亮藍(lán)；金梅姜檢出胭脂紅，超出GB2760-2014 限量標(biāo)準(zhǔn)0.05 g/kg。由表8 可見，采用本方法檢測分析陽性樣品，定量結(jié)果均高于國標(biāo)方法，回收率更高，操作更加便捷，具有更好的優(yōu)勢。

表8 蜜餞中合成著色劑的檢測方法比較（mg/kg）Table 8 Comparison of detection methods of synthetic colorants in candied fruit (mg/kg)

3 結(jié)論

本研究采用二極管陣列反相高效液相色譜對蜜餞中20 種合成著色劑進(jìn)行分析檢測。對不同提取試劑的提取效率進(jìn)行比較優(yōu)化，選擇甲醇/氨水溶液作為樣品提取液；對7 種不同的SPE 柱進(jìn)行比較分析，選擇混合型弱陰離子反相固相萃取柱進(jìn)行樣品凈化；對不同過濾膜進(jìn)行比較優(yōu)選；對檢測波長及儀器條件進(jìn)行優(yōu)化。從線性方程、檢出限、定量限、回收率、精密度等方面進(jìn)行方法學(xué)考察，并對不同品類的實(shí)際樣品進(jìn)行測試分析。結(jié)果表明，該方法操作便捷、穩(wěn)定性好、回收率高，可以有效解決目前在蜜餞檢測過程中遇到的困難，并可以參考應(yīng)用于其他食品類別，為色素類檢測標(biāo)準(zhǔn)的制訂及修訂提供參考依據(jù)。