張曉云，梅曉宏,

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）報(bào)道，2017 年中國(guó)的板栗產(chǎn)量占世界的83%以上，是世界上最大的板栗生產(chǎn)國(guó)[1]。板栗加工過程中產(chǎn)生大量的廢棄物，包括內(nèi)殼和外殼，約占整個(gè)板栗重量的15%～20%[2-3]。這些板栗殼廢棄物通常用作燃料燃燒或者自然腐爛，不僅浪費(fèi)資源還污染環(huán)境[4]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)[5]，板栗殼中富含酚類、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、黃酮等物質(zhì)，而酚類物質(zhì)具有一定的抗氧化、抗肥胖、抗癌、抗糖尿病、抗動(dòng)脈粥樣硬化等特性，對(duì)人體健康有益[6]。因此板栗殼多酚具有較高的開發(fā)利用價(jià)值，在創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，能減少環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。然而，使用傳統(tǒng)有機(jī)溶劑（如乙醇）或水提取板栗殼多酚，存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率低、能耗高等缺點(diǎn)[7]。

低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DESs）通常由氫鍵受體（Hydrogen bond acceptor，HBA）和氫鍵供體（Hydrogen bond donor，HBD）組成，具有低熔點(diǎn)、高熱穩(wěn)定性、低毒性或無(wú)毒性、高生物降解性和低制備成本等特性。氯化膽堿（Choline chloride，ChCl）是最常用的HBAs 之一，天然初級(jí)代謝物（如糖、有機(jī)酸和胺類）是HBDs 的豐富來源[8]。目前，DESs 作為一種綠色、高效的有機(jī)溶劑替代品已被廣泛應(yīng)用于各種天然產(chǎn)物的提取，包括酚類、黃酮類、蛋白質(zhì)、多糖、蒽醌類、萜類、生物堿等[9-14]。超聲波輔助提取（Ultrasonic-assisted extraction，UAE）作為一種新型的有效萃取技術(shù)，不僅可以降低溶劑和能量的消耗，而且還可以縮短提取時(shí)間[15]，因此，UAE 的DESs 提取已成為植物組織中高效提取功能性成分的重要手段[6,8,16-17]。

基于以上現(xiàn)狀，本研究利用DESs-UAE 提取板栗殼中的多酚，篩選出最佳的DESs 溶劑，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳工藝條件，以實(shí)現(xiàn)板栗殼中酚類物質(zhì)的高效快速提取，并對(duì)粗提物中酚類物質(zhì)進(jìn)行鑒定，旨在獲得一種綠色、高效提取板栗殼廢棄物中多酚的方法，以實(shí)現(xiàn)板栗殼廢棄物的資源化利用。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

板栗殼 購(gòu)買于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；氯化膽堿（＞98.0%）、乙二醇（＞98.0%）、1,2-丙二醇（＞99.0%）、1,3-丁二醇（＞98.0%）、甘油（＞99.0%）、草酸（＞99.8%）、D-山梨醇（＞98.0%）、葡萄糖 Macklin 生化有限公司；Folin-Ciocalteu 試劑、沒食子酸標(biāo)品、三種大孔樹脂（D-101，AB-8 和NKA-9）、尿素（＞99.5%）中國(guó)北京Solarbio 科技有限公司；HPLC 級(jí)甲酸Sigma-Aldrich 公司；MS 級(jí)乙腈 Fisher Scientific公司。

FW100 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；SCIENTZ-IID 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Centrisart D-16C 型高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；TU-1901 型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FTIR 光譜儀 美國(guó)Perkin-Elmer 公司；TripleTOF 5600+質(zhì)譜儀 美國(guó)AB SCIEX 公司；Nexera UHPLC LC-30A UHPLC 色譜儀 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 板栗殼前處理 取板栗殼于50 ℃干燥，磨碎，過60 目篩，儲(chǔ)存在玻璃瓶?jī)?nèi)，放置于干燥器中，使用前干燥至恒重。

1.2.2 DESs 的制備 HBD 和HBA 按一定摩爾比混合，水浴80 ℃下攪拌1.5 h，直至形成均勻透明的液體，儲(chǔ)存在室溫下過夜[17]，使用前真空干燥24 h。本實(shí)驗(yàn)合成8 種DESs，DESs 的編號(hào)、HBA、HBDs以及HBA 與HBD 的摩爾比如表1 所示。

表1 不同類型的DESsTable 1 Different systems of the prepared DESs

1.2.3 板栗殼多酚提取及提取溶劑選擇 稱取0.5 g板栗殼粉末，加入15 mL DESs（含水量20%，v/v）或水或40%乙醇于50 mL 離心管中，混勻，在室溫下超聲處理10 min，超聲功率200 W，超聲過程中實(shí)時(shí)檢測(cè)超聲溫度，控制其不超過55 ℃。之后10000×g離心10 min，取上清液，過0.22 μm 濾膜，備用。

1.2.4 總酚得率的計(jì)算 基于預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，DESs 不會(huì)干擾福林酚顯色反應(yīng)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用福林酚法測(cè)定1.2.3 所得提取液中總酚含量[18]，按公式（1）計(jì)算總酚得率。取10 μL 提取液，加入一定量超純水進(jìn)行稀釋，然后依次加入1 mL 福林酚試劑（1/10，v/v超純水稀釋）和1 mL Na2CO3溶液（10%，w/v，超純水溶解），定容至4 mL。在50℃下避光反應(yīng)5 min，于765 nm 處測(cè)吸光度。以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=12.605x-0.1111（R2=0.9992）?？偡拥寐剩╩g/g）用沒食子酸當(dāng)量表示，按照如下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Y 表示總酚得率，mg/g；C 表示所測(cè)吸光度值對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度，mg/mL；V0表示顯色反應(yīng)液體體積，4 mL；V1表示提取樣品總體積，mL；V2表示用于顯色的提取液體積，mL；m 表示板栗殼質(zhì)量，0.5 g。

1.2.5 DES-1 的傅里葉紅外變換光譜（FTIR）分析將氯化膽堿、草酸和DES-1 進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描，掃描前將樣品置于烘箱中，55 ℃下干燥12 h，充分烘干以除去水分。掃描分辨率為4 cm-1，掃描波數(shù)范圍4000～400 cm-1，掃描32 次，并使用OMNIC 8.2 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.6 多酚提取工藝優(yōu)化

1.2.6.1 單因素實(shí)驗(yàn) 采用1.2.3 方法提取多酚，以DES-1 為提取溶劑，固定液固比30:1 mL/g、超聲波功率200 W、超聲波時(shí)間10 min，考察水分含量（0、20%、30%、40%、50%）對(duì)總酚得率的影響；固定超聲波功率200 W、水分含量20%、超聲波時(shí)間10 min，考察液固比（20:1、30:1、40:1、50:1、60:1 mL/g）對(duì)總酚得率的影響；固定水分含量20%、液固比30:1 mL/g、超聲波時(shí)間10 min，考察超聲波功率（250、300、350、400、450 W）對(duì)總酚得率的影響；固定水分含量20%、超聲波功率200 W、液固比30:1 mL/g、超聲提取時(shí)間（2、5、10、15、20 min）對(duì)總酚得率的影響。

1.2.6.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化工藝 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)。依據(jù)Design-Expert 8.0 軟件中Box-Behnken 的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理見表2，以總酚得率為響應(yīng)值，確定最佳提取條件。

表2 優(yōu)化方案的因素水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and levels in the optimal scheme

1.2.7 大孔吸附樹脂純化多酚

1.2.7.1 樹脂活化 大孔吸附樹脂活化參考Wang等[8]方法稍并做修改。分別稱取D-101（非極性）、AB-8（弱極性）和NKA-9（極性）大孔吸附樹脂15 g，用超純水沖洗，除去白色漂浮物，濾紙吸走樹脂水分，再用無(wú)水乙醇浸泡24 h，超純水沖洗至沖洗液無(wú)白色渾濁；4% HCl 浸泡5 h，超純水沖洗至中性；4%NaOH 浸泡5 h，超純水清洗至中性，濾紙吸去樹脂表面水分。

1.2.7.2 吸附與洗脫 將活化后的大孔吸附樹脂以95%乙醇濕法上柱，浸泡24 h。然后用超純水洗凈乙醇，浸泡4 h 后備用。將2 mL 多酚提取液過層析柱，未吸附的部分使用200 mL 超純水沖洗，而后用95%（v/v）乙醇洗脫至無(wú)色，將洗脫液收集。將洗脫液進(jìn)行45 ℃恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。用超純水定容至10 mL，測(cè)定總酚含量，計(jì)算回收率。

式中：m1表示洗脫液中總酚量，mg；m2表示2 mL 上樣中總酚量，mg。

1.2.8 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 分析 基于響應(yīng)面優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，提取多酚并用AB-8 大孔吸附樹脂進(jìn)行回收，過0.22 μm 濾膜，進(jìn)一步通過UHPLCQ-TOF-MS/MS 進(jìn)行定性分析。色譜條件如下：島津InerSustain C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，2 μm），柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，流動(dòng)相A、B 分別為0.1%甲酸水溶液與乙腈；梯度洗脫（0～2 min，5% A；2～4 min，5%～20% A；4～12 min，20%～25% A；12～14 min，25%～46% A；14～26 min，46%～100% A；26～28 min，100% A；28～29 min，100%～5% A；29～30 min，5% A）。通過Q-TOF-MS/MS 定性分析洗脫液中酚類物質(zhì)的種類，質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子模式掃描，噴霧電壓為5500/-4400 V，正、負(fù)離子源溫度分別為500、450 ℃，去簇電壓為60 V/-60 V，氣簾氣25 psi，霧化氣50 psi，輔助加熱氣50 psi，離子掃描范圍為m/z 50～1000，累積時(shí)間為10 ms，碰撞能量為20～50 eV，通過IDA模式獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)。通過分析MS/MS 離子碎片，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)（MassBank、Respect、GNPS）與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，鑒定提取物中酚類物質(zhì)的種類。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS Statistics 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Design expert 8.0.6 軟件進(jìn)行回歸分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SD）表示，采用單因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA）中Duncan 多重比較分析組間差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適低共熔溶劑選擇

本實(shí)驗(yàn)以ChCl 為HBA，以有機(jī)酸、糖、胺和多元醇為HBDs，按不同的摩爾比合成了8 種不同類型的DESs。所制備的DESs 在室溫下均呈透明液體狀，考慮到DESs 的高粘度，在進(jìn)行多酚的提取時(shí)所使用的DESs 含水量為20%（v/v）。不同種類DESs對(duì)板栗殼多酚得率如圖1 所示。

圖1 不同溶劑對(duì)板栗殼多酚得率的影響Fig.1 Effect of different solvents on the extraction yield of phenolic compounds from chestnut shells

在8 種DESs 中，氯化膽堿:草酸=1:1 合成的DES-1 提取效果最好，為65.8±2.1 mg/g?？赡茉蚴且罁?jù)相似相溶原理，極性較強(qiáng)的DESs 適用于提取較強(qiáng)極性化合物，而極性較弱的DESs 適用于提取弱極性化合物[6]，與胺基、糖基以及多元醇基DESs 相比，草酸基DESs 的極性更強(qiáng)，更適宜于提取多酚這種極性較強(qiáng)的化合物；此外，羧酸基DESs 的酸性環(huán)境更有利于維持多酚的結(jié)構(gòu)不被破壞[19]，從而增大總酚得率。值得注意的是，DES-1 的總酚得率顯著高于水和40%乙醇（P＜0.05），分別是水和40%乙醇的3.2 和1.8倍，可能是由于DES-1 能與多酚之間形成更強(qiáng)的氫鍵作用[8]，從而促進(jìn)提取，這與之前的報(bào)道相一致[20-21]。這些結(jié)果表明DES-UAE 法是一種較好的從板栗殼中提取多酚的方法。因此，選擇氯化膽堿:草酸=1:1 制備的DES-1 用于后續(xù)提取工藝的優(yōu)化。

2.2 DES-1 的FTIR 表征

對(duì)氯化膽堿、草酸以及制備的DES-1 進(jìn)行了FTIR光譜表征，以證實(shí)氯化膽堿與草酸之間存在氫鍵作用，因?yàn)闅滏I是DESs 具有較高增溶能力的重要原因。氯化膽堿、草酸與DES-1 的紅外譜圖如圖2 所示。

圖2 氯化膽堿、草酸以及DES-1 的紅外譜圖Fig.2 Infrared spectra of choline chloride,oxalic acid and DES-1

由譜圖可知：對(duì)于氯化膽堿，3264 cm-1處的特征峰為O-H 伸縮振動(dòng)，1480 cm-1處的特征峰為CN 伸縮振動(dòng)[22]。對(duì)于草酸，O-H 伸縮振動(dòng)表現(xiàn)為以3017 cm-1為中心的寬譜帶，是由于草酸C=O 和OH 基團(tuán)之間形成了分子間氫鍵[23]；1732 cm-1處特征峰為C=O 伸縮振動(dòng)；1234 cm-1處的特征峰為C-O伸縮振動(dòng)。與氯化膽堿的氫鍵區(qū)域相比，DES-1 氫鍵區(qū)域的峰形發(fā)生改變，由原來的尖峰變?yōu)閷捵V帶，表明在合成DES-1 時(shí)，ChCl 和草酸之間形成氫鍵。此外，在DES-1 光譜中觀察到ChCl 和草酸的特征峰，表明ChCl 的C-N、草酸的C-N 鍵在反應(yīng)過程中保持穩(wěn)定。以上結(jié)果表明成功合成了DES，且氯化膽堿與草酸之間存在氫鍵相互作用。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 水分含量的影響 DESs 可與水互溶，水的加入會(huì)改變DESs 的理化性質(zhì)，尤其改變DESs 的黏度與極性。當(dāng)前研究表明，水的加入可能促進(jìn)或抑制DESs 的提取性能[24]。因此，探究水分含量對(duì)總酚得率的影響是必要的。由圖3 可知，在無(wú)水條件下，總酚得率最低，當(dāng)水分含量增加到30%時(shí)，總酚得率隨水分含量的增加而增大，在含水量為30%時(shí)總酚得率達(dá)到最大，主要原因可能是水分的加入會(huì)明顯降低DESs 的粘度。Huang 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在氯化膽堿:丙三醇=1:1 制成的DES 中加入5%（w/w）的水時(shí)，體系黏度可降低20%；加入20%的水時(shí)，體系黏度可降低至1/80。除此之外，研究表明，適當(dāng)降低黏度可以有效提高傳質(zhì)速率，促進(jìn)提取物的溶出，增大總酚得率[26]。然而，進(jìn)一步增加含水量至50%，總酚得率隨著水分含量的增加而減少，可能原因是加入過量的水分會(huì)減弱甚至破壞HBD 和HBA 之間的氫鍵相互作用，進(jìn)而破壞DESs 的超分子結(jié)構(gòu)，使得有效溶劑DESs 的含量降低，導(dǎo)致總酚得率降低。因此，選用水分含量20%、30%、40%進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 水分含量對(duì)得率的影響Fig.3 Effect of water content on the yield

2.3.2 液固比的影響 液固比是萃取過程中不可缺少的因素。如圖4 所示，當(dāng)液固比從20:1 mL/g 增加到40:1 mL/g 時(shí)，總酚得率隨液固比的增加而增加，可能是因?yàn)樘崛∪軇┹^少時(shí)，板栗殼原料與提取溶劑的接觸不足，導(dǎo)致提取不充分[6]。隨著液固比的增加，提取溶劑體積增加而充分浸提，從而提高總酚得率。當(dāng)液固比繼續(xù)增加時(shí)，總酚得率隨液固比的增加而降低，這可能是由于液固比過大，加入過多的溶劑會(huì)消耗超聲波一定的能量，導(dǎo)致總酚得率下降[27]。因此，選用液固比30:1、40:1、50:1 mL/g 進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 液固比對(duì)得率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the yield

2.3.3 超聲波功率的影響 如圖5 可知，當(dāng)超聲波功率從200 W 增加到350 W 時(shí)，總酚得率隨超聲功率的增加而增加，這可能因?yàn)樵龃蠊β始訌?qiáng)了超聲波的破壁效果，促進(jìn)了內(nèi)容物的釋放。當(dāng)繼續(xù)增加超聲波功率至450 W 時(shí)，總酚得率隨超聲波功率的增大呈現(xiàn)明顯降低的趨勢(shì)，可能原因是，超聲功率過大，產(chǎn)生的熱效應(yīng)會(huì)破壞部分多酚，使得總酚得率降低[28]。因此，選用超聲波功率300、350、400 W 進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

圖5 超聲波功率對(duì)得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the yield

2.3.4 超聲波時(shí)間的影響 超聲波的處理時(shí)間也是影響提取效率的重要因素。由圖6 可知，在10 min以內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚得率升高，但進(jìn)一步延長(zhǎng)處理時(shí)間時(shí)，提取效率增加的幅度較小。10 min 的提取時(shí)間足夠?qū)⒋蟛糠值亩喾訌陌謇鯕せ|(zhì)材料中提取出來，而過長(zhǎng)的時(shí)間處理又會(huì)使得時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本增加且提升的效果不顯著（P＞0.05），因此選擇超聲波處理10 min 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖6 提取時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on the yield

2.4 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.4.1 模型顯著性分析 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析的BBD（三因素三水平）設(shè)計(jì)對(duì)多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝條件，進(jìn)一步得出預(yù)測(cè)值并建立回歸模型。實(shí)驗(yàn)條件以及結(jié)果如表3所示，方差分析的結(jié)果和回歸模型如表4 所示。

表3 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken response surface experiment

表4 回歸模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface regression mode.

采用F檢驗(yàn)和P值對(duì)模型的顯著性進(jìn)行評(píng)價(jià)。較高的F值（105.63）和較低的P值（＜0.0001）表明回歸模型顯著，因此認(rèn)為該模型適合預(yù)測(cè)多酚的提取。模型失擬項(xiàng)P值為0.3602，大于0.05，不具有顯著性差異?；貧w系數(shù)（R2=0.9748）、回歸模型的調(diào)整系數(shù)（R2Adj=0.9854）和精密度（29.104）共同表明模型具有較高的精度和可靠性，表明預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間具有很高的相關(guān)性[29]。與此同時(shí)，一次項(xiàng)X2、X3以及平方項(xiàng)X21、X22和X23均影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)X1X3影響顯著（P＜0.05）。綜上結(jié)果表明，該模型能充分且準(zhǔn)確反映板栗殼總酚得率與自變量之間的真實(shí)關(guān)系。

得到描述模型的二階多項(xiàng)式方程如下：

2.4.2 交互作用分析 3D 響應(yīng)曲面圖和熱圖可以直觀反映超聲波功率、液固比和水分含量對(duì)多酚總酚得率的交互作用顯著程度[30]。如圖7 所示，在3D 圖中，曲面的坡度越大，越靠近曲面頂端顏色越深，表明兩個(gè)變量之間的交互作用越顯著。在熱圖中，等高線形狀越接近圓形則交互作用越不顯著，越接近橢圓則交互作用越顯著。因此，結(jié)合表4 可知，只有超聲波功率和水分含量的交互作用具有顯著性影響，其余均不顯著。

圖7 3D 響應(yīng)曲面圖和熱圖Fig.7 3D response surface diagram and heat diagram

2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化和模型驗(yàn)證 經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化確定了多酚的最佳提取條件為：超聲波功率348.11 W、液固比42.47:1 mL/g、水分含量32.29%，總酚得率為99.44 mg/g，為了實(shí)驗(yàn)的方便以及儀器的精確度，將最優(yōu)條件調(diào)整為：超聲波功率348 W、液固比42:1 mL/g、水分含量32%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。在此最優(yōu)條件下，實(shí)測(cè)總酚得率為99.66±2.63 mg/g，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相接近（誤差3.34%＜5%），驗(yàn)證了該模型對(duì)多酚的提取具有良好的預(yù)測(cè)能力。

2.5 大孔吸附樹脂純化

因?yàn)镈ESs 具有較高的水混溶性和極低的揮發(fā)性，所以從DESs 萃取物中回收萃取的目標(biāo)化合物回收困難[25]。大孔吸附樹脂法具有吸附速度快、吸附量大、耗能少、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，在提取物純化領(lǐng)域中應(yīng)用較廣泛。通過比較得出3 種不同極性樹脂的回收性能結(jié)果，如表5 所示，AB-8 樹脂的多酚回收率最高，達(dá)到97.92%±1.78%，因此認(rèn)為AB-8 樹脂是從DESs 提取物中回收多酚的理想樹脂。相比AB-8，D-101 和NKA-9 樹脂的回收率較低，分別為85.12%±2.07%和86.14%±3.55%。當(dāng)樹脂的極性與目標(biāo)化合物的極性接近時(shí)，就會(huì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸附能力。本實(shí)驗(yàn)AB-8 樹脂屬于弱極性樹脂，極性可能與多酚的極性最類似，有利于最大程度表現(xiàn)出對(duì)多酚的強(qiáng)吸附性能[8]。因此，采用AB-8 大孔吸附樹脂可以簡(jiǎn)便且高效地從DESs 粗提物中回收多酚。

表5 不同大孔吸附樹脂對(duì)板栗殼多酚的回收率Table 5 Recoveries of polyphenols from chestnut shells by different macroporous resins

2.6 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 分析

本實(shí)驗(yàn)通過UHPLC-Q-TOF-MS/MS 初步鑒定了13 種酚類化合物。所鑒定的酚類化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)及相關(guān)信息如圖8 和表6 所示。通過與數(shù)據(jù)庫(kù)以及相關(guān)文獻(xiàn)相對(duì)比，共鑒定出兩類酚類化合物：黃酮類（或類黃酮衍生物）和酚酸類。黃酮類化合物（或類黃酮衍生物）包括槲皮素-3-O-葡萄糖苷[31]、異鼠李素-3-O-半乳糖苷[31]、原花青素二聚體[32]、花青素[32]、花旗松素[32]、兒茶素[32]、橙皮苷[33]、異鼠李素[34]、百里香酚-β-D-葡萄糖苷、棕矢車菊素、表兒茶素沒食子酸酯和黃芩苷4 ' -甲基醚，相比之下，只鑒定出一種酚酸（對(duì)羥基苯甲酸）。其中，原花青素二聚體和兒茶素具有較大的峰面積。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了UAE 輔助DESs 萃取法是一種有效的提取酚類化合物的方法。

圖8 板栗殼多酚的總離子流圖Fig.8 Total ion current chromatograms of phenolic compounds from chestnut shells

表6 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS 酚類物質(zhì)鑒定結(jié)果Table 6 UHPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS identification results of phenolic compounds

3 結(jié)論

本文采用低共熔溶劑-超聲波輔助提取板栗殼廢棄物中的多酚，以氯化膽堿-草酸（摩爾比為1:1）合成的DES-1 為最佳提取溶劑，F(xiàn)TIR 表征氯化膽堿和草酸之間氫鍵的形成。采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，將得到的提取物進(jìn)行大孔吸附樹脂回收，同時(shí)進(jìn)行酚類物質(zhì)的鑒定。優(yōu)化的最佳提取工藝條件為：超聲波功率348 W、液固比42:1 mL/g、水分含量32%，在此最優(yōu)條件下總酚得率為99.66±2.63 mg/g，AB-8 大孔吸附樹脂多酚回收率達(dá)到97.92%±1.78%，并初步鑒定出兒茶素、原花青素二聚體等13 種酚類物質(zhì)。DESs 提取板栗殼多酚的效果明顯高于傳統(tǒng)溶劑（水和乙醇），為板栗殼多酚的綠色高效提取、創(chuàng)造更高經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供了理論依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化并進(jìn)行多酚成分鑒定，未來還需要對(duì)各種酚類物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量、分離純化以及生物活性驗(yàn)證等。