錢燕芳，石晨瑩，陳貴堂

（中國藥科大學工學院，國家中藥材加工技術(shù)研發(fā)中心，江蘇南京 211198）

桑葚（Mori fructus）是桑科（Moraceae）落葉喬木桑樹的成熟果實，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，富含氨基酸、碳水化合物、脂肪、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分[1-3]。桑葚是一種食藥同源水果，常作新鮮食用或制成果汁、果酒、果醬等產(chǎn)品，美味且營養(yǎng)豐富[4]。研究表明[5-6]，桑葚具有治療糖尿病、高血壓、肝腎損傷以及抗炎、抗菌、抗腫瘤、神經(jīng)保護、抗衰老、調(diào)節(jié)腸道菌群等功效，這使桑葚的食藥需求不斷增加。桑葚多糖是其重要的生物活性成分，具有治療肝臟損傷[7-10]、免疫調(diào)節(jié)[11-12]、降血糖[13-14]、治療心血管疾病[15]等多種生物活性。

目前，桑葚原料浪費、加工利用率不高等問題嚴重，難以發(fā)揮我國豐富的桑葚資源優(yōu)勢[16-17]，研究和優(yōu)化桑葚多糖提取工藝，對延長桑葚產(chǎn)業(yè)鏈，提高其附加值具有重要意義。超聲波輔助提取基于其“空化效應”促進可溶性成分溶出，提高提取效率[18]，已被廣泛運用于天然活性物質(zhì)的提取。與連續(xù)超聲處理相比，間歇性超聲處理具有產(chǎn)量更高的優(yōu)勢[19]。曹榮景等[20]于超聲輔助提取后測得提取液中桑葚多糖含量為17.78%，Chen 等[2]和祝新媛[21]分別使用超聲波清洗器水提醇沉制備桑葚多糖的得率為3.13%±0.07%和3.64%±0.22%，提取液中小分子糖對測定結(jié)果的影響明顯，目前未見采用超聲波輔助提取兼醇沉制備桑葚多糖得率更高的報道。水提醇沉法得到的桑葚粗多糖色澤深重，給后續(xù)的分離純化、活性鑒定帶來困難，也影響其作為功能產(chǎn)品的外觀品質(zhì)[22]。多糖脫色方法主要有活性炭法、雙氧水法和樹脂法，前兩種方法存在脫色效果差和破壞多糖結(jié)構(gòu)的問題[23]，大孔樹脂因其強大的吸附能力、良好的保留能力、易于再生和環(huán)境友好等特點[24-25]得到越來越多的使用，目前關(guān)于桑葚多糖樹脂法脫色的工藝研究罕見報道。天然來源的活性多糖具有清除自由基的作用，而其活性受到提取工藝的影響[26-27]。

本研究使用超聲波細胞粉碎機代替?zhèn)鹘y(tǒng)超聲波清洗器，采用“工作1 s/間歇1 s”循環(huán)脈沖式超聲方式提高破碎效果，旨在優(yōu)化超聲波輔助提取桑葚多糖和樹脂法脫色的工藝條件，提高桑葚多糖得率，并通過體外自由基清除實驗評估其抗氧化活性，以期為桑葚多糖產(chǎn)業(yè)化的建立和發(fā)展提供數(shù)據(jù)支持，為桑葚作為功能性食品和天然來源藥物的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚凍干粉 西安東峰生物科技有限公司；濃硫酸、鹽酸、苯酚、葡萄糖 南京化學試劑有限公司；石油醚、無水乙醇 無錫市亞盛化工有限公司；氫氧化鈉 西隴化工股份公司；XDA-8、NKA-9、AB-8、D101、D301G 樹脂 上海源葉生物科技有限公司；氯仿、正丁醇 上海凌峰化學試劑有限公司；2,2-聯(lián) 氮-二（3-乙 基-苯并噻 唑-6-磺 酸）二銨鹽（ABTS）美國Sigma 試劑公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）索萊寶科技有限公司；鄰二氮菲梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；鄰苯三酚 上海賢鼎生物科技有限公司；三（羥甲基）氨基甲烷 生工生物工程（上海）股份有限公司；L（+）-抗壞血酸、七水合硫酸亞鐵、過硫酸鉀 國藥集團化學試劑有限公司。

JY29-ⅡN 超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司；LXJ-Ⅱ型低速大容量多管離心機上海安亭科學儀器廠；HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；PD-1C-50 真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；DZF-6050 型真空干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司；ATX224 分析天平 島津有限公司；RE-5205 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑葚多糖超聲提取和脫色工藝 凍干桑葚粉→石油醚脫脂→烘干→脫脂桑葚粉→超聲提取→離心過濾→旋蒸濃縮→醇沉→真空干燥→桑葚粗多糖→重溶→脫色→脫蛋白→醇沉→透析→凍干→精制桑葚多糖。

稱取400 g 桑葚凍干粉置于2 L 石油醚中，室溫下攪拌3 h，重復2 次，烘干得到脫脂桑葚粉[28]。稱取一定質(zhì)量的脫脂桑葚粉于燒杯中，加入一定量的蒸餾水，于超聲細胞粉碎機中進行超聲提取。提取完畢后在4000 r/min 條件下離心5 min，抽濾得上清液，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1/4 體積，冷卻至室溫后加入4 倍體積工業(yè)乙醇，4 ℃醇沉過夜。4000 r/min 離心5 min 收集沉淀，用無水乙醇洗滌后放入50 ℃真空干燥箱中干燥5 h，即為桑葚粗多糖[29]。稱取桑葚粗多糖配置一定濃度的桑葚粗多糖溶液，以1:2 g/mL固液比加入樹脂，于搖床150 r/min 靜態(tài)脫色，收集脫色液[30]。Sevag 法去除蛋白，醇沉，收集沉淀，透析，冷凍真空干燥，得到精制桑葚多糖。

1.2.2 多糖得率測定 繪制葡萄糖標準曲線[31]：精確配制0.1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖母液于試管中，用蒸餾水補足1.0 mL，加入1.0 mL 苯酚溶液（5%）和5.0 mL 濃硫酸，渦旋振蕩混合，室溫下靜置反應30 min后，于490 nm 處測量吸光值。

式中：y 為490 nm 處的吸光值；x 為葡萄糖的濃度，mg/mL；決定系數(shù)R2=0.9999。

準確稱取適量桑葚粗多糖，加蒸餾水溶解，配制成0.1 mg/mL 的桑葚粗多糖溶液，按上述操作測量吸光度，計算得桑葚粗多糖中的總糖含量，公式（2）：

式中：Y 為桑葚粗多糖中的總糖含量，%；A 為樣品溶液反應后在490 nm 處的吸光值。

計算桑葚粗多糖得率，公式（3）：

式中：Y 為桑葚粗多糖中的總糖含量，%；M2為真空干燥后桑葚粗多糖的重量，g；M1為所稱取脫脂桑葚粉的重量，g。

1.2.3 超聲提取工藝優(yōu)化

1.2.3.1 超聲提取單因素實驗 分別考察不同超聲提取溫度、料液比、超聲時間、超聲功率對桑葚粗多糖得率的影響。固定料液比1:25 g/mL、超聲時間30 min、超聲功率400 W 不變，考察超聲溫度分別為30、40、50、60、70 ℃對桑葚粗多糖得率的影響；固定超聲溫度50 ℃、超聲時間30 min、超聲功率400 W 不變，考察料液比分別為1:10、1:20、1:25、1:30、1:40、1:50 g/mL 對桑葚粗多糖得率的影響；固定超聲溫度50 ℃、料液比1:25 g/mL、超聲功率400 W 不變，考察超聲時間分別為20、30、40、50、60、70、80 min 對桑葚粗多糖得率的影響；固定超聲溫度50 ℃、料液比1:25 g/mL、超聲時間60 min 不變，考察超聲功率分別為200、300、400、500、600、700 W 對桑葚粗多糖得率的影響。

1.2.3.2 超聲提取正交優(yōu)化試驗 依據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用L9（34）正交設(shè)計表進行正交優(yōu)化，見表1。

表1 超聲提取工藝正交試驗因素水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for ultrasonic extraction

1.2.4 桑葚多糖樹脂法脫色工藝優(yōu)化

1.2.4.1 不同樹脂脫色性能篩選 選取5 種不同極性的大孔吸附樹脂，分別進行預處理。采用靜態(tài)吸附法，分別稱取10 g 濕樹脂于50 mL 錐形瓶中，加入20 mL 濃度為2 mg/mL 桑葚粗多糖溶液，置于搖床，轉(zhuǎn)速為150 r/min，溫度為25 ℃，振蕩脫色12 h。脫色前后，在513 nm 處測量溶液吸光值，并計算脫色率[22]，公式（4）：

式中：A1為脫色前513 nm 處的吸光值；A2為脫色后513 nm 處吸光值。

使用硫酸苯酚法，在490 nm 處測量脫色前后桑葚粗多糖溶液反應顯色后的吸光值，并計算多糖保留率[22]，公式（5）：

式中：A1為脫色前反應液490 nm 處的吸光值；A2為脫色后反應液490 nm 處的吸光值。

1.2.4.2 脫色單因素實驗 分別考察不同脫色時間、桑葚粗多糖溶液濃度、脫色溫度對AB-8 大孔樹脂脫色效果的影響。固定桑葚粗多糖溶液濃度2 mg/mL、脫色溫度25 ℃不變，考察脫色時間分別為0、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、12、17 h 對多糖脫色率的影響；固定脫色時間4 h、脫色溫度25 ℃不變，考察桑葚粗多糖溶液濃度分別為1、2、3、4、5、6 mg/mL 對多糖脫色率的影響；固定脫色時間4 h、桑葚粗多糖溶液濃度3 mg/mL 不變，考察脫色溫度分別為20、25、30、40、50 ℃對多糖脫色率的影響。

1.2.4.3 脫色正交優(yōu)化試驗 依據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用L9（34）正交設(shè)計表進行正交優(yōu)化，見表2。

表2 脫色工藝正交試驗因素水平設(shè)計Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for decolorization process

1.2.5 抗氧化活性測定 桑葚粗多糖經(jīng)樹脂法脫色、Sevag 法脫蛋白后再次加入4 倍體積工業(yè)乙醇醇沉過夜，透析、凍干后得到桑葚多糖。分別配制不同濃度的桑葚多糖溶液和抗壞血酸（VC）溶液，其中VC作為陽性對照。

1.2.5.1 ABTS 自由基清除率 參考文獻方法[32-33]，稱取19.45 mg ABTS 和7.58 mg 過硫酸鉀，分別準確配制5 mL 溶液，按1:1 混合后于4 ℃冰箱避光反應16 h，將其稀釋至在734 nm 處吸光值為0.700±0.020。移取2 mL 樣品溶液，加入2 mL ABTS 工作液混合均勻，室溫避光反應20 min，于波長734 nm處測吸光值。ABTS 自由基清除公式為：

式中：Ai為加入樣品溶液組的吸光值；Ac為以蒸餾水代替樣品溶液的吸光值。

1.2.5.2 DPPH 自由基清除率 參考文獻[34-35]方法，移取2 mL 樣品溶液，加入0.1 mmol/L DPPH 溶液2 mL，振蕩混勻，室溫下避光反應30 min，于波長517 nm 處測定吸光值。DPPH 自由基清除公式為：

式中：Ai為加入樣品溶液組的吸光值；Aj為2 mL樣品溶液加2 mL 乙醇的吸光值；Ac為2 mL DPPH溶液加2 mL 乙醇的吸光值。

1.2.5.3 羥基自由基清除率 參考文獻[36-37]方法，移取1 mL 樣品溶液，加入0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.4）1 mL、0.75 mmol/L 硫酸亞鐵溶液1 mL和0.75 mmol/L 鄰二氮菲溶液1 mL 后混合均勻，加入1 mL 體積分數(shù)為0.03%的H2O2溶液，振蕩混勻，37 ℃水浴60 min，于波長536 nm 處測定吸光值。羥基自由基清除公式為：

式中：Ai為加入樣品溶液組的吸光值；Aj為以蒸餾水代替樣品溶液的吸光值；Ac為以蒸餾水代替樣品溶液和H2O2溶液的吸光值。

1.2.5.4 超氧陰離子自由基清除率 參考文獻[38-39]方法，移取1 mL 樣品溶液，加入25 ℃預熱的50 mmol/L Tris-HCl 溶液（pH8.2）4 mL 和10 mmol/L鄰苯三酚溶液0.2 mL 混勻，反應4 min 后加入1 滴濃鹽酸終止反應，于波長325 nm 處測定吸光值。超氧陰離子自由基清除公式為：

式中：Ai為加入樣品溶液組的吸光值；Ac為以蒸餾水代替樣品溶液的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復三次，結(jié)果用平均值±標準差表示，采用Origin 2021 進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 22進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲提取單因素實驗結(jié)果

2.1.1 超聲溫度選擇 超聲提取溫度對桑葚粗多糖得率影響的實驗結(jié)果如圖1 所示。隨著超聲提取溫度的升高，桑葚粗多糖的得率逐漸上升，當超聲提取溫度為50 ℃時，得率達到最大值2.31%±0.06%；而后隨溫度繼續(xù)升高，桑葚粗多糖得率開始下降。提取溫度升高可增加多糖在溶劑中的溶解度和擴散系數(shù)，提高多糖得率[40]，但溫度過高時，可能破壞多糖結(jié)構(gòu)，易引起多糖分解，不利于多糖提取。陳成等[41]和王杉杉等[42]采用超聲輔助提取五味子多糖和枸杞多糖時也有類似結(jié)論。因此，選擇超聲溫度50 ℃進行后續(xù)實驗。

圖1 超聲溫度對多糖得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic extraction temperature on the yield of polysaccharides from Mori fructus

2.1.2 料液比選擇 料液比對桑葚粗多糖得率影響的實驗結(jié)果見圖2。隨著料液比的增大，桑葚多糖的得率呈上升趨勢，當料液比達到1:25 g/mL 時，有最高得率為2.33%±0.05%，而后得率隨料液比的增大而下降。桑葚多糖為水溶性物質(zhì)，隨溶劑增加，固液相中的濃度差增大，多糖溶出速率增大，但當料液比過大時，超聲處理的空化效應和機械振動效果受到影響，從而導致多糖得率下降[43]。帥良等[44]和冉俊楓等[45]在提取百香果果皮多糖和苦筍殼多糖時也有類似現(xiàn)象。因此，選擇料液比1:25 g/mL 進行后續(xù)實驗。

圖2 料液比對多糖得率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the yield of polysaccharides from Mori fructus

2.1.3 超聲時間選擇 超聲提取時間對桑葚粗多糖得率影響的實驗結(jié)果見圖3。隨著超聲時間的延長，桑葚多糖的得率逐漸升高，當超聲時間為60 min 時，得率最高為3.16%±0.17%，而后隨超聲時間延長得率開始下降。該這可能是因為在提取初期，超聲波的“空化效應”促進多糖擴散至溶劑中，且呈時間依賴，使得多糖在溶劑中充分溶解，然而當超聲時間過長時，長時間的超聲波機械振動可能使提取液中溶解的多糖發(fā)生分解[43]，從而導致得率降低。該現(xiàn)象與沈曉靜等[46]和丁梁斌等[47]在提取云南小粒咖啡花多糖和雞血藤多糖時的發(fā)現(xiàn)相似。因此，選擇超聲時間60 min 進行后續(xù)實驗。

圖3 超聲時間對多糖得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic time on the yield of polysaccharides from Mori fructus

2.1.4 超聲功率選擇 超聲功率對桑葚粗多糖得率影響的實驗結(jié)果如圖4 所示。隨著超聲功率的增大，桑葚粗多糖的得率先升高后下降，在超聲功率為500 W 時，得率達到最大，為3.57%±0.09%，隨著超聲功率的繼續(xù)增強，桑葚粗多糖得率開始下降。超聲功率的增大對于超聲波的“空化效應”具有正向作用，能有效破壞細胞壁，促進多糖溶出，但當超聲功率過大時，超聲波帶來的過強的機械振動可能破壞多糖結(jié)構(gòu)，使得提取出來的多糖產(chǎn)生降解，導致得率下降[48]。該現(xiàn)象與孫寧云等[31]和衛(wèi)娜等[49]在提取雞蛋花多糖和板栗殼多糖時的結(jié)論類似。因此，選擇超聲功率500 W 進行后續(xù)實驗。

圖4 超聲功率對多糖得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on the yield of polysaccharides from Mori fructus

2.2 超聲提取正交優(yōu)化試驗結(jié)果

超聲輔助提取桑葚粗多糖的正交試驗設(shè)計及結(jié)果如表3 所示。通過極差大小確定各因素對桑葚粗多糖得率影響的主次順序為：A（超聲溫度）＞B（料液比）＞D（超聲功率）＞C（超聲時間）。最佳提取工藝條件為A2B3C3D2，即：超聲溫度50 ℃、料液比1:30 g/mL、超聲時間70 min、超聲功率500 W。經(jīng)3 次驗證實驗，在該條件下，桑葚粗多糖的得率可達4.59%±0.25%，相較Chen 等[2]所報道的超聲輔助提取桑葚粗多糖得率3.13%±0.07%有明顯提升。

表3 超聲提取正交試驗結(jié)果Table 3 Results of ultrasonic extraction orthogonal experiment

2.3 不同樹脂脫色性能篩選

不同種類樹脂對桑葚粗多糖溶液靜態(tài)脫色的脫色率和多糖保留率如表4 所示。不同種類大孔樹脂對桑葚多糖的脫色效果不一，AB-8 大孔樹脂的脫色率最高；D301G 的多糖保留率最高，但其脫色率較低，排在其后的AB-8 和D101 的多糖保留率無顯著性差異（P＞0.05）。樹脂的吸附特性與其孔徑、表面積和極性等物理化學性質(zhì)密切相關(guān)[24]，不同大孔樹脂間的吸附差異可能是由于被吸附物質(zhì)、樹脂表面的活性位點和液相之間的分子間作用力不同所致[50]。合適的脫色樹脂不僅要有很強的色素親和性，而且對多糖的吸附能力應當很弱。結(jié)果顯示樹脂極性對桑葚粗多糖脫色率有較大影響，提示桑葚粗多糖中色素可能以弱極性色素為主[21,50]。綜合考慮各樹脂的脫色和多糖保留效果，選擇AB-8 大孔樹脂進行后續(xù)實驗。

表4 不同樹脂對桑葚多糖脫色效果的影響Table 4 Effects of different resins on decolorization of polysaccharides from Mori fructus

2.4 脫色工藝單因素實驗結(jié)果

2.4.1 脫色時間選擇 脫色時間對桑葚粗多糖脫色率影響的實驗結(jié)果如圖5 所示。在0～3 h 內(nèi)，隨脫色時間的延長，脫色率逐漸上升；在3～5 h 內(nèi)，脫色率基本恒定不變（P＞0.05）；脫色時間到達12 h 時，脫色率最高為54%±1.57%，但12 和5 h 時的脫色率無顯著性差異（P＞0.05）。該結(jié)果與劉偉等[23]利用NKA-9 脫色草莓多糖時的結(jié)果一致，隨著脫色時間的延長，多糖脫色率逐漸上升而后達到動態(tài)平衡。但在脫色過程中，大孔吸附樹脂對多糖也有相同的吸附趨勢[50]，為減少多糖損失，脫色時間較短為宜。綜合考慮脫色率和脫色時間長短，選擇脫色時間4 h 進行后續(xù)實驗。

圖5 脫色時間對脫色率的影響Fig.5 Effects of decolorization time on decolorization rate

2.4.2 多糖溶液濃度選擇 桑葚粗多糖濃度對脫色率影響的實驗結(jié)果如圖6 所示。隨著桑葚粗多糖溶液濃度的增大，脫色率先上升后降低，在多糖溶液濃度為3 mg/mL 時脫色率達到最大為56.04%±0.82%。固定大孔樹脂用量，樹脂中官能團所能吸附的色素總量不變，當多糖溶液濃度過低時，被吸附的色素總量減少，脫色前后溶液吸光度差別變小，脫色率較低；當多糖溶液濃度過高時，樹脂可吸附的色素總量達到飽和，溶液中殘存色素增加，脫色率降低。該現(xiàn)象與韓偉等[51]應用大孔樹脂脫色蛹蟲草多糖時一致。因此，選擇桑葚粗多糖溶液濃度為3 mg/mL 進行后續(xù)實驗。

圖6 桑葚粗多糖溶液濃度對脫色率的影響Fig.6 Effects of polysaccharide solution concentration on decolorization rate

2.4.3 脫色溫度選擇 脫色溫度對桑葚粗多糖脫色率影響的實驗結(jié)果如圖7 所示。在20～30 ℃，脫色率隨脫色溫度的升高而增大，在30～50 ℃，脫色率隨脫色溫度的變化無顯著性差異（P＞0.05），脫色溫度為50 ℃時，脫色率最大為54.71%±0.80%。在樹脂的吸附過程中同時存在吸附和解吸兩種反作用，一方面，溫度的升高有利于溶質(zhì)分子到達并吸附在樹脂的表面和內(nèi)部；另一方面，分子熱運動的增加也會引起吸附的物質(zhì)從樹脂上解離。因此，樹脂的吸附能力是在一定溫度下吸附和解吸相互作用的結(jié)果[24]。該結(jié)果與Shi 等[52]脫色香椿芽多糖時的現(xiàn)象一致。同時考慮到溫度升高對多糖分解的促進作用，選擇30 ℃進行后續(xù)實驗。

圖7 脫色溫度對脫色率的影響Fig.7 Effects of decolorization temperature on decolorization rate

2.5 脫色正交優(yōu)化試驗結(jié)果

采用AB-8 大孔樹脂靜態(tài)法脫色桑葚粗多糖的正交試驗設(shè)計及結(jié)果如表5 所示。通過極差大小確定各因素對桑葚粗多糖脫色率影響的主次順序為：C（脫色溫度）＞A（脫色時間）＞B（桑葚多糖溶液濃度）。最佳工藝條件為A3B3C1，即：脫色時間5 h、桑葚粗多糖溶液濃度4 mg/mL、脫色溫度25 ℃。在此條件下重復三次驗證實驗，桑葚粗多糖的脫色率為62.34%±1.27%。在最佳脫色工藝條件下進行放大實驗，使用200 g AB-8 大孔樹脂對400 mL 桑葚粗多糖溶液進行脫色處理，經(jīng)3 次驗證實驗，脫色率可達74.06%±2.62%。工藝放大后的脫色率比20 mL 小試的脫色率有明顯提升，這可能是由于脫色體系體積與深度增大的影響，溶質(zhì)更易擴散進入樹脂孔隙，使得脫色更為徹底。

表5 脫色正交試驗結(jié)果Table 5 Results of decolorization orthogonal experiment

2.6 抗氧化活性測定結(jié)果

2.6.1 ABTS+自由基清除率 ABTS 與過硫酸鉀反應可生成藍綠色的穩(wěn)定自由基，在734 nm 處有最大吸收波長，當有抗氧化劑存在時，ABTS+自由基與之反應則變成無色。此法快速簡便，被廣泛應用于評價抗氧化劑清除自由基的能力。如圖8 所示，在測定范圍內(nèi)，桑葚多糖對ABTS+自由基的清除率隨濃度增加先升高而后趨于平緩，在0.6 mg/mL 時清除率達到99.03%±0.17%，與同濃度下VC對ABTS+自由基的清除率無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果顯示桑葚多糖對ABTS+自由基具有良好的清除能力，IC50值為0.14 mg/mL。

圖8 桑葚多糖清除ABTS+自由基能力Fig.8 Scavenging effect of MFPs on ABTS+ radical

2.6.2 DPPH 自由基清除率 DPPH 是一種穩(wěn)定的氮中心自由基，當有自由基清除劑存在時，DPPH 的單電子被捕捉而顏色變淺，此法操作簡便，重復性好，被廣泛用于天然產(chǎn)物的體外抗氧化能力測定。如圖9 所示，在測定濃度范圍內(nèi)，桑葚多糖對DPPH 自由基的清除率隨濃度提高而上升，當桑葚多糖溶液濃度為1 mg/mL 時，清除率最大為80.08%±0.84%，但小于同等濃度下VC對DPPH 自由基的清除率91.18%±0.93%。該實驗結(jié)果表明桑葚多糖對DPPH 自由基具有良好的清除效果，IC50為0.68 mg/mL。

圖9 桑葚多糖清除DPPH 自由基能力Fig.9 Scavenging effect of MFPs on DPPH radical

2.6.3 羥基自由基清除率 鄰二氮菲可與Fe2+形成有色絡(luò)合物，而H2O2與Fe2+通過Fenton 反應產(chǎn)生的羥基自由基可將鄰二氮菲-Fe2+氧化為鄰二氮菲-Fe3+，若體系中存在羥基自由基清除劑，則Fenton 反應產(chǎn)生的羥基自由基將被全部或部分清除，鄰二氮菲-Fe2+絡(luò)合物受到的損傷將隨之減少。如圖10 所示，在測定濃度范圍內(nèi)，桑葚多糖對羥基自由基的清除能力隨劑量增大而提高，在0.4 mg/mL 時清除率為54.72%±1.14%，小于同等濃度下VC對羥基自由基的清除率89.61%±1.28%。結(jié)果表明，桑葚多糖在體外對羥基自由基具有較強的清除能力，IC50為0.19 mg/mL。

圖10 桑葚多糖清除羥基自由基能力Fig.10 Scavenging effect of MFPs on hydroxyl radical

2.6.4 超氧陰離子自由基清除率 在弱堿性條件下，鄰苯三酚能發(fā)生自氧化反應產(chǎn)生超氧陰離子自由基和中間有色產(chǎn)物，當體系中存在超氧陰離子自由基清除劑時能迅速與其反應，從而減少有色物累積。如圖11 所示，在測定濃度范圍內(nèi)，VC對超氧陰離子具有顯著的清除作用，桑葚多糖對超氧陰離子自由基的清除率緩慢增加，當桑葚多糖濃度為1 mg/mL 時，清除率為30.34%±0.78%。與VC相比，桑葚多糖對超氧陰離子自由基的清除能力較弱，IC50值為3.14 mg/mL，但優(yōu)于甘薯渣多糖[53]清除超氧陰離子的IC50值5.832 mg/mL 和苦筍殼多糖[45]清除超氧陰離子的IC50值13.58 mg/mL。這可能是由于天然活性多糖不同的水溶性、構(gòu)象等因素[27]，導致抗氧化能力差異。

圖11 桑葚多糖清除超氧陰離子自由基能力Fig.11 Scavenging effect of MFPs on superoxide anion radical

3 結(jié)論

本實驗采用超聲波細胞粉碎機提取桑葚多糖，通過單因素和正交優(yōu)化實驗得到最佳提取工藝為：超聲溫度50 ℃、料液比1:30 g/mL、超聲時間70 min、超聲功率500 W。該條件下桑葚粗多糖得率為4.59%±0.25%。并通過單因素和正交優(yōu)化試驗，得到使用AB-8 大孔吸附樹脂靜態(tài)法脫色桑葚粗多糖的最佳條件為：脫色時間5 h、多糖溶液濃度4 mg/mL、脫色溫度25 ℃。該條件下脫色率可達62.34%±1.27%。此外，體外抗氧化實驗表明，桑葚多糖對ABTS+自由基、DPPH 自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基均具有一定的清除能力，具備良好的體外抗氧化活性。后續(xù)需進一步探究桑葚多糖的體內(nèi)生物活性和品質(zhì)、結(jié)構(gòu)鑒定方法，為桑葚多糖天然活性產(chǎn)品的進一步開發(fā)及功能研究提供參考，也為桑葚的產(chǎn)業(yè)開發(fā)與產(chǎn)業(yè)升級提供數(shù)據(jù)支撐。