代 成，譚梓銘，張 陽，李 璐，李 雁，解新安,2,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642）

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）是治療心血管疾病的重要靶點(diǎn)，控制其活性有利于維持血壓平衡[1]。心血管疾病是全球最常見的死亡原因之一，導(dǎo)致全球每年約1730 萬人死亡[2]。目前合成的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制藥物如卡托普利，作為降壓藥雖具有良好的降壓效果，但同時(shí)伴隨著過敏、心悸等的副作用。因此，人們將目光投向作用溫和、安全、特異、持久的食源性ACE 抑制肽[3]。

我國作為世界上生產(chǎn)及消費(fèi)茶葉最多的國家之一，在茶葉加工過程中產(chǎn)生了大量茶渣。目前茶渣的再利用主要是制作生物吸附劑，制作有機(jī)無機(jī)復(fù)合肥以及動物飼料等[4-5]，未能充分利用茶渣資源。茶渣營養(yǎng)成分豐富，其中茶渣蛋白占茶渣干21%～28%[6-7]，氨基酸含量占干物質(zhì)總量的1%～4%[7]。研究發(fā)現(xiàn)，茶蛋白在抗氧化、降血脂、抗腫瘤及預(yù)防輻射方面等具有積極的作用，對抗氧化功能研究比較充分，而降壓功能卻鮮有報(bào)道。

目前ACE 抑制肽的制備方法主要有發(fā)酵法、微生物酶解法、基因重組法、化學(xué)合成法[8-9]，可依據(jù)不同ACE 抑制肽制備原料選擇合適的制備方法，而植物蛋白大多采取酶解法制備ACE 抑制肽。傳統(tǒng)酶解法制備生物活性肽存在一些弊端，如酶解效率低、產(chǎn)物活性低以及酶解時(shí)間長等問題[10-11]。超聲波是一種新型的清潔、綠色提取技術(shù)，產(chǎn)生的高剪切力和機(jī)械能會引起空化，空化氣泡在材料表面的劇烈內(nèi)爆可能引起微射流，導(dǎo)致表面剝落、侵蝕和顆粒破碎[12-13]。這些效應(yīng)可能有助于增加底物的溶解度，使其更容易被酶利用，從而加快化學(xué)反應(yīng)。Habinshuti等[14]研究發(fā)現(xiàn)，超聲輔助堿性蛋白酶法可以提高甘薯蛋白酶解產(chǎn)物水解度和抗氧化活性。李瑩等[15]采用超聲波輔助菠蘿蛋白酶水解泥鰍蛋白制備ACE抑制肽，結(jié)果顯示超聲波輔助有效提高了其ACE 抑制率。

本研究旨在通過超聲波預(yù)處理酶解法制備ACE抑制肽，利用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)，并對制備的多肽進(jìn)行分子量分布和穩(wěn)定性分析，以期為茶渣高值化利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶渣 饅頭嶺茶廠提供；茶渣蛋白 實(shí)驗(yàn)室自制[16]，純度為52.5%±0.03%；氫氧化鈉、氯化鉀、胰蛋白酶（10.17×104±5.30×103U/g）、風(fēng)味蛋白酶（9.59×103±0.23×102U/g）諾維信生物技術(shù)有限公司；復(fù)合蛋白酶（12.41×104±7.25×103U/g）、堿性蛋白酶（6.53×104±1.46×103U/g）、木瓜蛋白酶（2.28×104±0.65×103U/g）、胃蛋白酶（1.2×103±0.55×102U/g）廣州光華科技有限公司；正辛醇、異辛烷 天津市大茂化學(xué)試劑廠；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）美國Sigma 公司，生化級。

PL203 電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；78-1 磁力加熱攪拌器 金壇市富華儀器有限公司；754 紫外-可見光分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；TL-650CT 多用途恒溫超聲波提取機(jī)江蘇天翎儀器有限公司；PHS-3C 數(shù)顯pH 計(jì) 上海精科；DL-5 高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；KDY-9810 凱氏定氮儀 北京市通潤源機(jī)電技術(shù)有限公司；OAPMP220 超濾裝置 美國PALL 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ACE 抑制肽的制備 茶渣蛋白ACE 抑制肽的酶解工藝流程：茶渣蛋白→超聲波預(yù)處理→酶解→滅酶活→超濾→離心取上清液。具體步驟：茶渣蛋白粉按比例（w/v）加蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH，經(jīng)超聲波預(yù)處理后，加入蛋白酶，待酶解完成后沸水浴10 min滅酶活，冷卻至室溫，在4000 r/min 離心10 min 后調(diào)節(jié)上清液至中性，經(jīng)1 μm 濾膜除雜，收集濾液經(jīng)10、5、3 kDa 濾膜分離進(jìn)行冷凍干燥，并測定ACE抑制活性。

1.2.2 蛋白酶的篩選 以茶渣蛋白為原料，選取胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶在最適條件下進(jìn)行酶解，底物質(zhì)量濃度為2.5%，加酶量6000 U/g，酶解時(shí)間3 h。酶解過程中每隔0.5 h 取一次樣，測定酶解產(chǎn)物ACE 抑制率。

1.2.3 超聲方式的確定 通過超聲波預(yù)處理（超聲處理茶渣蛋白后加酶）、不超聲和超聲前加酶（加酶處理茶渣蛋白后進(jìn)行超聲）三種處理方式對比，其反應(yīng)條件一致，以確定超聲方式。超聲條件：功率300 W，溫度50 ℃，時(shí)間20 min；酶解條件：底物濃度2%，pH8.5，溫度60 ℃，加酶量8000 U/g。以ACE 抑制率為指標(biāo)，于酶解反應(yīng)開始的第0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 h 時(shí)取樣，測定其抑制率。

1.2.4 超聲波預(yù)處理單因素實(shí)驗(yàn) 以ACE 抑制率為指標(biāo)，考察超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度對ACE 抑制活性的影響。固定考察因素：底物濃度2.5%，溫度61 ℃，加酶量8310 U/g，pH8.5，超聲功率300 W，超聲時(shí)間20 min，超聲溫度50 ℃。每個(gè)參數(shù)變化如下：超聲功率200、250、300、350、400 W；超聲時(shí)間10、20、30、40、50、60 min；超聲溫度30、35、40、45、50、55、60 ℃。

1.2.5 超聲波預(yù)處理工藝優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)確定超聲波預(yù)處理酶解的最佳條件。以ACE 抑制率為響應(yīng)值，超聲功率為因子A，超聲時(shí)間為因子B，超聲溫度為因子C。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Variables and levels used for central composite design

1.2.6 ACE 抑制活性的測定 采用紫外分光光度法，操作簡單、反應(yīng)快速[17]。簡而言之，以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶為底物，蛋白質(zhì)酶解物為陽性對照。由于試劑加入順序的不同，實(shí)驗(yàn)分為空白組b、對照組c、測定組a。測定組：5.0 mmol/L 的HHL 溶液120 μL，10 μL 0.1×103U/L ACE，在37 ℃水浴1 h，反應(yīng)結(jié)束后迅速加入150 μL 的1 mol/L HCl 以終止反應(yīng)；接著向樣品中加入1 mL 冰凍乙酸乙酯，旋渦混合后離心（4000 r/min,l5 min）；吸取上層脂溶液750 μL，置于120 ℃烘箱烘干；待冷卻后加入3 mL 去離子水，旋渦半分鐘，在228 nm 波長處測定吸光度?？瞻捉M在加入鹽酸后再加入抑制劑，對照組c 最先添加ACE 之后立刻加入HCl。

計(jì)算公式如下：

式中：Aa樣品a 的吸光值；Ab樣品b 的吸光值；Ac樣品c 的吸光值。

1.2.7 茶渣ACE 抑制肽的分離 采用響應(yīng)面法確定的最佳工藝條件，通過超聲預(yù)處理制備茶渣蛋白酶解液。首先，將制備的酶解液通過1 μm 濾膜過濾去除大分子物質(zhì)和雜質(zhì)。采用截留分子量分別為10、5和3 kDa 的超濾膜進(jìn)行超濾。超濾條件：濾液濃度5%，pH7.0，壓力0.10 MPa，室溫操作。按分子量分為4 個(gè)部分：分子量＞10 kDa（簡稱為Tpep-1）、5～10 kDa（Tpep-2）、3～5 kDa（Tpep-3）、＜3 kDa（Tpep-4）。然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干，待測。

將所得樣品溶于去離子水中，配制濃度為2 mg/L的肽濃縮液，按照本文1.2.6 方法測定其ACE 抑制率。

1.2.8 茶渣ACE 抑制肽的活性研究 進(jìn)一步對Tpep-4 進(jìn)行了表征，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行了如下研究。

1.2.8.1 溫度對ACE 抑制肽活性的影響 將Tpep-4溶于100 mL 去離子水中配制成1 mg/mL 的多肽溶液，調(diào)節(jié)pH7.0，分別置于30、40、50、60、70、80、90 ℃中靜置5 h，間隔1 h 取樣，測定ACE 抑制率。

1.2.8.2 pH 對ACE 抑制肽活性的影響 將Tpep-4溶于100 mL 去離子水中，配制成1 mg/mL 的多肽溶液，用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)多肽溶液的pH 分別為2.0、4.0、6.0、8.0 和10.0，37 ℃保持2.5 h，間隔0.5 h 取樣，測定ACE 抑制率。

1.2.8.3 鹽溶液對ACE 抑制肽活性的影響 將Tpep-4 溶于0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L 的NaCl 溶液中，保證肽質(zhì)量濃度為1 mg/mL。在室溫下放置2 d測定ACE 的抑制率。

1.2.8.4 體外消化實(shí)驗(yàn)對ACE 抑制肽活性的影響體外消化是根據(jù)文獻(xiàn)[18]描述的方法進(jìn)行的，并稍加修改。胃消化過程的體外實(shí)驗(yàn)：將Tpep-4 配置成2 mg/mL 的ACE 抑制肽溶液，隨后用鹽酸將肽溶液的pH 調(diào)至2.0，加入樣品含量5%的胃蛋白酶，37 ℃水浴4 h，間隔1 h 采樣，水浴結(jié)束后100 ℃沸水浴使酶失活5 min，待冷卻至室溫，測定消化液的ACE抑制率。腸道消化過程的體外實(shí)驗(yàn)：取一定劑量的上述消化液，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至8.0；按樣品量加入5%的胰蛋白酶，在37 ℃水浴中繼續(xù)消化4 h，同樣間隔1 h 取樣，消化結(jié)束后將消化液在100 ℃下放置5 min 使酶失活，待冷卻至室溫，測定消化液ACE 抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析使用Origin 8.5、Design-Expert.8.0.6和SPSS 19.0 等軟件進(jìn)行。獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是三次平行測試的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶篩選結(jié)果

由于不同種類蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，酶解獲得的多肽片段也不相同，表現(xiàn)出的體外ACE 抑制活性存在差異[19-20]。由圖1 可知，五種蛋白酶的ACE抑制率大小為堿性蛋白酶＞胰蛋白酶＞復(fù)合酶＞風(fēng)味蛋白酶＞木瓜蛋白酶。其中，木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的ACE 抑制率最低，水解2.5 h 后僅為17.9%。堿性蛋白酶水解的產(chǎn)品對ACE 的抑制率最高，水解2.5 h后ACE 抑制率達(dá)到50.0%。因此，選擇堿性蛋白酶解制備茶葉渣的ACE 抑制性肽。楊晨等[21]等篩選出堿性蛋白酶作為酶解南瓜籽制備南瓜籽ACE 抑制肽的最佳酶，所得的ACE 抑制率和水解度均為最高。Bhaskar 等[22]采用堿性蛋白酶酶解馬豆粉，獲得一個(gè)具有降低ACE 活性的肽段序列：TVGMTAKF，并發(fā)現(xiàn)其C 端含有Phe。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ACE 抑制肽C 末端倒數(shù)3 個(gè)氨基酸殘基中含有Trp、Tyr、Phe和Pro 時(shí)，ACE 抑制率大大提高[23]，這可能是堿性蛋白酶酶解茶渣蛋白的酶解產(chǎn)物活性較強(qiáng)的原因。

圖1 不同蛋白酶處理對酶解產(chǎn)物ACE 抑制率的影響Fig.1 Effects of different enzymes on ACE inhibitory rate of tea residue proteins

2.2 超聲方式的確定

蛋白質(zhì)分子、細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)多糖之間的離子相互作用會影響蛋白質(zhì)的提取[24]。因此，提取過程中細(xì)胞壁的破壞是提高蛋白質(zhì)提取率的關(guān)鍵步驟[25]。圖2 顯示了不同超聲方法下ACE 抑制肽抑制率隨時(shí)間的變化，超聲波預(yù)處理顯著提高了茶渣中ACE抑制肽的抑制率，這可能是因?yàn)槌曨A(yù)處理破壞了植物細(xì)胞細(xì)胞壁，使堿性蛋白酶更好的與蛋白質(zhì)發(fā)生作用。

圖2 不同超聲方式對茶渣ACE 肽抑制率的影響Fig.2 Effect of different ultrasonic methods on ACE peptide inhibition rate of tea residue

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 超聲功率對ACE 抑制率的影響 實(shí)際生產(chǎn)過程的成本和目標(biāo)產(chǎn)物的傳質(zhì)效率與超聲功率有著密切的聯(lián)系，需選擇合適超聲功率進(jìn)行提取。在茶渣蛋白酶解過程中測試了五種不同水平的超聲功率，結(jié)果如圖3 所示。隨著超聲功率的增加，ACE 抑制率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，最高達(dá)62.3%±0.6%。適當(dāng)?shù)某暪β誓軌蚱茐募?xì)胞壁，為蛋白酶提供更多結(jié)合位點(diǎn)增多，更易使茶渣蛋白酶解生成小分子肽段[26]。但超聲功率增加到一定程度出現(xiàn)過飽和現(xiàn)象，形成音障，阻礙超聲波傳遞，使ACE 抑制率出現(xiàn)下降[27]。綜合考慮，選擇超聲功率300 W 為佳。

圖3 超聲功率對ACE 抑制率的影響Fig.3 Influence of ultrasonic power on ACE inhibitory rate

2.3.2 超聲溫度對ACE 抑制率的影響 即使是同一個(gè)物種，不同溫度會刺激不同蛋白質(zhì)溶解。如圖4所示，ACE 抑制率隨著溫度的升高而增加，在45 ℃時(shí)達(dá)到最大值62.8%±0.3%。但當(dāng)進(jìn)一步升高時(shí)，ACE 抑制率開始下降，空話作用逐漸明顯，一方面，由于溫度升高導(dǎo)致酶發(fā)生熱變性導(dǎo)致酶活性降低；另一方面，高溫、高壓環(huán)境會導(dǎo)致自由基形成，自由基破壞酶分子構(gòu)象，酶活性受到抑制[28]。因此，選擇超聲溫度45 ℃為佳。

圖4 超聲溫度對ACE 抑制率的影響Fig.4 Influence of ultrasonic temperature on ACE inhibitory rate

2.3.3 超聲時(shí)間對ACE 抑制率的影響 如圖5 所示，隨著超聲時(shí)間的延長，ACE 抑制率先升高后降低，在30 min 達(dá)到最大值62.7%±0.6%，超聲帶來的聲波震動、空化效應(yīng)和機(jī)械剪切作用，對茶渣蛋白提供更多酶切位點(diǎn)[29]。超聲時(shí)間過長可能將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，影響ACE 抑制肽的提取，降低ACE 抑制率。因此，選擇超聲時(shí)間30 min 為佳。

圖5 超聲時(shí)間對ACE 抑制率的影響Fig.5 Influence of ultrasonic time on ACE inhibitory rate

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以超聲功率、超聲溫度、超聲時(shí)間為響應(yīng)值，采用Box-Behnken 法進(jìn)行酶解工藝優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用軟件Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for Box-Behnken

利用Design-Expert.8.0.6 對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到多元二次響應(yīng)面回歸模型方程為：

Y=0.38-6.500E-003A-3.625E-003B-1.375E-003C+3.250E-003AB-1.250E-003AC+2.500E-003BC-0.020A2-0.012B2-9.800E-003C2

模型P值極顯著（P＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.1379＞0.05），表明模型穩(wěn)定。表3 中，該模型的決定系數(shù)R2為0.9880，這表明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合效果理想。一次項(xiàng)（A）和二次項(xiàng)（A2、B2、C2）對響應(yīng)值影響極其顯著（P＜0.01），說明超聲功率、超聲溫度和超聲時(shí)間對酶解效果的影響并非一元的簡單線性關(guān)系。交互項(xiàng)AB 對響應(yīng)值影響極其顯著（P＜0.01），說明超聲功率和超聲溫度之間的交互作用很好。通過F值比較得到了各因素對ACE 抑制率的影響，依次為超聲功率＞超聲溫度＞超聲時(shí)間。綜上所述，該模型擬合度較好，可以用超聲波預(yù)處理茶渣蛋白酶解制備茶渣蛋白ACE 抑制肽。

年青的姑娘們，她們?nèi)齼沙呻p，坐著馬車，去選擇衣料去了，因?yàn)榫鸵獡Q春裝了。她們熱心地弄著剪刀，打著衣樣，想裝成自己心中想得出的那么好，她們白天黑夜地忙著，不久春裝換起來了，只是不見載著翠姨的馬車來。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

如圖6A、圖6C 所示，響應(yīng)面的斜率趨勢平緩，說明超聲功率和超聲溫度以及超聲功率和超聲時(shí)間的交互作用不顯著，對應(yīng)表3 中AB 的P值為0.7451＞0.05，BC 為0.5905＞0.05。由圖6B 可知，響應(yīng)面斜率趨勢陡峭，等高線圖呈橢圓形，表明超聲溫度和超聲時(shí)間的交互作用極顯著，與表3 中AC（P=0.0052＜0.01）的P值相對應(yīng)。

圖6 各因素交互作用對ACE 抑制率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface map of interaction of factors on ACE inhibition rate

通過分析和響應(yīng)面模型預(yù)測得到超聲預(yù)處理酶解制備ACE 抑制肽的最佳條件為：底物濃度2%，加酶量8000 U/g，pH8.5，超聲功率300 W，超聲溫度45.29 ℃，超聲時(shí)間24.56 min（考慮到實(shí)際操作，將超聲功率、超聲溫度和超聲時(shí)間調(diào)整為300 W、45 ℃和25 min），此條件下的ACE 抑制肽的抑制率為64.8%±0.2%，與預(yù)測結(jié)果65.61%接近，表明回歸模型能夠反映酶解制備ACE 抑制肽的過程。

2.5 分子量對茶渣ACE 抑制肽活性的影響

本實(shí)驗(yàn)分別采用截留分子量為10、5、3 kDa 的超濾膜對茶渣ACE 抑制肽進(jìn)行分離，得到＞10 kDa（TPep-1）、5～10 kDa（TPep-2）、3～5 kDa（TPep-3）、＜3 kDa（TPep-4）的四種組分，分別配制成2 mg/mL的ACE 抑制肽溶液，其ACE 抑制率如表4 所示。結(jié)果表明隨著分子量的減少其ACE 抑制率明顯升高，說明小分子量范圍的茶渣ACE 抑制肽具有更強(qiáng)的活性，這可能是由于高分子質(zhì)量肽段結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具備抑制活性的氨基端沒有暴露，無法起到降低ACE抑制率的作用[30]。章禹航等[31]在鲅魚加工副產(chǎn)物制備ACE 抑制肽研究時(shí)得出類似結(jié)論，分子量小于3 kDa的超濾組分具有最高的ACE 抑制率。

表4 不同分子量范圍的茶渣ACE 肽的抑制率Table 4 Comparison of ACE inhibitory peptides from tea residue with different molecular weight

2.6 茶渣ACE 抑制肽的穩(wěn)定性

肽類物質(zhì)穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短、生物膜滲透性差，其穩(wěn)定性差是肽類藥物開發(fā)的主要問題[32-33]。

2.6.1 溫度對茶渣ACE 抑制肽活性的影響 經(jīng)過不同溫度條件處理后的ACE 抑制肽的抑制活性結(jié)果如圖7 所示，溫度從30 ℃上升到90 ℃，Tpep-4 的ACE 抑制率都略有下降。90 ℃時(shí)隨著時(shí)間的推移，Tpep-4 的ACE 抑制率由78.3%降低至74.0%，減少了4.3%，這可能是高溫使肽鏈被破壞從而抑制其活性。這說明，當(dāng)溫度保持在體溫時(shí)，ACE 抑制肽是穩(wěn)定的，但多肽在加工過程中應(yīng)控制好溫度，避免長時(shí)間高溫環(huán)境。

圖7 溫度對Tpep-4 組分的ACE 抑制率影響Fig.7 Effect of temperature on the ACE inhibitory rate of Tpep-4

圖8 pH 對Tpep-4 組分的ACE 抑制率影響Fig.8 Effect of pH on the ACE inhibitory rate of Tpep-4

2.6.3 鹽溶液對茶渣ACE 抑制肽活性的影響 如圖9 所示,氯化鈉鹽溶液的濃度從0.2 mol/L 增長至0.6 mol/L，茶渣ACE 抑制肽的ACE 抑制率無顯著變化（P＞0.05）；當(dāng)鹽溶液濃度繼續(xù)增大至1.2 mol/L時(shí)，ACE 抑制率出現(xiàn)明顯下降趨勢此時(shí)為69.3%，相比于劉鑫酮從皮氏蛾螺中所制備ACE 抑制仍有較高抑制[35]。表明茶渣ACE 抑制肽在不同濃度的鹽溶液中均表現(xiàn)出良好的活性。

圖9 鹽濃度對Tpep-4 組分的ACE 抑制率影響Fig.9 Effect of salt concentration on the ACE inhibitory rate of Tpep-4

2.6.4 體外消化實(shí)驗(yàn)對茶渣ACE 抑制肽活性的影響 由表5 可知，茶渣ACE 抑制肽在經(jīng)胃消化酶、胰蛋白酶處理后，Tpep-4 的ACE 抑制率原先的82.3%降至65.2%，其中經(jīng)過胃蛋白酶處理降低9.0%，胰蛋白酶處理降低8.1%，這可能是因?yàn)樵谙缸饔孟拢琓pep-4 進(jìn)一步進(jìn)行酶解，生成了ACE 抑制較弱的片段，其結(jié)果相較于劉文穎等[36]研究乳清低聚肽對ACE 抑制作用體外消化影響保持較高活性。這說明消化前后茶渣ACE 抑制肽都具有較好抑制率，有望在體內(nèi)能夠表現(xiàn)出良好穩(wěn)定性并發(fā)揮其功能。

表5 茶渣ACE 抑制肽體外模擬消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of in vitro simulated digestion of tea residue ACE inhibitory peptides

3 結(jié)論

利用超聲波預(yù)處理茶渣蛋白輔助堿性蛋白酶酶解制備ACE 抑制肽。通過選擇不同的超聲方式輔助酶解制備茶渣ACE 抑制肽，最終確定超聲預(yù)處理茶蛋白為最適的超聲方式；分析比較5 種不同酶制備的茶渣蛋白ACE 肽的抑制率，選取了堿性蛋白酶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。篩選出超聲波輔助制備茶渣蛋白ACE 抑制肽的最佳提取工藝條件是超聲功率300 W、超聲溫度45 ℃、超聲時(shí)間25 min、底物濃度2%、酶添加量8000 U/g、酶解pH8.5、酶解時(shí)間2.5 h、酶解溫度60 ℃，ACE 抑制率為64.8%±0.2%。采用超濾法將酶解液分離成＞10 kDa（TPep-1）、5-10 kDa（TPep-2）、3-5 kDa（TPep-3）、＜3 kDa（TPep-4）的四種組分，當(dāng)茶渣蛋白ACE 抑制肽的分子量范圍＜3 kDa、時(shí)，ACE 抑制率最高達(dá)到82.3%±0.6%。TPep-4 組分茶渣ACE 抑制肽不僅具有良好的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和鹽溶液穩(wěn)定性，同時(shí)具有較強(qiáng)的抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶消化能力。本試驗(yàn)不僅確定超聲波預(yù)處理技術(shù)可作為制備茶渣蛋白ACE 抑制肽的有效方法，也為其進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。