李銳定，王文萱，張雨荷，周 樊，鄭文軒，張欽任，孟 寧，時(shí)鳳翠，李全陽(yáng)

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004）

聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)（FAO）以及世界衛(wèi)生組織（WHO）將益生菌定義為在適量條件下可以對(duì)宿主健康有益的活體微生物[1]。它們可以通過(guò)改善腸道微生態(tài)系統(tǒng)間接參與代謝、免疫反應(yīng)以及疾病，從而影響人體健康[2]。乳桿菌屬作為一類益生菌在人體腸道中廣泛分布[3]，研究表明，乳桿菌屬中的發(fā)酵乳桿菌具有降解膽固醇、抗氧化以及抑制病原體的功效[4-5]。同時(shí)，乳桿菌屬作為長(zhǎng)壽老人的優(yōu)勢(shì)菌群[6-7]，也開(kāi)始受到人們的廣泛關(guān)注。長(zhǎng)壽老人源乳桿菌已經(jīng)被證明了具有延緩衰老[8]、抑制基因毒性[9]、調(diào)節(jié)炎癥健康[10]以及改善免疫調(diào)節(jié)[11]等功效，說(shuō)明長(zhǎng)壽老人源乳桿菌具有良好的潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值。

發(fā)酵乳桿菌LTP1332 是本課題組從廣西巴馬長(zhǎng)壽老人糞便篩選分離得到的一株優(yōu)良腸道益生菌，體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明了其具有良好的益生性能[12]。蘭海靜等[13]和黃燕婷等[14]等將發(fā)酵乳桿菌LTP1332添加至小鼠優(yōu)化飼料中喂養(yǎng)衰老小鼠，使小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和學(xué)習(xí)記憶能力等得到明顯改善。以上研究結(jié)果說(shuō)明了發(fā)酵乳桿菌LTP1332 有良好的益生特性，具有開(kāi)發(fā)成益生菌產(chǎn)品的潛力。

由于益生菌在儲(chǔ)存以及腸道運(yùn)輸過(guò)程中的活性明顯降低，因此可能無(wú)法實(shí)現(xiàn)自身潛在的益生特性[15-16]。微膠囊化作為一種新型的保護(hù)技術(shù)，可以增強(qiáng)益生菌抵御不良環(huán)境的能力，保證益生菌順利到達(dá)腸道定殖并更好地發(fā)揮自身益生特性[17-18]。選擇合適的壁材是微膠囊包埋技術(shù)的關(guān)鍵，由于用海藻酸鹽與Ca2+交聯(lián)制備凝膠具有無(wú)毒、成本低、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[15]，使得海藻酸鹽也成為了目前最廣泛使用的益生菌微膠囊凝膠壁材[19]。然而，單一的海藻酸鹽凝膠體系通常具有較強(qiáng)的半透性，這使得當(dāng)酸性過(guò)低或者Ca2+過(guò)量時(shí)，形成的凝膠會(huì)發(fā)生一定的降解甚至崩塌[20]。將海藻酸鹽與其他材料復(fù)合可以有效克服這種困難，從而提高膠囊的護(hù)菌效果[21-23]。在食品工業(yè)中應(yīng)用較多的益生菌微膠囊化方法有三種：擠壓法[24-25]、乳化法[16,26]和噴霧干燥法[27-29]。擠壓法相比于另外兩種方法，它具有對(duì)設(shè)備材料要求不高、膠囊大小均勻成球以及菌體包埋率高的特點(diǎn)[30]。選擇合適的工藝條件可以更好地增加微膠囊對(duì)益生菌的包埋率[31]，但包埋率和微膠囊的工藝條件之間存在著一種非線性關(guān)系，所以使用傳統(tǒng)的回歸模型優(yōu)化，可能效果不佳。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)輸入、輸出樣本進(jìn)行反復(fù)訓(xùn)練學(xué)習(xí)后，可以有效逼近任意復(fù)雜的非線性函數(shù)，所以在針對(duì)非線性系統(tǒng)的建模、預(yù)測(cè)問(wèn)題上受到了許多研究者的關(guān)注[32-34]。將徑向基函數(shù)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與遺傳算法相結(jié)合可以通過(guò)自然選擇和群體遺傳機(jī)理，對(duì)復(fù)雜性形態(tài)的非線性函數(shù)進(jìn)行全局優(yōu)化，這也正適合用來(lái)解決益生菌微膠囊工藝條件探索的問(wèn)題。

為此，本研究以廣西巴馬百歲老人糞便樣品中分離篩選鑒定的發(fā)酵乳桿菌LTP1332 為試驗(yàn)菌種。采用擠壓法制備益生菌微膠囊，選擇海藻酸鈉、明膠作為復(fù)合壁材，并通過(guò)殼聚糖進(jìn)行二次包埋。利用RBF-GA 模型探究了發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊的最佳制備工藝。最后分析微膠囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)、胃液耐受性以及腸液釋放性等特性，以此來(lái)測(cè)評(píng)微膠囊化對(duì)發(fā)酵乳桿菌LTP1332 的護(hù)菌效果。以期能為發(fā)酵乳桿菌LTP1332 在食品工業(yè)上的應(yīng)用提供技術(shù)支撐，也為益生菌微膠囊產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發(fā)酵乳桿菌LTP1332（Lactobacillus fermentum，LTP1332）由本團(tuán)隊(duì)分離篩選自廣西巴馬瑤族自治縣健康百歲老人的糞便，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏號(hào)：CCTCC M 2019029）；海藻酸鈉、殼聚糖、蔗糖 上海源葉生物科技有限公司；海藻糖河南萬(wàn)邦化工科技有限公司；胰蛋白酶（1:250）、胃蛋白酶（1:10000）美國(guó)Sigma 公司；明膠 成都金山化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水氯化鈣 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

GR85DP 立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；DHP-9272D 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；ZWYR-240 恒溫培養(yǎng)振蕩箱 上海智城分析儀器制造有限公司；AC2-4S1生物安全柜 新加坡藝思高；ME104/02 分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；日立S-3400N型掃描電鏡 日本日立電子有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液的制備 將發(fā)酵乳桿菌LTP1332 接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h 后，進(jìn)行活化傳代。將擴(kuò)大培養(yǎng)的發(fā)酵乳桿菌LTP1332 通過(guò)離心（4500 ×g，4 ℃，15 min）獲取菌泥[35]，棄去上清液后，將菌泥沉淀重懸于20 mL NaCl 溶液（8.5 g/L）并在相同條件下再次離心。然后將洗滌的菌泥重新懸浮在NaCl 溶液中以獲得活菌數(shù)約為108CFU/mL 菌懸液。

1.2.2 微膠囊的制備

1.2.2.1 CS-SA-微膠囊 將配制好的海藻酸鈉溶液，經(jīng)過(guò)0.22 μm 濾膜除菌后，與制備好的菌懸液按2:1比例混合。用無(wú)菌注射器將混合液滴入無(wú)菌CaCl2固化劑中，形成微囊。用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?，使微囊，均勻成球，以無(wú)菌紗布過(guò)濾，并用無(wú)菌水沖洗膠囊表面殘留的Ca2+以及未被包埋的益生菌[36]。取10.0 g過(guò)濾后的顆粒添加到90 mL 新鮮制備的殼聚糖溶液（0.1%，w/v）中[20]。磁力攪拌5 min，使顆粒均勻包裹一層殼聚糖，用無(wú)菌紗布過(guò)濾并經(jīng)無(wú)菌水沖洗表面殘留的Ca2+及過(guò)量殼聚糖等多余物質(zhì)，即可得到濕膠囊。

1.2.2.2 CS-GEL-SA-微膠囊 將配制好已知的明膠溶液，使用磁力攪拌器攪拌懸浮1 h，經(jīng)過(guò)0.22 μm孔徑濾膜進(jìn)行過(guò)濾后以備用[36]。將明膠、海藻酸鈉、菌懸液按照1:1:1 比例混合后按照1.2.2.1 節(jié)中的方法制備濕膠囊。

1.2.3 濕膠囊真空冷凍干燥 將所得的濕膠囊平鋪于培養(yǎng)皿中，加入適量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑溶液（5%蔗糖、5%海藻糖），于-20 ℃預(yù)凍2 h，經(jīng)真空干燥，干燥壓力600 Pa，干燥時(shí)間約18 h，得到干膠囊。

1.2.4 包埋率的計(jì)算 冷凍干燥結(jié)束后，采用EDTA溶液（pH8.0）解囊，破壞膠囊結(jié)構(gòu)使膠囊內(nèi)包埋菌液得以釋放，通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法確定膠囊中包埋活菌數(shù)。微膠囊包埋率（Microencapsulation efficiency，ME，%）計(jì)算公式如下所示：

式中：ME 表示微膠囊包埋率，%；N1表示微膠囊中所含活菌數(shù)，CFU/g；N0表示未形成微膠囊前原始菌液活菌數(shù)，CFU/g。

微膠囊解囊：取0.1000±0.0020 g 微膠囊顆粒，溶解于30 mL EDTA 溶液中，于180 r/min 振蕩處理5 min，待膠囊充分解囊，吸取混合液梯度倍數(shù)稀釋后涂布。

1.2.5 膠囊制備工藝參數(shù)單因素的篩選 以微膠囊包埋率為參數(shù)，固定條件為：固化劑濃度3.3%、固化劑時(shí)間15 min、明膠濃度0.2%、海藻酸鈉濃度2%。測(cè)定固化劑濃度（2.1%、2.7%、3.3%、3.9%、4.5%）、固化時(shí)間（5、10、15、20、25 min）、明膠濃度（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%）、海藻酸鈉濃度（1%、1.5%、2%、2.5%、3%）對(duì)發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊包埋率大小的影響，以確定單因素的最佳條件。

1.2.6 微膠囊制備工藝BBD 模型設(shè)計(jì) 基于單因素實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果，選取固化劑濃度（A）、固化時(shí)間（B）和海藻酸鈉濃度（C）為自變量，并固定明膠添加量為0.1%，發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊的包埋率作為響應(yīng)值進(jìn)行BBD 模型設(shè)計(jì)，響應(yīng)面因素與水平編碼設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平編碼設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.2.7 RBF 徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 RBF 徑向基函數(shù)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)從輸入到隱藏層的是非線性映射，從隱藏層到輸出的是線性映射，可以很大程度上加快神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)訓(xùn)練的速度并避免產(chǎn)生局部極小值[37]，具體實(shí)現(xiàn)過(guò)程如圖1 所示。利用BBD 模型設(shè)計(jì)中的3 個(gè)因素（固化劑濃度、固化時(shí)間、海藻酸鈉）作為輸入層，最終包埋率設(shè)置為輸出層。選取數(shù)據(jù)集中的70%為訓(xùn)練集，30%為測(cè)試集，最大訓(xùn)練次數(shù)為100次，學(xué)習(xí)精度為10-5，學(xué)習(xí)步長(zhǎng)為0.05[38]，以此來(lái)構(gòu)建RBF 人工網(wǎng)絡(luò)模型。

圖1 RBF 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)過(guò)程Fig.1 Implementation process of RBF neural network

1.2.8 RBF-GA 模型尋優(yōu)設(shè)計(jì) 將RBF 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練后的預(yù)測(cè)結(jié)果作為個(gè)體適應(yīng)度值，變量的上下限對(duì)應(yīng)BBD 模型設(shè)計(jì)因素的最高及最低值，設(shè)置最大遞代次數(shù)為60 次、代溝為0.25、交叉概率0.8、變異概率0.01。以此來(lái)模擬生物的選擇、交叉和變異等現(xiàn)象，尋找函數(shù)的全局最優(yōu)值及對(duì)應(yīng)輸入值[38]，RBFGA 模型尋優(yōu)的基本流程圖如圖2 所示。

圖2 RBF-GA 尋優(yōu)的基本流程Fig.2 Basic flow of RBF-GA

1.2.9 BBD 與RBF-GA 模型比較 參考文獻(xiàn)[39]中的方法，以均方根誤差（Root mean square error，RMSE）、平均絕對(duì)偏差（Mean Absolute Error，MAE）和絕對(duì)系數(shù)（R2）大小作為評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)微膠囊工藝優(yōu)化模型的指標(biāo)。其中RMSE 和MAE 的取值的越低，R2取值越高，則表示構(gòu)建的模型越穩(wěn)定，且具有一定的優(yōu)勢(shì)。

1.2.10 微膠囊掃描電鏡（SEM）分析 用導(dǎo)電膠將制備好的干微膠囊平鋪固定在樣品臺(tái)上，氧氣吹去表面殘留雜質(zhì)后，15 mA 離子化電流噴金2 min，通過(guò)掃描電鏡觀察發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊內(nèi)部的結(jié)構(gòu)特征。

1.2.11 微膠囊在模擬胃液中的耐受性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取0.1000±0.0020 g 冰箱儲(chǔ)存的干微膠囊樣品，加入3 mL 人工模擬胃液（0.002 g/mL NaCl、0.0032 g/mL胃蛋白酶，用稀鹽酸調(diào)整pH 為2.0，過(guò)濾除菌后以備用）[12]，混勻15 s，設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min，振蕩處理，在0、30、60、90、120 min 時(shí)，取處理液中的微膠囊，經(jīng)EDTA 解囊后，梯度取適量解囊液進(jìn)行稀釋涂布，測(cè)定菌落數(shù)。并取0.1 mL 制備好的菌懸液，加入到3 mL 人工模擬胃液中做對(duì)照試驗(yàn)。

1.2.12 微膠囊在模擬腸液中的釋放性試驗(yàn) 參考周莉[21]、石月[40]的實(shí)驗(yàn)方法，并稍做改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取0.1000±0.0020 g 冰箱儲(chǔ)存的干微膠囊樣品，加入3 mL 人工模擬腸液（0.0068 g/mL KH2PO4、0.01 g/mL胰蛋白酶、0.003 g/mL 膽鹽，用0.4% NaOH 調(diào)pH至8.0）[12]，混勻15 s，設(shè)置轉(zhuǎn)速為200 r/min，搖床振蕩，在30、60、90、120、150 min 時(shí)，取1 mL 混合液于離心管中，經(jīng)過(guò)500 r/min 離心5 min，取上清液，稀釋涂布，測(cè)定菌落數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均設(shè)置 3 次重復(fù)。利用Design-Expert V10.0.7 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)；Excel 2016 軟件、Graph-Pad Prism V8.0.2 軟件、Origin 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖；MATLAB R2019b 軟件構(gòu)建人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型及運(yùn)行遺傳算法尋優(yōu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊制備工藝單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 固化劑濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響 選擇合適的工藝參數(shù)可以有效提高發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊的包埋率。按照1.2.2.2 中的方法制備發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊，由圖3 可知，固化劑用量由2.2%增加到3.9%時(shí)，包埋率快速上升。隨著Ca2+含量逐漸增多，整個(gè)體系能夠與壁材發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的Ca2+相對(duì)減少，導(dǎo)致反應(yīng)受到限制，無(wú)法包埋更多數(shù)量的發(fā)酵乳桿菌LTP1332，同時(shí)，局部鈣離子的濃度過(guò)大，滴入的混合液很快被固化，從而導(dǎo)致制備的微膠囊壁材不穩(wěn)定，不能更好得保護(hù)菌液，因此，在固化劑濃度3.9%時(shí)包埋率達(dá)到最大值，之后整體出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。綜上所述，選擇固化劑濃度3.9%為最適單因素條件。

圖3 固化劑濃度對(duì)LTP1332 微膠囊包埋率的影響Fig.3 Effect of curing agent concentration on the encapsulation rate of LTP1332 microcapsules

2.1.2 固化劑時(shí)間對(duì)微膠囊包埋率的影響 從圖4可以看出，隨著固化劑作用的時(shí)間增加，發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊的包埋率在逐漸上升，當(dāng)固化時(shí)間超過(guò)15 min 后整體呈下降趨勢(shì)，此時(shí)包埋率最大可達(dá)94.8%±0.41%。壁材間交聯(lián)反應(yīng)達(dá)到飽和后，隨著固化時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致膠囊的脆性增加，從而導(dǎo)致包埋率降低[40]。因此，選擇固化時(shí)間15 min 作為發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊的最佳單因素制備條件。

圖4 固化劑時(shí)間對(duì)LTP1332 微膠囊包埋率的影響Fig.4 Effect of curing time on the encapsulation rate of LTP1332 microcapsules

2.1.3 海藻酸鈉濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響 由圖5可知，海藻酸鈉過(guò)低時(shí)，形成的凝膠顆粒機(jī)械強(qiáng)度低，在攪拌時(shí)很容易被攪散，因此不能有效地包埋菌體，導(dǎo)致包埋率相對(duì)較低；在海藻酸鈉濃度從1%提高到2%的過(guò)程中，隨著海藻酸鈉溶液濃度的增加，更多的Ca2+可以與海藻酸鈉相結(jié)合，導(dǎo)致混合液粘度增大，菌液不容易分散，微膠囊的包埋率也在逐漸增加；當(dāng)濃度超過(guò)2%后，海藻酸鈉與Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)增多，導(dǎo)致海藻酸鈉中ɑ-L-古洛糖醛酸（ɑ-L-guluronic，G）單元上的Na+不能夠完全與Ca2+發(fā)生離子交換反應(yīng)，從而不能結(jié)合成密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[23]。因此將2%海藻酸鈉作為發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊的最佳單因素制備條件。

圖5 海藻酸鈉濃度對(duì)LTP1332 微膠囊包埋率的影響Fig.5 Effect of sodium alginate concentration on the encapsulation rate of LTP1332 microcapsules

2.1.4 明膠濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響 由圖6 可知，加入明膠后可以顯著提高發(fā)酵乳桿菌LTP1332微膠囊的包埋率（P＜0.01），但當(dāng)明膠添加量超過(guò)0.1%后，微膠囊包埋率的變化不顯著（P＞0.05），因此不將其作為今后的優(yōu)化條件，后續(xù)條件優(yōu)化過(guò)程中固定添加0.1%的明膠。

圖6 明膠濃度對(duì)LTP1332 微膠囊包埋率的影響Fig.6 Effect of gelatin concentration on the encapsulation rate of LTP1332 microcapsules

2.2 微膠囊工藝BBD 模型設(shè)計(jì)

2.2.1 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn) 以發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊的包埋率為響應(yīng)值，按照表1 中的因素水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。根據(jù)表2 的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合得到二元多項(xiàng)方程為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design scheme and results of response surface test

式中：Y 表示益生菌微膠囊的包埋率，%；A 表示固化劑濃度，%；B 表示固化時(shí)間，min；C 表示海藻酸鈉濃度，%。

2.2.2 方差分析 根據(jù)表3 可知，響應(yīng)面模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明了BBD 模型的試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合良好，沒(méi)有產(chǎn)生失擬現(xiàn)象，模型可用。在二元多項(xiàng)式的方程決定系數(shù)R2為0.9690，校正決定系數(shù)R2adj為0.9292，說(shuō)明了BBD模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)以及方程的擬合度良好，所得到的二元多項(xiàng)式方程可靠性高。同時(shí)，交互項(xiàng)AC、BC，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊的包埋率影響顯著（P＜0.05），而交互項(xiàng)AB 表現(xiàn)為不顯著（P＞0.05），這表明了各個(gè)影響因素與微膠囊的包埋率之間存在著一種非線性關(guān)系，圖7 更直觀地反映了3 個(gè)影響因子對(duì)微膠囊包埋率的影響。模型中的F值可以反映出各因素對(duì)所設(shè)參數(shù)影響程度的大小，一般F值越大，因素對(duì)參數(shù)的影響程度就越大[41]。根據(jù)F值可知，對(duì)發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊包埋率影響程度由大到小的排序?yàn)镃＞B＞A，即海藻酸鈉的濃度影響程度最大，固化劑時(shí)間其次，固化劑濃度影響程度最小。

表3 以包埋率為響應(yīng)值的回歸模型及方差分析Table 3 Regression model and analysis of variance with embedding rate as response value

圖7 各因素交互作用對(duì)包埋率的響應(yīng)曲面Fig.7 Response surface of interaction of various factors to embedding rate

2.3 RBF-GA 模型預(yù)測(cè)

2.3.1 RBF 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模 RBF 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有最佳逼近和全局最優(yōu)的性能，基本方式是用徑向基函數(shù)構(gòu)建隱藏層，將輸入的低維矢量變換至高維空間內(nèi)，從而可以使低維空間內(nèi)線性不可分的問(wèn)題在高維空間內(nèi)線性可分[37]。將表2 作為RBF 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練和測(cè)試樣本數(shù)據(jù)集，該模型的訓(xùn)練及預(yù)測(cè)效果如圖8 所示。

圖8 RBF 模型的訓(xùn)練樣本和測(cè)試樣本中的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值對(duì)比Fig.8 Comparison of actual and predicted values in training samples and test samples of RBF model

圖8A 反映對(duì)訓(xùn)練集的訓(xùn)練情況，預(yù)測(cè)值和實(shí)際值的重合程度越高說(shuō)明訓(xùn)練效果越好，本研究的訓(xùn)練集經(jīng)過(guò)100 次以后，R2達(dá)到0.9836，說(shuō)明經(jīng)訓(xùn)練后神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的擬合度較高，可用于之后的測(cè)試。圖8B 反映了測(cè)試結(jié)束后程序自動(dòng)將剩余的測(cè)試集帶入模型進(jìn)行測(cè)試的結(jié)果，除第二個(gè)樣本略微出現(xiàn)偏離外，整體測(cè)試趨勢(shì)良好，可以用來(lái)對(duì)發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊包埋率的后續(xù)模擬。

2.3.2 RBF-GA 模型尋優(yōu)結(jié)果 設(shè)定的最大遺傳代數(shù)60，變量的二進(jìn)制位數(shù)為8，利用GA 對(duì)RBF 徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行遞代尋優(yōu)。由圖9 可知，隨著遞代次數(shù)的不斷增加，個(gè)體適應(yīng)度所處的平穩(wěn)期逐漸增長(zhǎng)，這說(shuō)明個(gè)體的適應(yīng)能力會(huì)隨著適應(yīng)函數(shù)的減小而逐漸增大[37]。通過(guò)MATLAB R2019b 軟件運(yùn)行GA 算法程序，模擬生物進(jìn)化過(guò)程中的選擇、交叉、變異等自然選擇情形，經(jīng)過(guò)約24 次的迭代，適應(yīng)度曲線趨于平穩(wěn)，尋找到最優(yōu)值，迭代結(jié)束。由GA 迭代程序運(yùn)行結(jié)束的輸出結(jié)果可得，包埋率的最大預(yù)測(cè)值為94.919%。對(duì)應(yīng)的海藻酸鈉濃度，固化劑濃度和固化時(shí)間的最優(yōu)值分別為4.451%，2.210%和13.529 min。此時(shí)包埋率實(shí)測(cè)平均值為95.08%±0.25%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為3.28%，且預(yù)測(cè)值與實(shí)際值基本吻合，說(shuō)明RBF-GA 模型的尋優(yōu)結(jié)果及各參數(shù)可靠。

圖9 RBF-GA 模型60 次迭代尋優(yōu)結(jié)果Fig.9 Result of optimization with 60 iterations of the RBF-GA model

2.4 兩種優(yōu)化模型比較

2.4.1 RBF-GA 和BBD 預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)比 表4 為BBD和RBF-GA 模型所提供的發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊包埋率預(yù)測(cè)值。結(jié)合表4 中兩種優(yōu)化模型的實(shí)測(cè)值及預(yù)測(cè)結(jié)果，分別計(jì)算出BBD 和RBF-GA 模型的RMSE、MAE 以及R2值，分別為0.3513、0.3307、0.9690 和0.2586、0.1259、0.9832。BBD 和RBF-GA模型對(duì)發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊包埋率預(yù)測(cè)值的評(píng)估結(jié)果如圖10 所示。將二者的RMSE、MAE、R2進(jìn)行對(duì)比，并結(jié)合圖10 可以發(fā)現(xiàn)RBF-GA 模型比BBD 模型具有更為準(zhǔn)確的評(píng)估預(yù)測(cè)能力。由于微膠囊工藝參數(shù)與包埋率的非線性較強(qiáng)，RBF-GA與BBD 模型相比具有更好的擬合效果，這與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)遺傳算法模型在其它領(lǐng)域的應(yīng)用效果類似[42-43]。

表4 BBD 和RBF-GA 模型的預(yù)測(cè)值Table 4 Predicted values of BBD and RBF-GA models

圖10 對(duì)比包埋率的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值Fig.10 Comparison of measured value and predicted value of embedding rate

2.4.2 RBF-GA 和BBD 優(yōu)化結(jié)果對(duì)比 RBF-GA 和BBD 模型優(yōu)化各項(xiàng)參數(shù)、預(yù)測(cè)值以及實(shí)際值的對(duì)比如表5 所示。就發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊包埋率的平均實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值而言，RBF-GA 模型較BBD模型分別提高了0.76%和0.471%。由圖11 可知，RBF-GA 模型的RMSE 和MAE 均小于BBD 模型，說(shuō)明RBF-GA 模型具有更好的預(yù)測(cè)性能。單從包埋率的優(yōu)化結(jié)果看，盡管本文優(yōu)化結(jié)果顯著性不高（P=0.0197＜0.05），但依舊表明該法具有可行性。因?yàn)镽BF-GA 模型在優(yōu)化的過(guò)程中并不需要其它額外的試驗(yàn)，方法較為簡(jiǎn)單，這也與許多研究者的方法相似，在BBD 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，使BBD 作為人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)遺傳算法目標(biāo)函數(shù)的二階模型，最終在優(yōu)化中均取得了更好的結(jié)果[44-45]。因此，可以認(rèn)為RBF-GA 模型在發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊制備工藝探究中已對(duì)BBD 的二階模型進(jìn)一步優(yōu)化。

圖11 不同模型RMSE 和MAE 比較Fig.11 Comparison of RMSE and MAE of different models

表5 RBF-GA 模型與響應(yīng)面優(yōu)化模型下的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值比較Table 5 Comparison of optimization results of RBF-GA and BBD for protectants

2.5 微膠囊質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果

2.5.1 微膠囊外觀 一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)擠壓法制得的微膠囊，平均粒徑在2～5 mm[46]，且粒徑在2～4 mm 范圍內(nèi)的藻酸鹽水凝膠顆粒對(duì)包裹在其中的益生菌具有更好的保護(hù)作用[47]。按照1.2.2.2 方法，本研究制備的RBF-GA 優(yōu)化條件下的濕膠囊平均粒徑為2.76±0.43 mm，干膠囊的平均粒徑為1.25±0.26 mm，粒徑大小在前人探索的優(yōu)質(zhì)范圍之內(nèi)，具體效果如圖12 所示。

圖12 發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊效果圖Fig.12 Effect diagram of Lactobacillus fermentum LTP1332 microcapsule

2.5.2 掃描電鏡（SEM）本研究通過(guò)SEM 掃描電鏡觀察RBF-GA 優(yōu)化工藝條件下發(fā)酵乳桿菌LTP1332干微膠囊形態(tài)。經(jīng)過(guò)冷凍干燥后，微膠囊的形態(tài)會(huì)發(fā)生變化[48]，發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊形狀由規(guī)范球體變?yōu)椴灰?guī)則球形。這可能是由于殼聚糖的沉積，在海藻酸鹽表面形成聚電解質(zhì)膜，從而導(dǎo)致膠囊壁材的外表面出現(xiàn)了一定的褶皺現(xiàn)象。圖13A 為發(fā)酵乳桿菌LTP1332 膠囊的部分截面圖，可以發(fā)現(xiàn)微膠囊的內(nèi)部為多孔狀，應(yīng)該是海藻酸鹽上的G 單位與Ca2+形成離子橋?qū)е碌模@也證明了海藻酸鈉和CaCl2之間很好地發(fā)生了離子性凝膠化[20]。圖13B～D 為圖13A中紅框部分的逐步放大圖，從中可以發(fā)現(xiàn)，在微膠囊壁材上表面附著桿狀的發(fā)酵乳桿菌LTP1332，這顯示著微膠囊化可以對(duì)發(fā)酵乳桿菌LTP1332 進(jìn)行包埋和保護(hù)。

圖13 發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊掃描電鏡圖Fig.13 SEM of the Lactobacillus fermentum LTP1332 microcapsule

2.6 模擬胃腸道消化試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 模擬胃液耐受性試驗(yàn)結(jié)果 只有保證益生菌能夠在胃腸道中大量健康存活，才能使其更好地發(fā)揮出自身益生特性。因此，研究了RBF-GA 最優(yōu)工藝下的發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊（CS-GEL-SA-微膠囊）在人工模擬胃液中的生存力，并與未添加明膠的CS-SA-微膠囊進(jìn)行對(duì)比（如圖14 所示）。在食品中，每克或每毫升產(chǎn)品中活菌數(shù)要大于106～107才被認(rèn)為是有效的[49]，在剛開(kāi)始進(jìn)行模擬胃作用時(shí)，三組的活菌數(shù)都可達(dá)4×107CFU/g 以上，組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），符合食品要求。在模擬胃液120 min時(shí)，兩組微膠囊的活菌數(shù)都發(fā)生了明顯下降，對(duì)此結(jié)果解釋是，微膠囊顆粒表面存在一些相對(duì)較大的孔徑，這有利于有機(jī)酸、氧氣和消化酶等小分子擴(kuò)散到微膠囊中，從而使包埋的發(fā)酵乳桿菌LTP1332 失活[20]。此時(shí)CS-GEL-SA-微膠囊與CS-SA-微膠囊的益生菌存活率分別為22.48%±0.78%和14.33%±0.32%，相比之下CS-GEL-SA-微膠囊益生菌存活率更高，說(shuō)明添加明膠復(fù)合后能有效改善微膠囊表面的孔徑大小，增強(qiáng)菌體的存活率。CS-GEL-SA-微膠囊相比于未包埋的發(fā)酵乳桿菌LTP1332 在模擬胃液中的存活率提高了18.71%±1.76%，說(shuō)明了按照優(yōu)化工藝制備的CS-GEL-SA-微膠囊，在胃液中可以表現(xiàn)出良好的護(hù)菌效果。在初始活菌數(shù)為4.377×107±0.388×107CFU/g情況下，經(jīng)人工模擬胃液處理后活菌數(shù)仍可達(dá)0.984×107±0.034×107CFU/g，這與國(guó)內(nèi)外的研究相比已經(jīng)到達(dá)較高水平[31]。

圖14 胃液耐受性模擬評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果Fig.14 Gastric fluid tolerance simulation assessment test results

2.6.2 模擬腸液釋放性試驗(yàn)結(jié)果 在腸液中由于pH 偏堿性，在陰離子的作用下，導(dǎo)致益生菌微膠囊的體積開(kāi)始膨大，最終導(dǎo)致體系破裂，從而保證益生菌微膠囊可以更好地解囊，釋放出益生菌[21]。從圖15可知，隨著微膠囊在人工模擬腸液中的處理時(shí)間延長(zhǎng)，按照RBF-GA 優(yōu)化工藝條件下制備的CS-GELSA-微膠囊中的發(fā)酵乳桿菌LTP1332 會(huì)連續(xù)釋放，到90 min 時(shí)釋放率即可達(dá)到最高，90 min 之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但不顯著（P＞0.05），此時(shí)測(cè)得菌體存活率為94.324%±2.034%，活菌數(shù)在108CFU/g 左右，這說(shuō)明了該CS-GEL-SA-微膠囊具有較好的腸溶性。食品在腸道中一般3 h 左右就能完成消化[50]，CSGEL-SA-微膠囊在人工腸模擬液中處理90 min 時(shí)，菌體的釋放率即可達(dá)到最大值，這也為其能更好的在人體中發(fā)揮益生作用提供了保障。

圖15 腸液釋放性模擬評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果Fig.15 Results of the simulated evaluation test for the release of intestinal fluid

3 結(jié)論

本研究采用RBF-GA 模型等系列方法確定了發(fā)酵乳桿菌LTP1332 微膠囊的最優(yōu)制備工藝為2.210%海藻酸鈉，4.451% CaCl2，0.1% 明膠，固化時(shí)間13.529 min。RBF-GA 模型的RMSE、MAE、R2值分別為0.2586、0.1259、0.9832，經(jīng)驗(yàn)證，RBF-GA 模型的預(yù)測(cè)性能及包埋率優(yōu)化結(jié)果均好于BBD 模型，此時(shí)微膠囊平均包埋率為95.08%±0.25%。CS-GELSA-微膠囊顯著提高了發(fā)酵乳桿菌LTP1332 在模擬胃腸液中的存活率（P＜0.05），在模擬胃液處理120 min后，包埋菌體的存活率仍可達(dá)22.48%±0.78%的較高水平，相比于未包埋的發(fā)酵乳桿菌LTP1332 存活率提高了18.71%±1.76%，說(shuō)明本研究開(kāi)發(fā)的微膠囊具有較好的護(hù)菌效果。在腸液釋放性試驗(yàn)中，CS-GELSA-微膠囊中在人工模擬腸液處理90 min 時(shí)，菌體的釋放率即可達(dá)到最高，具有較好的腸溶性。因此認(rèn)為，本研究獲得的發(fā)酵乳桿菌LTP1332 CS-GELSA-微膠囊工藝，為其在食品工業(yè)中走向?qū)嶋H應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)，此外，RBF-GA 模型的應(yīng)用也為其它益生菌產(chǎn)品的工藝探究?jī)?yōu)化提供了新的手法。