安 宇，周欣雨，王 穎,2,3,，佐兆杭，孫 維，張乃丹，龐惟俏

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江大慶 163319）

紅豆（Vigna angularis）是豆科植物的一種，又稱為小豆、赤豆等[1]。紅豆?fàn)I養(yǎng)價值較高，蛋白平均含量為25.2%，富含膳食纖維，礦物質(zhì)和維生素種類豐富[2]，氨基酸種類齊全，必需氨基酸水平達(dá)到甚至高于FAO/WHO 的要求[3]。此外，其還具有的較高藥用價值，如滋脾、益氣、抗氧化和抑制腫瘤細(xì)胞增長等，同時可作為糖尿病患者食用的優(yōu)選[4]，研發(fā)應(yīng)用前景極為廣闊。

雖然紅豆蛋白營養(yǎng)豐富，但由于其乳化性等功能特性較差[5]，限制了其在食品工業(yè)的應(yīng)用，因此，適度的改性處理可擴(kuò)展紅豆蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用[6]。目前有關(guān)紅豆蛋白的改性方法有堿溶酸沉法、微射流、微波等方法。例如周偉等[7]研究指出，在pH＞5 的堿性條件、較低溫度和NaCl 低濃度環(huán)境下均能提高小豆蛋白的功能特性。黃科禮等[5]采用微射流方法對紅豆分離蛋白進(jìn)行改性處理繼而增強(qiáng)紅豆蛋白理化與功能特性。但化學(xué)改性可能會產(chǎn)生或引入有毒物質(zhì)或影響食品風(fēng)味的物質(zhì)，微波改性收益較低、成本較高。相較之下，超聲波作為被公認(rèn)為一項(xiàng)綠色技術(shù)，具有操作簡單、實(shí)施方便[8]、成本低、能耗低[9]等優(yōu)點(diǎn)。已有相關(guān)研究報道，超聲處理可改變豌豆蛋白[10]、大豆蛋白[11]乳化性等功能特性，但目前關(guān)于利用超聲技術(shù)，研究不同超聲條件及超聲前后對紅豆蛋白理化性質(zhì)及抗氧化能力影響的研究較少。因此，本研究以紅豆蛋白為原料，研究了超聲前后及不同超聲參數(shù)工藝對紅豆蛋白理化性質(zhì)及抗氧化能力的影響，以期為紅豆蛋白的開發(fā)應(yīng)用提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)支持，具有現(xiàn)實(shí)理論意義和應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂紅豆蛋白（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%）三原天域生物制品有限公司；5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）、乙二胺四乙酸 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甘氨酸 上海吉至生化科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）美國Sigma 公司；T-AOC 試劑盒、鐵離子還原力試劑盒 上海博湖生物科技有限公司；以上試劑 均為分析純。

AR2140 電子天平 常州勵岸寶機(jī)械設(shè)備科技有限公司；DL-360B 型超聲波清洗機(jī)、FD-1A-50 型冷凍干燥機(jī)、JIDI-18D 型臺式多用途高速離心機(jī)上海之信儀器有限公司；UV759 型紫外分光光度計(jì) 愛來寶醫(yī)療科技有限公司；PHS-3CpH 計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；NLM100 均質(zhì)機(jī) 上海人和科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅豆蛋白的超聲處理 參考Tomotake 等[12]的方法制備樣品，略有改動。取20 g 脫脂紅豆蛋白粉分散在100 mL 蒸餾水中并攪拌均勻。參考文獻(xiàn)[13-14]設(shè)置超聲功率為160、400 W，超聲時間為10、20、30 min，將蛋白溶液分別上述條件下進(jìn)行超聲處理。超聲功率160 W 設(shè)為A 組，400 W 設(shè)為B組，樣品分別標(biāo)記為A1、A2、A3、B1、B2、B3?？瞻讓φ諡椴贿M(jìn)行超聲處理的干燥紅豆蛋白粉。超聲結(jié)束后，將樣品平鋪放入容器中，-80 ℃冰箱冷凍12 h后，凍干機(jī)干燥成粉末，于4 ℃冰箱密封保存。

1.2.2 紅豆蛋白水解度測定 利用鄰苯二甲醛（OPA）法對紅豆蛋白進(jìn)行水解度[15]測定。用紫外可見光分光光度計(jì)測定其吸光度（340 nm），注意OD 值要在精確反應(yīng)2 min 后進(jìn)行測定。按照下列公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：h 表示水解的肽鍵數(shù)；hhot表示總肽鍵數(shù)；SerineNH2表示mmol SerineNH2/g 蛋白；α、β分別用常數(shù)1.00、0.40 表示；X 表示待測樣重量（g）；P 表示待測樣中的蛋白含量（g/mL）；0.1 為待測樣體積轉(zhuǎn)換成L[16]。

1.2.3 紅豆蛋白溶解度測定 采用雙縮脈試劑法測量蛋白的溶解度[17]。同理測定總蛋白濃度，溶解度定義為上清液中蛋白濃度與總蛋白濃度的比值。

1.2.4 紅豆蛋白游離巰基與二硫鍵含量測定 游離巰基含量：將10 mmol/L 5,5′-二硫代-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）溶解在0.1 mol/L Tris -甘氨酸緩沖液（2.5%SDS，0.004 mol/L EDTA，0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，pH8.0）中得到Ellman’s 試劑。取50 μL DTNB緩沖液與2 mL 濃度為0.01 g/mL 的樣品溶液混合，25 ℃避光反應(yīng)30 min，紫外分光光度計(jì)測定吸光度（412 nm），以緩沖液為空白。

總巰基含量：將適量的蛋白質(zhì)樣品溶解于尿素-Tris -甘氨酸緩沖液（10 mol/L 尿素，2.5% SDS，0.004 mol/L EDTA，0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，pH8.0）和β-巰基乙醇（β-Me；加入50 μL），搖勻后在25 ℃暗室孵育60 min。8000 r/min 離心20 min，將得到的上清溶于5 mL 濃度為12% 的TCA（w/v）中，重復(fù)3 次。離心后將沉淀溶解于2.5 mL 的Tris-甘氨酸溶液中，加入50 μL DTNB，25 ℃避光孵育30 min。最后，用紫外分光光度計(jì)在412 nm 處測量吸光度。巰基含量的計(jì)算公式如下：

式中：A412表示樣品在412 nm 處減去空白后的紫外吸光度值；D 表示樣品稀釋倍數(shù)；C 為樣品濃度（g/mL）。

1.2.5 紅豆蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性測定 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定參考Wu 等[18]報道的方法。計(jì)算公式如下：

式中：θ表示乳化液中的油相體積分?jǐn)?shù)（25%）；A0表示0 min 時混合液的吸光度值；A1表示0 min時混合液的吸光度值。

1.2.6 紅豆蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性測定 配制100 mL 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的蛋白分散液，8000 r/min轉(zhuǎn)速下均質(zhì)2 min（每20 s 停頓20 s，共均質(zhì)6 次），快速轉(zhuǎn)入量筒中記錄剛轉(zhuǎn)入量筒的泡沫體積V總，并分別記錄在2、30 min 時的泡沫體積為V0、V30。

1.2.7 紅豆蛋白抗氧化能力測定

1.2.7.1 紅豆蛋白總抗氧化能力測定 取0.5 g 紅豆蛋白加入50 mL 去離子水中，混合均勻。采用TAOC 試劑盒測定，結(jié)果表示為U/g。

1.2.7.2 紅豆蛋白DPPH 自由基清除能力測定 參考張雪春等[19]的方法，略有改動。以無水乙醇為溶劑，配制濃度為2×10-4mol/L 的DPPH 溶液，于4 ℃冰箱備用。各加入0.5 mL 不同濃度的樣品到4 mL的2×10-4mol/L DPPH 自由基溶液，搖勻室溫下靜置30 min。517 nm 下測定其吸光值A(chǔ)；同時測定4 mL 2×10-4mol/L DPPH 自由基溶0.5 mL 的60%乙醇混合液的吸光值A(chǔ)c，計(jì)算公式如下:

1.2.7.3 紅豆蛋白鐵離子還原能力測定 取0.5 g 紅豆蛋白加入50 mL 去離子水中，混合均勻。使用鐵離子還原力試劑盒測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)，結(jié)果以平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。利用Excel、SPSS 22.0 等進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和分析，采用Origin 2018 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲處理對紅豆蛋白水解度的影響

超聲前后對紅豆蛋白水解度的影響如圖1。超聲前后紅豆蛋白的水解度差異顯著（P＜0.05）。超聲功率400 W 處理20 min（B2）時，紅豆蛋白的水解度達(dá)到最大值21.3%。杜雙奎等[20]研究表明，由于超聲處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)會使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)中活性部位暴露進(jìn)而增加了水解度。但當(dāng)超聲功率不變，時間繼續(xù)增加時，水解度開始下降。分析是因超聲過度使暴露在外的蛋白質(zhì)活性部位被破壞，導(dǎo)致水解度開始降低[21]。所以，適度超聲處理可提高紅豆蛋白水解度。

圖1 不同超聲條件對紅豆蛋白水解度的影響Fig.1 Effects of different ultrasonic conditions on the degree of protein hydrolysis of adzuki bean

2.2 超聲處理對紅豆蛋白溶解度的影響

溶解度是蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)之一[22]。如圖2，與空白對照相比，超聲處理顯著提高（P＜0.05）了紅豆蛋白溶解度，且隨超聲功率與時間增加而升高，當(dāng)超聲功率400 W 處理20 min（B2）時紅豆蛋白的溶解度達(dá)到最大值76.65%。刁小琴等[23]研究指出，超聲產(chǎn)生的空化作用和機(jī)械效應(yīng)會將蛋白質(zhì)大分子解聚為小分子，從而降低蛋白質(zhì)粒徑，增強(qiáng)蛋白質(zhì)與水的相互作用，使蛋白質(zhì)溶解度增加。劉昕等[24]研究表明，由于超聲波使鷹嘴豆蛋白發(fā)生輕微變性，使蛋白結(jié)構(gòu)疏松，疏水肽數(shù)量增加，從而使蛋白質(zhì)溶解度提高。Zhong 等[25]指出，在不同溫度不同時間加熱對紅豆蛋白溶解度沒有太大的影響，相反，在熱與超聲共同作用下，隨著處理溫度和時間的增加，溶解度逐漸增加，所以認(rèn)定超聲是蛋白溶解度增加的主要原因。所以，合理范圍的超聲處理可顯著（P＜0.05）提高紅豆蛋白的溶解性。

圖2 不同超聲條件對紅豆蛋白溶解度的影響Fig.2 Effects of different ultrasonic conditions on solubility of adzuki bean protein

2.3 超聲處理對紅豆蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響

不同超聲條件對紅豆蛋白中游離巰基與二硫鍵含量變化如圖3 所示。由圖3 可知，超聲處理使蕓豆蛋白中游離巰基含量顯著增加（P＜0.05），二硫鍵的含量顯著降低（P＜0.05）；與空白對照相比，當(dāng)超聲功率400 W 處理20 min（B2）時游離巰基含量最高，增加了3.12 μmol/g，超聲功率400 W 處理30 min（B3）時二硫鍵含量最低，減少了1.35 μmol/g。趙城彬等[26]研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理5 min 時就可發(fā)現(xiàn)紅豆蛋白中游離巰基含量顯著增加（P＜0.05）。這是由于超聲波產(chǎn)生的空化作用使蛋白質(zhì)分子的顆粒減小，蛋白質(zhì)內(nèi)基團(tuán)發(fā)生了改變[27]。研究表明，超聲波破壞蛋白質(zhì)內(nèi)二硫鍵，分解成為新的游離巰基[28]。推測本實(shí)驗(yàn)中超聲處理造成蛋白質(zhì)內(nèi)部巰基的暴露與二硫鍵的斷裂，降低了蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致紅豆蛋白中游離巰基含量增加，二硫鍵含量減少。但當(dāng)超聲條功率400 W 處理30 min（B3）時，蛋白中游離巰基的含量開始減少。這是因?yàn)槌晻r間過長會產(chǎn)生過氧化氫，使游離巰基被氧化，進(jìn)而降低游離巰基含量[29]。

圖3 不同超聲條件對紅豆蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響Fig.3 Effects of different ultrasonic conditions on content of free sulfhydryl group and disulfide bond in adzuki bean protein

2.4 超聲處理對紅豆蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

乳化性代表蛋白質(zhì)在水和油界面的吸附能力，而乳化穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)在乳化液儲存并留在油水界面的能力。乳化穩(wěn)定性越高，則表示乳化性質(zhì)越好[30]。如圖4 所示，超聲處理顯著提高（P＜0.05）了紅豆蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性，當(dāng)超聲條功率400 W 處理10 min（B1）時紅豆蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性達(dá)到最佳，與空白對照相比，分別提高了78.62%、43.94%。但當(dāng)超聲功率不變，時間繼續(xù)增加時，乳化性及乳化穩(wěn)定性開始顯著下降（P＜0.05）。這是由于超聲時間過長使蛋白質(zhì)嚴(yán)重變性，被解聚成小顆粒的蛋白質(zhì)重新聚集成大顆粒，從而降低它的乳化性[31]。楊柳等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在設(shè)置功率240 W、時間10 min的超聲處理下，紅豆蛋白的乳化活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05），但當(dāng)超聲時間大于20 min 時，紅豆蛋白乳化活性減弱。望運(yùn)滔等[33]研究指出，超聲處理會使鷹嘴豆分離蛋白的乳化性顯著提高（P＜0.05）。所以，合理范圍的超聲處理能夠顯著增加（P＜0.05）紅豆蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性。

圖4 不同超聲條件對紅豆蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of different ultrasonic conditions on emulsification and stability of adzuki bean protein

2.5 超聲處理對紅豆蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響

由圖5 可知，超聲處理顯著增加（P＜0.05）了紅豆蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性。當(dāng)超聲條功率400 W處理10 min（B1）時紅豆蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性分別達(dá)到最大值160.94%、74.37%。分析是超聲處理產(chǎn)生的空化作用使蛋白質(zhì)分子聚集程度減小而松散，使得蛋白質(zhì)更易吸附在氣-水界面上，增加了紅豆蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性[34]。Xiong 等[35]表明了超聲處理10 min 以上可顯著增加豌豆蛋白的起泡性。望運(yùn)滔等[33]研究到隨著超聲強(qiáng)度的增加，鷹嘴豆蛋白的起泡性顯著增強(qiáng)（P＜0.05），超聲處理20 min時，起泡性達(dá)到最大值。因此，適當(dāng)?shù)某曁幚砟軌蛴行У奶岣呒t豆蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性。

圖5 不同超聲條件對紅豆蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of different ultrasonic conditions on foamability and foamability stability of adzuki bean protein

2.6 超聲處理對紅豆蛋白抗氧化能力的影響

紅豆蛋白的抗氧化能力如圖6 所示，超聲前后蛋白抗氧化能力差異顯著（P＜0.05）。在超聲條功率160 W 處理30 min（A3）時紅豆蛋白總抗氧化能力最強(qiáng)，與空白對照相比增加了101.58%；DPPH 自由基清除能力與Fe 離子還原能力在超聲條功率400 W處理10 min（B1）時達(dá)到最大值，與空白對照相比分別增加了78.23%、33.52%。Penta 等[36]發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的抗氧化能力主要與組氨酸以及疏水性氨基酸有關(guān)，而賈俊強(qiáng)等[37]研究表明，超聲波處理會加速蛋白質(zhì)疏水性氨基酸外露。由此說明，超聲處理可增加蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸基團(tuán)數(shù)量，從而增加紅豆蛋白的抗氧化能力。You 等[38]研究指出超聲處理使紅豆蛋白中含有的類似于組氨酸、蘇氨酸等非特異性蛋白暴露在蛋白表面的數(shù)量增多，這些非特異性蛋白能夠?qū)e3+還原成Fe2+，從而提高紅豆蛋白的Fe 離子還原能力。當(dāng)超聲功率不變，時間繼續(xù)增加時，蛋白的三種抗氧化能力指標(biāo)數(shù)值開始下降，推測是因超聲時間過長，暴露氨基酸基團(tuán)重新被掩埋，樣品抗氧化能力降低。

圖6 不同超聲條件對紅豆蛋白抗氧化能力的影響Fig.6 Effects of different ultrasonic conditions on antioxidant capacity of adzuki bean protein

3 結(jié)論

與空白對照相比，超聲處理可以顯著增強(qiáng)（P＜0.05）紅豆蛋白的溶解度、水解度、乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及起泡穩(wěn)定性，超聲處理使游離巰基含量增加，二硫鍵含量減少，且紅豆蛋白抗氧化能力的三種指標(biāo)均顯著提高（P＜0.05）。但超聲過度時，紅豆蛋白的理化性質(zhì)數(shù)值與抗氧化能力均會下降，因此，適度的超聲處理可以使紅豆蛋白理化性質(zhì)及抗氧化能力提高。本研究為進(jìn)一步探討超聲處理對紅豆蛋白的理化性質(zhì)及抗氧化能力奠定基礎(chǔ)，為紅豆等雜糧的開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。