何秋玲，張彩平，桂 靜，劉泳杏，季久秀，周 波，張 震,

（1.桂林醫(yī)學院藥學院，廣西桂林 541199；2.桂林醫(yī)學院智能醫(yī)學與生物技術(shù)學院，廣西桂林 541199；3.臨沂大學農(nóng)林科學學院，山東臨沂 276005；4.桂林醫(yī)學院科學實驗中心，廣西桂林 541199）

蔗糖的過量攝取與高血糖、高血脂、非酒精性脂肪肝（Non-alcohol Fatty Liver Disease，NAFLD）等慢性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。持續(xù)的高蔗糖飲食會促進脂肪生成，引發(fā)脂肪沉積于肝臟，導致肝臟白細胞浸潤和促炎細胞因子溢出，顯著增加了非酒精性脂肪肝病的發(fā)病風險[2]。非酒精性脂肪肝病又使得機體對葡萄糖的代謝能力下降、肝糖原合成減少，從而引發(fā)高血糖和高胰島素血癥，胰島素敏感性降低，加速以胰島素抵抗為特征的II 型糖尿病的發(fā)展，促使脂肪酸的從頭合成和甘油三酯合成，導致血脂水平升高[3-4]。隨著現(xiàn)代社會糖尿病和高血脂患者的不斷增加，人們不斷探索新型的甜味劑，以期在滿足日常需要的同時還可降低因過量攝入引發(fā)的健康風險。

異麥芽酮糖（Isomaltulose）又稱帕拉金糖，是由D-果糖和D-葡萄糖通過α-1,6 糖苷鍵連接的天然二糖，其味道和外觀均與蔗糖類似，在工業(yè)上于1954年首次以蔗糖為原料實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。目前，我國列入食品安全國家標準食品添加劑使用標準（GB 2760-2014）的食糖替代品有異麥芽酮糖、麥芽糖醇、山梨醇、木糖醇等。其中只有異麥芽酮糖的最大使用量不受限制，其它糖醇超過一定攝入量會出現(xiàn)不同程度的助瀉現(xiàn)象[5]。Keyhani-Nejad 等[6]報道，與蔗糖相比，異麥芽酮糖能夠維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)，降低餐后葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽（glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP）和胰島素的釋放，有助于預(yù)防非酒精性脂肪肝。Hwang 等[7]研究發(fā)現(xiàn)異麥芽酮糖具有比蔗糖更慢的消化速率，可以減少肝臟中脂肪堆積和提高葡萄糖耐量，攝入異麥芽酮糖的的小鼠肝臟切片與正常小鼠無異。Jang 等[8]在14 名志愿者的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，異麥芽酮糖組餐后1 h 的血糖水平明顯低于蔗糖組，這一研究表明異麥芽酮糖緩慢水解的特性可使血糖保持平穩(wěn)，不會引起胰島素水平顯著升高，能有效地改善胰島素敏感性。Lee 等[9]使用蔗糖-異麥芽酮糖混合物（palatinose-sucrose mixtures）飼喂小鼠，結(jié)果顯示相比于飼喂含有30%異麥芽酮糖的混合物組的小鼠，飼喂含有50%異麥芽酮糖的混合物組小鼠血糖水平較低，HMGCR、CYP7A1和PPARγ基因表達量更低。

目前關(guān)于異麥芽酮糖的研究主要集中在其對血糖的影響上，而對它如何參與脂質(zhì)代謝的分子機制研究尚不深入。本研究比較異麥芽酮糖和蔗糖影響肝臟組織基因轉(zhuǎn)錄的差異，篩選和驗證其減少肝臟脂肪堆積的關(guān)鍵基因，為進一步研究異麥芽酮糖影響肝臟脂質(zhì)代謝的分子機制提供理論支撐。此外，中國廣西是蔗糖的主產(chǎn)區(qū)，目前已具備將蔗糖轉(zhuǎn)化為異麥芽酮糖的成熟工藝，本研究積極探索異麥芽酮糖的作用機制，對異麥芽酮糖的推廣和生產(chǎn)實踐也具有一定的積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級10 周齡雄性昆明小鼠（25～30 g）21 只，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（合格證號：SCXK（京）2021-0006）；小鼠日糧（含40.5%碳水化合物，41.5%脂肪和18%蛋白質(zhì)）北京科澳協(xié)力飼料有限公司；異麥芽酮糖（Cas 號：13718-94-0，BR 級）、蔗糖（Cas 號：57-50-1，BR 級）上海麥克林生化科技有限公司；乙醇、二甲苯 西隴化工股份有限公司；GeneJET RNA Purification Kit RNA 提取試劑盒、SYBR Green qPCR Master Mix Thermo Fisher；逆轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScript RT Master Mix Takara 公司；引物合成 生工生物工程（上海）股份有限公司。

RM2235 輪轉(zhuǎn)切片機 德國徠卡生物系統(tǒng)公司；ABI7900 實時熒光定量PCR 儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 異麥芽酮糖與蔗糖飼喂實驗 21 只雄性昆明小鼠隨機分為三個組：空白組、蔗糖組、異麥芽酮糖組，每組7 只，每籠3 只。為比較小鼠在相對自然的狀態(tài)下攝入異麥芽酮糖和蔗糖對其肝臟脂質(zhì)代謝的影響，避免短期大劑量飼喂對小鼠應(yīng)激和免疫方面的影響[10]。本實驗采用長期間隔的飼喂方式，具體方法如下：500 mg 蔗糖/異麥芽酮糖溶解于小鼠飲用水，配制成1%水劑，給與小鼠自由飲用，防止頻繁的抓取進行灌胃可能劃傷小鼠食道或氣管，影響小鼠的正常生長。每隔4 d 飼喂一次，飼喂前一晚禁食不禁水。除此外日糧為普通標準日糧，動物正常攝食和飲水，連續(xù)飼喂22 周，模擬人類長期少量的飲食攝入方式。實驗期間每天觀察小鼠的一般狀況，通過計量每次飼喂前后水瓶中的水量記錄小鼠的飲用量、稱量實驗前后小鼠的體重計算小鼠的平均日增重，飼喂結(jié)束后采用頸椎脫臼法處死小鼠。飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～25 ℃，相對濕度30%～60%。

1.2.2 肝臟組織切片和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的實驗驗證 取處死后小鼠的肝臟組織經(jīng)福爾馬林固定，酒精脫水，二甲苯透明后，進行石蠟包埋切片（30 μm），經(jīng)脫蠟后進行蘇木精—伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，使用Motic Med 6.0 數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對細胞形態(tài)和數(shù)目進行觀察和計算。取小塊小鼠肝臟提取RNA，取1 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄后利用Premier Bank設(shè)計引物（https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）。經(jīng)預(yù)實驗驗證了引物（表1）的有效性和特異性后，以β-actin 為內(nèi)參，反應(yīng)體系為cDNA 1 μL、前引物0.5 μL、后引物0.5 μL、2× Green qPCR mix 5 μL、DEPC ddH2O 3 μL；反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性2 min、94 ℃變性30 s、61 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)，使用標準曲線法進行實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR），以β-actin 表達量對各基因進行標準校正。

表1 本研究中所用的引物列表Table 1 List of primers used in this study

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲取 從GEO（Gene Expression Omnibus，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫[11]中篩選出飼喂異麥芽酮糖和蔗糖的小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)GSE54723（n=14，其中異麥芽酮糖飼喂7 例，蔗糖飼喂7 例）。人類非酒精性脂肪肝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自GEO 數(shù)據(jù)庫GSE163211（n=318，其中正常人肝臟組織9 例，NAFLD 病人309 例），使用Graphpad 軟件中的ROUT 函數(shù)（Q=1%）去除離群值后用于后續(xù)正常肝臟組織與NAFLD 之間的差異表達基因篩選[12]。

1.3.2 差異表達基因的篩選和基因通路分析 采用Limma 軟件包篩選基因芯片中飼喂異麥芽酮糖和蔗糖的小鼠肝臟組織以及正常人肝臟組織與NAFLD病人之間的差異表達基因（Differentially Expressed Genes，DEGs），篩選條件為P＜0.05，差異倍數(shù)|log2FC|≥1[13]。將篩選出的log2FC≥1 的基因定為上調(diào)基因，log2FC≤-1 的基因定為下調(diào)基因。利用GeneCards（https://www.genecards.org）和Rat Genome Database（https://rgd.mcw.edu/rgdweb/homepage/）進行基因功能查詢，Metascape（http://metascape.org/）進行差異表達基因通路富集分析[14]，利用imageGP 網(wǎng)站繪制差異基因火山圖和基因通路圖（http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/）。

1.3.3 基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵節(jié)點基因的篩選 使用String 網(wǎng)站（https://string-db.org/）分析DEGs 之間蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系[15]，設(shè)定篩選條件為combined score＞0.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein protein interaction network，PPI）。將String 所得的PPI 導入到Cytoscape3.6.1（http://www.cytoscape.org/）中，Centiscape 是Cytoscape 中一個可以一次計算多個中心值的插件，它基于拓撲和生物學屬性可搜尋最為顯著差異的基因。其中參數(shù)“度”（Degree）可評估網(wǎng)絡(luò)節(jié)點基因的調(diào)控性，用于衡量某蛋白與其它蛋白的相關(guān)性。Degree 值最大的基因即為核心基因，位于PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的中心位置[16]。本研究利用Centiscape插件計算網(wǎng)絡(luò)圖各節(jié)點的Degree 值，得到關(guān)鍵節(jié)點基因，并從Cytoscape 軟件中導出節(jié)點基因互作圖。使用R 軟件包“WGCNA”將基因表達量作為矩陣進行加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（Weighted correlation network analysis，WGCNA），計算關(guān)鍵模塊。該方法是一種多樣本基因表達模式的分析方法，可進行具有生物學意義的聚類分析，篩選tom 值排名前20 的模塊[17]，處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心的基因為核心基因，通常是具有關(guān)鍵作用的調(diào)控因子，并通過R 語言軟件（www.r-project.org/）導出核心基因。本研究采用兩種計算方法，取重疊的基因作為高可信度的節(jié)點基因，避免了單一算法出現(xiàn)偏好的情況。

1.3.4 顯著性檢驗 采用Student'st-test 對數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗，P＞0.05 為不顯著；P＜0.05 為顯著，用*表示；P＜0.01 為極顯著，用**表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 異麥芽酮糖組與蔗糖組小鼠肝臟組織差異基因表達分析

從GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫中下載飼喂異麥芽酮糖（n=7）和蔗糖（n=7）的小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)GSE54723，使用Limma 軟件包以P＜0.05 且差異倍數(shù)|log2FC|≥1 為篩選條件，共篩選出49 個DEGs，其中包含上調(diào)基因35 個，下調(diào)基因14 個（圖1A 和圖1C），差異基因的詳細功能和P值見表2。

表2 異麥芽酮糖和蔗糖飼喂組間小鼠肝臟組織差異表達的基因及其功能Table 2 Differentially expressed genes and their functions in liver tissue of mice fed with isomaltulose and sucrose

續(xù)表2

圖1 異麥芽酮糖與蔗糖處理組的差異基因表達火山圖（A）、通路富集圖（B）和柱狀圖（C）Fig.1 Volcano plot (A),pathway enrichment plot (B) and histogram (C) of differentially expressed genes between isomaltulose and sucrose treatment groups

將49 個差異表達基因?qū)隡etascape 進行基因通路富集分析[14]，結(jié)果顯示，這些DEGs 主要富集于4 條信號通路，包括胰腺分泌、蛋白質(zhì)消化吸收、脂肪消化吸收、甘油酯的新陳代謝信號通路（圖1B，表3）。說明同屬二糖的兩者在脂質(zhì)代謝方面確存在差異。

表3 差異基因富集的信號通路Table 3 Biological pathways of differential gene enrichment

2.2 差異基因網(wǎng)絡(luò)分析和關(guān)鍵節(jié)點基因的篩選

為篩選異麥芽酮糖影響肝臟基因表達的關(guān)鍵節(jié)點基因，本研究采用Cytoscape 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction,PPI）網(wǎng)絡(luò)[16]（圖2A）并利用WGCNA 進行加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析[17]（圖2B）共篩選到20 個節(jié)點基因。進一步取兩種算法中的重疊基因，最終得到10 個關(guān)鍵節(jié)點基因：Pnliprp1，Pnlip，Prss2，Clps，Tff2，Ctrl，Cpa1，Cel，Dmbt1，Vil1?；蚬δ苋绫? 所示，Pnliprp1、Pnlip、Cel、Clps這4 個基因與脂肪消化吸收相關(guān)。

表4 關(guān)鍵節(jié)點基因的功能分析Table 4 Functional analysis of key node genes

圖2 異麥芽酮糖與蔗糖組的差異基因互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Differential gene interaction network of isomaltulose and sucrose groups

2.3 異麥芽酮糖減少小鼠肝臟脂肪堆積的關(guān)鍵基因的驗證

構(gòu)建關(guān)鍵節(jié)點基因的網(wǎng)絡(luò)互作圖，發(fā)現(xiàn)Pnliprp1、Pnlip、Cel、Clps這4 個與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因之間存在相互作用，并且富集于脂肪消化這一通路，最終確定Pnliprp1、Pnlip、Cel、Clps為影響小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因（圖3A）。為驗證這一結(jié)果，本研究提取空白組、異麥芽酮糖組和蔗糖組的小鼠肝臟組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行qPCR，結(jié)果證實了在異麥芽酮糖組中這4 個與脂肪消化相關(guān)基因的表達量均高于蔗糖組（圖3B），空白組與異麥芽酮糖組之間則沒有顯著差異。這提示異麥芽酮糖可能通過Pnliprp1、Pnlip、Cel、Clps這4 個基因的上調(diào)促進了脂肪的分解，從而減少脂肪堆積于肝臟。通過肝臟組織切片HE 染色顯示空白組（圖3C）和異麥芽酮糖組（圖3D）肝細胞核形態(tài)正常，細胞質(zhì)均勻。蔗糖組（圖3E）肝臟細胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪變性，可見大小不一的脂肪空泡。應(yīng)用Motic Med6.0 圖像軟件計數(shù)每200 個肝細胞（5 個視野下）內(nèi)脂肪變性細胞數(shù)目，結(jié)果顯示空白組/異麥芽酮糖組/蔗糖組中脂肪變性細胞數(shù)目占比分別為4%、11%和35%。每只小鼠每日平均飼喂量為蔗糖組4.72±3.37 mL，異麥芽酮糖組4.62±2.98 mL，空白對照組4.46±2.53 mL；三組沒有顯著性差異（P＞0.05）。三組小鼠實驗期內(nèi)平均日增重分別為0.282±0.036，0.234±0.058 和0.213±0.022 g，蔗糖組小鼠平均日增重顯著高于異麥芽酮糖組和空白組（P＜0.05），異麥芽酮糖組和空白組間平均日增重無顯著差異（P＞0.05），與上述肝臟切片結(jié)果相一致，表明異麥芽酮糖相比蔗糖減少了的脂肪合成。

圖3 異麥芽酮糖減少小鼠肝臟脂肪堆積的關(guān)鍵基因的驗證Fig.3 Validation of key genes of isomaltulose reducing liver fat accumulation in mice

為進一步證實上述4 個關(guān)鍵基因與肝臟脂肪堆積的關(guān)聯(lián)，我們對從GEO 數(shù)據(jù)庫下載的318 個非酒精性脂肪肝病例肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)正常人肝臟中Pnlip、Pnliprp1、Cel、Clps基因的表達量均顯著高于病例組，與預(yù)期高度相符（圖4）。本研究表明，與攝入等量的蔗糖相比，食用異麥芽酮糖后肝臟中脂肪酶的表達量更高，有利于促進脂肪分解，減少了脂滴堆積于肝細胞。

圖4 PNLIP、PNLIPRP1、CEL、CLPS 基因在正常人和NAFLD 患者肝臟組織中的基因表達量圖Fig.4 PNLIP，PNLIPRP1，CEL，CLPS gene expression in liver tissues of normal people and NAFLD patients

3 討論與結(jié)論

NAFLD 是指除外酒精和其他明確的損肝因素，引起的脂肪過度堆積于肝臟的一類慢性疾病[18]。在全球的患病率達到25%，已成為世界上常見的肝病[19]。研究發(fā)現(xiàn)，甜味劑的過量攝入顯著提高了NAFLD 的發(fā)病風險[20-21]，近年來，隨著II 型糖尿病、肥胖癥等慢性病在全球范圍內(nèi)的流行，NAFLD 的患病率也呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢[22]。

Pnlip（胰脂肪酶）是由胰腺腺泡分泌的消化膳食甘油三酯的主要酶[23]，能降解膳食中50%～70%的甘油三酯[24]，當Pnlip 的表達上調(diào)后，機體對膳食脂肪的消化能力顯著增加[25-26]，從而減少肝臟脂肪堆積。先天性胰脂肪酶缺陷是一種罕見的外分泌胰腺衰竭疾病，其主要表現(xiàn)為脂肪瀉和消化不良[27]。Pnliprp1（胰脂肪酶相關(guān)蛋白1）是胰脂肪酶家族成員，有研究發(fā)現(xiàn)Pnliprp1 與卵母細胞成熟和卵黃形成相關(guān)的脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用[28]。當敲除小鼠體內(nèi)Pnliprp1基因后，小鼠表現(xiàn)出成熟型肥胖，肝臟內(nèi)脂肪質(zhì)量增加，還會產(chǎn)生胰島素抵抗，提示Pnliprp1基因可能參與脂肪代謝[29]。Cel（羧基酯脂肪酶）也稱為膽汁鹽依賴或刺激脂肪酶，存在于所有脊椎動物體內(nèi)[30]，主要在胰腺腺泡細胞和哺乳期乳腺中表達，它是一種能在十二指腸中水解膽固醇酯、脂溶性維生素的分解酶[31]。當Cel基因活性受到抑制時，小鼠表現(xiàn)出脂肪吸收不良[32]，提示Cel在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要的作用。Clps（輔脂肪酶）由胰臟產(chǎn)生，成熟的Clps 是一種具有最小二級結(jié)構(gòu)的高穩(wěn)定性10 kDa 蛋白[33]。Clps是脂肪酶催化水解膳食脂質(zhì)類的關(guān)鍵成分，雖然自身缺乏酶活性，但是它對胰腺脂肪酶的活性起促進作用[34]。

本研究通過分析GSE54723 中7 個飼喂異麥芽酮糖的小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)樣本和7 個飼喂蔗糖的小鼠肝臟組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)樣本，篩選出49 個DEGs，通過計算得到Pnlip、Pnliprp1、Cel、Clps為潛在的減少小鼠肝臟脂肪堆積的關(guān)鍵基因，隨后通過qPCR 實驗和非酒精脂肪肝病人肝臟組織基因表達數(shù)據(jù)中驗證得到Pnlip、Pnliprp1、Cel、Clps這4 個脂肪酶確實與肝臟脂肪堆積有關(guān)。這些結(jié)果表明：與蔗糖相比，食用異麥芽酮糖后，脂肪酶的表達量更高，促進脂肪分解，減少了脂滴堆積于肝細胞。

綜上所述，本研究運用生物信息學的方法篩選和驗證了Pnlip、Pnliprp1、Cel和Clps為異麥芽酮糖減少小鼠肝臟脂肪堆積的關(guān)鍵基因，為異麥芽酮糖影響肝臟脂質(zhì)代謝的分子機制研究提供了理論支撐。