羅 敏章 帆王利民李紅霞卿克勤

(成都市第一人民醫(yī)院檢驗科,成都 610000)

胃癌是起源于胃黏膜上皮組織的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅人類健康。 根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)2020 全球最新癌癥數(shù)據(jù)顯示:中國胃癌的發(fā)病人數(shù)約為47.8 萬(占全球43.9%),死亡人數(shù)約為37.3 萬(占全球48.6%) ,發(fā)病率和死亡率均位列第三位[1]。

胃癌患者的高死亡率主要是由于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,DNA 甲基化調(diào)控在胃癌的發(fā)生過程中具有重要意義[2],而腫瘤相關(guān)的microRNA 研究揭示出許多在腫瘤發(fā)生發(fā)展、耐藥以及預(yù)后等方面起重要作用[3]。 miR-219a-5p 已被報道在多種類型的腫瘤細胞中發(fā)揮重要調(diào)控作用:miR-219a-5p 抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲[4];miR-219a-5p 上調(diào)抑制了黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移并增強了黑色素瘤細胞的化學(xué)敏感性[5];miR-219a-5p 抑制上皮性卵巢癌細胞增殖,遷移和侵襲[6];miR-219a-5p 增強膽囊癌進展[7]。 但miR-219a-5p 及其甲基化調(diào)控在胃癌的發(fā)生發(fā)展中的機制尚不清楚。 本研究發(fā)現(xiàn)miR-219a-5p 在胃癌患者組織中受甲基化調(diào)控而出現(xiàn)表達水平明顯下調(diào),通過體外實驗進一步驗證過表達miR-219a-5p 后能明顯抑制細胞增殖和遷移侵襲的能力,提示在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的作用,為胃癌的診治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞

人胃癌細胞株MGC-803(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細胞中心)。

1.1.2 組織

胃癌組織及其相應(yīng)癌旁組織共110 例(均來自北京市腫瘤醫(yī)院2013~2016 年手術(shù)切除后凍存組織標(biāo)本)。 已通過成都市第一人民醫(yī)院(成都市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)倫理審查(2020 年KT 第006 號)。

1.2 主要試劑與儀器

1640 培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone 公司);熒光定量PCR 試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司);Lipofectamine 2000 細胞轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen 公司);miR-219a-5p-mimic(上海吉瑪生物技術(shù)有限公司);亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒EpiTect@Bisulfite kit(Qiagen 公司,貨號58694I);兔抗人P-caspase-3 抗體(Cell Signaling 公司,貨號8664L);CCK-8(Cell Counting Kit-8)(日本株式會社同仁化學(xué)研究所Dojindo,貨號CK04);凋亡試劑盒PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences 公司,貨號579563)。 Transwell 小 室(Minipore 公 司, 貨 號PIMP12R48);熒光定量PCR 儀(美國Bio-Rad IQ5);流式細胞儀(美國Coulter Flow c6)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量RT-PCR

文中所有引物的設(shè)計均根據(jù)Primer Premier 5 軟 件 設(shè) 計。 miR-219a-5p 逆 轉(zhuǎn) 錄 引 物: 5 ’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGACAGAATT-3’; U6 逆 轉(zhuǎn) 錄 引 物: 5’- AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3 ’; miR-219a-5p 定 量PCR 上 游 引物:5’-CAGCTGATTG TCCAAACGC-3’;miR-219a-5p 定量PCR 下游引物:5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;U6 定量PCR 上游引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3’;U6 定量 PCR 下 游 引 物: 5 ’-ACGCTTCACGAATTT GCGTGTC-3’。 定量PCR 反應(yīng)條件為:95℃ 5 min,95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,40 個循環(huán),72℃ 10 min。 均設(shè)復(fù)孔3 個。 IQ5 熒光定量PCR 儀進行PCR 檢測。 利用IQ5 自帶分析軟件導(dǎo)出相對表達值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.2 甲基化特異性PCR 及甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5’aza-2’-脫氧胞苷(5’ AZa-CDR)處理細胞

提取腫瘤組織及癌旁組織DNA,通過亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒處理后進行甲基化特異性PCR。 CPG島預(yù)測及甲基化引物設(shè)計利用在線軟件Methprimer (http:/ /www.urogene.org/methprimer/index1.html)及Primer Premier 5 軟件:甲基化上游引物:5’-TTGATTGTTTAAACGTAATTTTCGA-3’;甲基化下游引物:5’-CTAAAAACACACCTAAATCCCGAT-3’;非甲基化上游引物:5’-TTGATTGTTTAAATGTAATT TTTGA-3’;非甲基化下游引物:5’-CCTAAAAAC ACACCTAAATCCCA-3’。 甲基化特異性PCR 采用Touchdown PCR 的方法,反應(yīng)條件如下:95℃ 5 min,95℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 40 s,每個循環(huán)降0.6℃,10 個循環(huán)后,52℃ 30 s,72℃ 40 s,35 個循環(huán),72℃ 10 min。 用5、15、30 μmol/L 的不同濃度梯度的5’ AZa-CDR 和組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹 (TSA)處理胃癌細胞MGC-803 后,分析處理前后miR-219a-p 的表達變化情況。

1.3.3 細胞轉(zhuǎn)染和分組處理

MGC-803 細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640 完全培養(yǎng)基,37℃、5% CO2。 將MGC-803 細胞接種于6 孔板,待細胞融合度達到70%~80%時(貼壁24 h 內(nèi)),脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法:每孔100 μL 的無血清培養(yǎng)基中稀釋20 μL mimic,另外100 μL 的無血清培養(yǎng)基中稀釋Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑3 μL,各靜置5 min 后混合再靜置20 min;將上述混合液加入含細胞的6 孔板中,終體積為1 mL 無血清無雙抗1640 培養(yǎng)基,6 h 后更換新鮮完全培養(yǎng)基2 mL。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h,收獲細胞提取RNA 和蛋白質(zhì)。 把轉(zhuǎn)染control-mimic 和miR-219a-5p-mimic 的胃癌細胞MGC-803 命名為control-mimic(對照組)和miR-219a-5p-mimic(miR-219a-5p 過表達組)。 把沒有轉(zhuǎn)染的細胞命名為un-treated(未處理組)。

1.3.4 組織標(biāo)本與細胞總RNA 提取

按TRIzol 說明書操作提取組織或者細胞總RNA。 總RNA 通過瓊脂糖凝膠電泳法檢測其完整性。

1.3.5 檢測細胞增殖

取轉(zhuǎn)染后24 h 的MGC-803 細胞,重新鋪于96孔板中,相同實驗組各設(shè)4 個復(fù)孔。 每孔鋪5000 個細胞,分別設(shè)0、24、36、48、72 h 5 個時間點,檢測450 nm 與630 nm 雙波長下的光密度值(optical density, OD) ,制作時間增殖曲線,所有操作均按CCK-8 試劑盒說明書操作。

1.3.6 檢測細胞凋亡

取轉(zhuǎn)染后48 h 的胃癌細胞系MGC-803 用預(yù)冷的PBS 洗滌2 次,用Bind buffer 重懸,經(jīng)PE Annexin V 和7-Amino-actinomycin (7-AAD)雙染后1 h 內(nèi)送流式細胞儀檢測。

1.3.7 Western blot 檢測p-caspase-3 蛋白的表達

提取細胞(約1×106個)總蛋白,并將20 μg 總蛋白于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE)中電泳并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶室溫封閉2 h,將膜封閉于含有相應(yīng)一抗的抗體稀釋液中(1 ∶ 1000) ,4℃過夜。 次日用TBST(tris buffered saline with 0.05% Tween-20)緩沖液洗膜3次,每次10 min,然后加入相應(yīng)的二抗(1 ∶1000),室溫溫育1 h,TBST 洗膜3 次后顯影。 內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶重組蛋白(recombinant glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 一抗(1 ∶2000),二抗(1 ∶5000)。 用增強化學(xué)發(fā)光法顯色,X光片曝光顯影。

1.3.8 遷移和侵襲實驗

接種細胞前1 d 在Transwell 小室上準(zhǔn)備基質(zhì)膠,基質(zhì)膠與預(yù)冷的無血清1640 按1 ∶7 的比例以總量32 μL 鋪室面(做腫瘤遷移實驗則不需要此步);取不含血清的培養(yǎng)液制備單細胞懸液(每毫升2.5×105個)400 μL 加入上室中;在下室即24 孔板內(nèi)加入600 μL 含20% FBS 的1640 培養(yǎng)液。 將24孔板置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)24 h 后用濕棉簽檫去膜上面未穿過膜的細胞,無水乙醇固定20 min 后結(jié)晶紫染色,染色完畢后將小室自然風(fēng)干,用手術(shù)刀片沿壓痕將小室膜輕輕切下,置于載玻片上在顯微鏡下觀察、計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,各組均數(shù)通過方差齊性檢驗后,兩組間的比較采用t檢驗,P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-219a-5p 在胃癌組織及其癌旁組織中的差異表達

通過實時熒光定量PCR 我們分析了110 例胃癌患者癌組織(C)及癌旁組織(N) 標(biāo)本中的表達情況,數(shù)據(jù)用Log1.5 (C/N)表示,有72 例患者miR-219a-5p 的表達水平在癌組織中低于癌旁組織,另外38 例患者表達上調(diào)(見圖1A)。 miR-219a-5p 在癌組織中的表達值為(0.769±0.95),癌旁組織表達值為(2.114±5.10),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0063)(見圖1B)。

2.2 miR-219a-5p 在胃癌組織中的表達與臨床病理分期分型的相關(guān)性

本研究分析了110 例胃癌患者中miR-219a-5p的表達與臨床病理因素之間的相關(guān)性,其表達與年齡性別等無統(tǒng)計學(xué)差異,與臨床病理分型及分期有一定的相關(guān)性,miR-219a-5p 的表達隨著腫瘤分期的增加而進一步降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 miR-219a-5p 表達和胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n=110)Table 1 Relationship between miR-219a-5p expression and clinicopathological characteristics of gastric cancer patients

2.3 miR-219a-5p 的表達受表觀遺傳學(xué)調(diào)控

為了明確miR-219a-5p 在胃癌細胞中表達下調(diào)的原因,本研究首先進行生物信息學(xué)分析,利用MethPrimer 軟件預(yù)測miR-219a-5p 上游區(qū)域的CpG島(圖2A)。 采用MSP 檢測11 對miR-219a-5p 表達下調(diào)組和9 對表達上調(diào)組的胃癌組織和癌旁組織中miR-219a-5p 的甲基化狀態(tài)。 本研究發(fā)現(xiàn)miR-219a-5p 基因啟動子區(qū)域的高甲基化比例在miR-219a-5p表達下調(diào)組(72.7%,8/11)比表達上調(diào)組的甲基化比例(55.6%,5/9)更高(圖2B)。 此外,MGC-803經(jīng)5’ AZa-CDR 處理后,miR-219a-5p 的表達上調(diào)(圖2C),TSA 的聯(lián)合處理排除無其他表觀遺傳調(diào)控的影響。 綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明,miR-219a-5p 在胃癌中由于上游區(qū)域甲基化而表達下調(diào)。

注:A: 患者miR-219a-5p 在癌組織中的相對下調(diào)表達比例;B: miR-219a-5p 在癌組織及癌旁組織中的表達值分布情況。 與癌旁組織相比,??P<0.01。圖1 miR-219a-5p 在胃癌組織及其癌旁組織中的表達情況Note.A, Relative down-regulated expression ratio of miR-219a-5p in cancer tissues of patients.B, Distribution of expression values of miR-219a-5p in cancer tissues and adjacent tissues.Compared with adjacent noncancerous tissues group, ??P<0.01.Figure 1 Expression of miR-219a-5p in gastric cancer tissues and adjacent tissues

注:A: MiR-219a-5p 上游區(qū)域的CpG 島; B: MiR-219a-5p 基因啟動子區(qū)域的甲基化情況;C: MGC-803 細胞經(jīng)5’ AZa-CDR 處理后miR-219a-5p 的表達情況。 DMSO:二甲基亞砜;AZA:5-氮雜-2-脫氧胞嘧啶(5’ AZa-CDR);TSA:組蛋白脫乙酰酶曲古抑菌素A;C:癌組織;N:癌旁組織;M:甲基化引物PCR 產(chǎn)物;U:未甲基化引物PCR 產(chǎn)物。 與DMSO 處理組相比, ?P<0.05。圖2 miR-219a-5p 的表達受甲基化表觀遺傳學(xué)調(diào)控Note.A, CpG island in the upstream region of miR-219a-5p.B, Methylation in the promoter region of miR-219a-5p gene.C, Expression of miR-219a-5p in MGC-803 cells treated with 5’ AZa-CDR.DMSO, Dimethyl sulfoxide.AZA, 5-aza-2-deoxycyfidine (5’ AZa-CDR).TSA, Histone deacetylase Trichostatin A.C, Cancer tissues.N, Adjacent noncancerous tissues.M, Methylated primer PCR product.U, Unmethylated primer PCR product.Compared with DMSO treatment group, ?P<0.05.Figure 2 Expression of miR-219a-5p is regulated by methylation epigenetics

2.4 過表達miR-219a-5p 抑制胃癌細胞MGC-803的增殖能力

通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染模擬體mimic 使MGC-803 細胞過表達成功,過表達組miR-219a-5p 表達水平升高近9583 倍,見圖3A。 CCK-8 結(jié)果顯示,與未處理組(un-treated) 和對照組(control-mimic)相比,過表達組(miR-219a-5p-mimic)的細胞增殖能力明顯受到抑制,72 h 時間點的CCK-8 檢測值(OD450和OD630)分別是(1.83±0.02)、(1.78±0.02)、(1.18±0.06),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(見圖3B)。

2.5 過表達miR-219a-5p 促進胃癌細胞MGC-803的凋亡

流式細胞儀結(jié)果顯示,與un-treated 組和controlmimic 組相比,miR-219a-5p 過表達組MGC-803 細胞的凋亡比例明顯增加,見圖4A 所示,control-mimic 組與miR-219a-5p 過表達組的早期凋亡比例分別是(26.6±0.94)%和(51.6±1.74)%,晚期凋亡比例分別是(11.3±1.21)%和(9.6±0.95)%,早期凋亡率明顯增高(P<0.05)。 Western blot 結(jié)果顯示,MGC-803 細胞轉(zhuǎn)染miR-219a-5p-mimic 48 h 后,凋亡相關(guān)蛋白caspase-3 的表達水平明顯比對照組的表達水平高,GAPDH 為內(nèi)參,見圖4B。

圖4 MiR-219a-5p 過表達后對MGC-803 細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of miR-219a-5p overexpression on MGC-803 cell apoptosis

2.6 過表達miR-219a-5p 抑制胃癌細胞MGC-803遷移和侵襲能力

圖5A、5B 所示,Transwell 小室遷移實驗結(jié)果顯示,過表達miR-219a-5p 組高倍鏡每視野平均穿膜細胞數(shù)明顯少于un-treated 組和control-mimic 組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) 。 圖5A、5C 所示,在有基質(zhì)膠的transwell 小室侵襲實驗發(fā)現(xiàn),miR-219a-5p 過表達組高倍鏡每視野平均穿膜細胞細胞數(shù)同樣明顯少于un-treated 組和control-mimic 組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 以上實驗表明,miR-219a-5p 能減弱胃癌細胞的遷移和侵襲能力。

注:A: MGC-803 細胞轉(zhuǎn)染mimic 后miR-219a-5p 過表達成功;B: miR-219a-5p 過表達后抑制MGC-803 細胞的增殖。 與對照組相比,???P <0.001。圖3 miR-219a-5p 過表達后對MGC-803 細胞增殖的影響Note.A, Overexpression of miR-219a-5p successfully transfected mimic into MGC-803 cells.B, Overexpression of miR-219a-5p inhibited the proliferation of MGC-803 cells.Compared with control-mimic group,???P <0.001.Figure 3 Effect of miR-219a-5p overexpression on the proliferation of MGC-803 cells

注:A: MiR-219a-5p 過表達后抑制MGC-803 細胞的遷移和侵襲;B: 3 組高倍鏡每視野平均穿膜細胞數(shù)。 與對照組相比, ?P<0.05。圖5 MiR-219a-5p 過表達后對MGC-803 細胞遷移和侵襲能力的影響Note.A, Overexpression of miR-219a-5p inhibited the migration and invasion ability of MGC-803 cells.B, The average number of transmembrane cells per field of view of the three groups of high magnification.Compared with control-mimic group, ?P<0.05.Figure 5 Effect of miR-219a-5p overexpression on the migration and invasion ability of MGC-803 cells

3 討論

胃癌患者發(fā)病一般無明顯癥狀,常與胃炎、胃潰瘍等胃慢性疾病癥狀相似,由于缺乏有效的早期診斷的腫瘤分子標(biāo)志物,大多數(shù)胃癌患者確診時已是進展期,而患者預(yù)后高度依賴腫瘤臨床分期,早期胃癌患者術(shù)后5 年生存率可達90%,而進展期胃癌的5 年生存率卻低于30%[8],可見胃癌的及時診斷和預(yù)后評估對于優(yōu)化治療策略至關(guān)重要,傳統(tǒng)的各種血清抗原標(biāo)志物如癌胚抗原(CEA)、糖類抗原19-9(CA19-9)、胃蛋白酶原(PG)等的檢測僅通常被用作表明癌癥風(fēng)險的特征[9-10]。 因此,尋找胃癌新的腫瘤分子標(biāo)志物是臨床對胃癌精準(zhǔn)診療的迫切需求。 miRNA 通過對靶mRNA 的降解或翻譯抑制,從而發(fā)揮其對靶基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用,在腫瘤進展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[11-12]。 Li 等[13]研究發(fā)現(xiàn)血清miR-17-92 能很好的區(qū)分早期胃癌患者和健康對照組,具有致癌潛力,其中miR-20a-5p 在診斷胃癌時受試者工作特征曲線下面積(AUC)較高,大于0.95,敏感性和特異性均大于90%,可見miRNA 可以很好的作為胃癌診斷的潛在分子標(biāo)志物。

在本研究中,通過實時熒光定量PCR 方法手段發(fā)現(xiàn)miR-219a-5p 在胃癌患者癌組織中呈現(xiàn)普遍低表達情況,本課題組下一步研究計劃就是收集胃癌患者血清標(biāo)本,檢測血清標(biāo)本中miR-219a-5p 的含量,分析是否能為篩選胃癌早期診斷標(biāo)志物提供參考價值。 為了探索miR-219a-5p 為什么會出現(xiàn)癌組織表達下調(diào),我們分析了miR-219a-5p 所跨越的基因組啟動子區(qū)域序列,利用MethPrimer 在線軟件(http:/ /www.urogene.org/methprimer/index1.html)我們發(fā)現(xiàn)存在CpG 島,miRNA 表達的失調(diào)是癌癥的發(fā)生、發(fā)展的重要特征,miRNA 的表達具有組織和時空特異性,并受到表觀遺傳機制調(diào)控,CpG 島的高甲基化具有沉默基因表達的作用[14]。 miR-320a在胃癌組織中受DNA 甲基化調(diào)控,在癌組織中表達普遍下調(diào),并可抑制腫瘤進展[15]。 我們的實驗結(jié)果也提示在胃癌組織中顯著低表達的miR-219a-5p 很可能受甲基化的表觀遺傳調(diào)控。 同時我們發(fā)現(xiàn)miR-219a-5p 的表達隨著腫瘤惡性程度的增加而降低,研究結(jié)果表明其表達的改變可能在胃癌的進展中扮演一定角色。

miRNA 在胃癌治療、監(jiān)測復(fù)發(fā)和判斷預(yù)后方面也有著廣闊的應(yīng)用前景,多項研究表明miRNA 與胃癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥等緊密相關(guān)[16-18]。 本研究利用模擬體miR-219a-5p-mimic,在胃癌細胞系MGC-803 中成功過表達miR-219a-5p 后,可明顯抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,并促進凋亡,這說明了miR-219a-5p 可能是胃癌發(fā)生發(fā)展過程中一種重要的抑癌miRNA,調(diào)控胃癌細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等生物特性過程,雖然具體機制還有待進一步研究,但為臨床治療胃癌提供了新的靶點。 Wang 等[17]報道m(xù)iR-454 在胃癌組織和細胞系中顯著下調(diào),miR-454的低表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和TNM 分期呈正相關(guān),并提出miR-454 可能負(fù)調(diào)控結(jié)合絲裂原活化蛋白激酶1 而在胃癌中發(fā)揮抑癌基因作用,抑制胃癌細胞的增殖和侵襲,誘導(dǎo)了細胞的凋亡。 由此可見,miRNA 作為基因的重要調(diào)控因子,可望成為胃癌精準(zhǔn)治療的最有前景的新靶點。

Ji 等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-374a-5p 在胃癌患者血清中明顯高表達且與患者進展及預(yù)后不良相關(guān),且裝載了miR-374a-5p 抑制劑的外泌體能夠逆轉(zhuǎn)奧沙利鉑體內(nèi)外抗性,顯著抑制腫瘤的生長,這些發(fā)現(xiàn)提示,體外抗miR-374a-5p 可能是一種潛在的胃癌耐藥治療方法,也說明利用外泌體的轉(zhuǎn)運功能以及較好生物相容性的特性在治療腫瘤中顯示出優(yōu)勢,這將為miRNA 靶向治療開拓一片廣闊領(lǐng)域。 如果將目的miRNA 裝載至外泌體過表達抑癌基因,其抑制腫瘤活性的效果可能將更明顯[19]。